TCS-PIM-1-4a (SMI-4a)

PIM1/2
Pim-1 protein kinase (competitive with ATP). IC50 = 17 ± 7 nM (using peptide substrate RSRHSSYPAGT corresponding to Bad amino acids 107-117). [1]
Pim-2 (inhibits). [1] (reference 20 indicates dual inhibition)
Also shows weak inhibition of DYRK1a (only 16a, not 4a). [1]

SMI-4a 是一种新型的亚苄基噻唑烷-2,4-二酮类小分子，是 Pim1 的强效选择性抑制剂，IC50 值为 17 nM。它对 Pim-2 的抑制作用较弱，且对其他丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸激酶的抑制作用不显著。SMI-4a 可抑制前体 T 细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤的生长。研究发现，SMI-4a 可诱导细胞外信号调节激酶 1/2 (ERK1/2) 的磷酸化。丝氨酸/苏氨酸 Pim 激酶在特定的血液肿瘤中表达上调，并在关键的信号转导通路中发挥重要作用，包括由 MYC、MYCN、FLT3-ITD、BCR-ABL、HOXA9 和 EWS 融合基因调控的通路。 SMI-4a 可杀伤多种髓系和淋巴系细胞，其中前体 T 细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤 (pre-T-LBL/T-ALL) 对其高度敏感。用 SMI-4a 处理 pre-T-LBL 细胞可诱导 G1 期细胞周期阻滞，这继发于 p27(Kip1) 的剂量依赖性诱导、线粒体途径的细胞凋亡以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 C1 (mTORC1) 通路的抑制（基于该酶的两个底物——磷酸化 p70 S6K 和磷酸化 4E-BP1 的减少）。此外，用SMI-4a处理这些细胞可诱导细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2) 的磷酸化，并且SMI-4a与丝裂原活化蛋白激酶激酶1/2 (MEK1/2) 抑制剂联用对杀伤前T淋巴母细胞淋巴瘤(pre-T-LBL)细胞具有高度协同作用。在携带皮下pre-T-LBL肿瘤的免疫缺陷小鼠中，每日两次使用SMI-4a治疗可显著延缓肿瘤生长，且不影响小鼠的体重、血细胞计数或生化指标。这些数据表明，抑制Pim蛋白激酶可能成为治疗pre-T-LBL的一种潜在治疗策略。SMI-4a是Pim1的ATP竞争性抑制剂，IC50为17 nM。SMI-4a对Pim1具有高度选择性，而对多种激酶则无明显抑制作用。 SMI-4a 可抑制 Pim-1 对已知底物（翻译抑制因子 4E-BP1）的体外磷酸化。SMI-4a (5μM) 可抑制胰腺癌细胞和白血病细胞的生长。SMI-4a 可降低前列腺癌细胞和造血细胞中 Pim 靶蛋白 Bad 的磷酸化水平。SMI-4a 可导致细胞周期阻滞并逆转 Pim-1 的抗凋亡活性。SMI-4a 可增加细胞核内 p27Kip1 的含量。SMI-4a 处理前 T 淋巴母细胞淋巴瘤 (pre-T-LBL) 可抑制 mTOR 通路。SMI-4a 可降低前 T 淋巴母细胞淋巴瘤中 MYC 蛋白的表达。 SMI-4a 处理诱导 MAPK 通路上调

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激酶活性测定：SMI-4a 是一种选择性 ATP 竞争性 Pim-1 激酶抑制剂，对 Pim-1 的 IC50 为 21 nM，而对 Pim-2 的 IC50 为 100 nM，对其他 50 种激酶几乎没有活性。

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细胞实验：将 6812/2 细胞在无血清培养基中与 SMI-4a (10μM) 或二甲基亚砜 (DMSO) 孵育 24 小时，将 Jurkat 细胞在无血清培养基中与 SMI-4a (10μM) 或二甲基亚砜 (DMSO) 孵育 48 小时。孵育后，收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，用冰冷的70%乙醇固定45分钟，用含有RNaseA的碘化丙啶溶液染色30分钟，并通过流式细胞术进行分析。

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在K562人红白血病细胞中，用SMI-4a（5 μM，在无血清培养基中处理1小时）处理可诱导AMPK活化，表现为AMPKα在Thr172位点的磷酸化增加，以及AMPK靶标乙酰辅酶A羧化酶（ACC）在Ser79位点和raptor在Ser792位点的磷酸化增加。同时，SMI-4a抑制了mTORC1的活性，表现为mTORC1靶点S6K和4EBP1磷酸化水平的降低。[1]
在一系列肺癌细胞系（H358、H661、H23、H460、A549）和K562细胞中，用SMI-4a（5 μM，1小时）处理仅在含有LKB1的细胞（H358、H661、K562）中刺激了AMPK的磷酸化，而在LKB1缺陷的细胞（H23、H460、A549）中则没有刺激，表明SMI-4a需要LKB1才能激活AMPK。[1]

每日两次口服SMI-4a（60 mg/kg）可显著缩小肿瘤体积，且耐受性良好。在最后一次口服SMI-4a后1小时采集的肿瘤样本显示，与载体对照组小鼠的肿瘤相比，p70 S6K的磷酸化水平降低，而总p70 S6K表达水平则无变化。
在以6812/2小鼠前T细胞淋巴母细胞瘤细胞为模型的皮下异种移植瘤模型中，每日两次口服SMI-4a（60 mg/kg，每周5天，持续21天）可显著减缓肿瘤生长，与载体对照组相比差异显著（P<0.05）。每日一次给药未观察到显著疗效。 [1]
最后一次灌胃给药后 1 小时采集的肿瘤组织显示，磷酸化 p70 S6K 水平降低，磷酸化 ERK1/2 水平升高，MYC 蛋白水平降低（降至对照组的 81.3±12.1%，P<0.05）。末次给药后 60 小时，这些生化效应消失。[1]

为了确保化合物的作用并非由任何实验误差引起，我们采用多种方法进行了Pim蛋白激酶活性测定。表3所示化合物的初步筛选和评估采用ATP耗竭法。简而言之，将重组人Pim-1蛋白与S6激酶/Rsk-2肽2（KKRNRTLTK）作为底物，在100 µM筛选库化合物、1 µM ATP和10 mM MgCl₂存在下孵育1小时。激酶反应结束后，使用Kinase-Glo荧光素酶试剂盒测定残余ATP水平。对于需要更高ATP浓度的实验，我们采用偶联法分光光度法监测Pim-1激酶活性。该方法将ADP的生成与丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶催化的NADH氧化偶联。实验在含有 100 mM NaCl、10 mM MgCl₂、2.5 mM 磷酸烯醇式丙酮酸、0.2 mM NADH、30 µg/mL 丙酮酸激酶、10 µg/mL 乳酸脱氢酶、2 mM 二硫苏糖醇、25 nM Pim-1、100 µM S61 肽以及不同浓度 ATP 的 20 mM MOPS 缓冲液（pH 7）中进行。活性测定通过在 VersaMax 微孔板读数仪（Molecular Devices）上于 25 °C 下监测 340 nm 处吸光度的降低来反映 NADH 的氧化。反应通过加入 ATP（通常为 100 µM）启动。抑制剂（终浓度为 1% DMSO）在加入 ATP 之前加入。无论哪种情况，IC₅₀ 值均使用 GraphPad Prism 软件进行非线性回归分析确定。在一些实验中，使用His标签的4E-BP1作为底物测定Pim-1激酶活性。将活性Pim-1蛋白重悬于激酶反应缓冲液（10 mM MOPS，pH 7.4，100 µM ATP，15 mM MgCl2，1 mM Na3VO4，1 mM NaF，1 mM DTT和蛋白酶抑制剂混合物）中。在每个反应体系（30 µL）中，使用3 µg His-4E-BP1蛋白作为底物，然后加入10 μCi [γ-32P] ATP。在30 °C下振荡孵育30分钟。然后将样品进行SDS-PAGE电泳，并通过放射自显影法显影32P标记的4E-BP1。最后，在一些实验中测定了完整细胞中的Pim-1活性。 HEK-293T细胞用Flag-Pim-1转染24小时后，用胰蛋白酶消化并分装至小培养皿中过夜。细胞洗涤一次后，在含10%无磷酸盐胎牛血清（FBS）的无磷酸盐培养基中孵育1小时。随后，将细胞置于含50 μCi/ml [32P]正磷酸盐的培养基中孵育4小时，并在最后1小时加入待测化合物。为免疫沉淀Pim-1，将抗Flag M2琼脂糖加入细胞裂解液中，孵育3小时。取10%的免疫沉淀物进行Western blotting分析，使用抗Flag抗体（输入）。每份样品的剩余90%进行SDS-PAGE电泳，并用放射自显影法显影³²P标记的Pim-1。

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偶联激酶活性测定法用于IC₅₀的测定：在含有100 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl₂、2.5 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸、0.2 mmol/L NADH、30 μg/mL丙酮酸激酶、10 μg/mL乳酸脱氢酶、2 mmol/L DTT和25 nmol/L Pim-1的20 mmol/L MOPS缓冲液（pH 7）中进行测定，并加入100 μmol/L肽底物（RSRHSSYPAGT）。通过监测340 nm处吸光度的降低来测定NADH的氧化活性。反应通过加入ATP（100 μmol/L）启动。IC₅₀值通过非线性回归确定。 [1]
全长蛋白底物的体外磷酸化：将纯化的 Pim-1 (1 ng) 与 4E-BP1 (2 μg) 或 p27Kip1 (2 μg) 以及抑制剂加入到测定缓冲液 [20 mmol/L MOPS (pH 7)、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L DTT] 中。加入 ATP (100 μmol/L) 和 [γ-32P]ATP (10 μCi) 启动反应。反应在 30°C 下进行 15 分钟，然后通过 SDS-PAGE 分离。通过放射自显影法显影 32P 磷酸化的底物，并通过密度扫描法进行定量。[1]

生化分析。根据制造商的方案，使用 Lipofectamine™ 2000 将 K562 细胞转染 scrambled siRNA 或 siPim-1（ON-TARGETplus SMARTpool），并在转染后 48 小时制备细胞裂解液。采用 MTT 法检测细胞生长。ATP、ADP 和 AMP 的含量采用高效液相色谱法 (HPLC) 测定（方法如前所述），ATP 含量也使用 ATP 生物发光检测试剂盒 HS II（10⁵ 个细胞）进行测定。从野生型 (WT) 和三敲除型 (TKO) MEF 细胞裂解液中捕获 eIF4E，并用 m7-GTP 琼脂糖凝胶法检测其与 4EBP1 和 eIF4G 的结合情况。[1]

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在 K562 人红白血病细胞中，使用浓度为 5 μM 的 SMI-4a 在无血清培养基中处理 1 小时。以 DMSO 处理细胞作为对照。处理后，制备细胞裂解液，并通过 Western 印迹分析 AMPKα、ACC、raptor、S6K 和 4EBP1 的磷酸化水平和总蛋白水平。[1]
对于 siRNA 实验，使用脂质体转染试剂将 K562 细胞转染对照 siRNA 或 Pim-1 siRNA。48 小时后，检测裂解液中 AMPK 的磷酸化水平。[1]

溶于 65% DMSO、30% PEG-400 和 5% Tween-80 的混合溶液中；剂量为 75 或 60 mg/kg；口服给药。将 pre-T-LBL 细胞注射到 Nu/nu 裸鼠体内。

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在细胞培养实验中，K562 细胞在无血清培养基中用 5 μM 的 SMI-4a 处理 1 小时。在肺癌细胞系实验中，细胞在无血清培养基中用 DMSO、SMI-4a (5 μM) 或 SMI-16a（另一种 Pim 抑制剂，5 μM）处理 1 小时，然后制备细胞裂解液进行蛋白质印迹分析。[1]

WT-FVB 小鼠口服药代动力学：灌胃 60 mg/kg 后，1 小时血浆 Cmax 约为 200 μM；t1/2 ≈ 6 小时；24 小时内消除。每日两次给药，连续 5 天，未见蓄积。[1]

小鼠接受 60 mg/kg SMI-4a（每日两次）治疗 21 天后，未观察到明显不良反应：体重无下降（补充图 3B）；白细胞计数、血红蛋白和血小板计数与对照组相比无变化；血涂片未见形态学异常。血液生化指标：丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、总蛋白、碱性磷酸酶、淀粉酶和总胆红素均正常，表明无肝毒性、肾功能或胰腺功能障碍。[1] 注：噻唑烷二酮类化合物在其他研究中与肝毒性相关（参考文献 37），但本研究中未观察到此类毒性。[1]

Proc Natl Acad Sci U S A.2011 Jan 11;108(2):528-33.;Mol Cancer Ther.2009 Jun;8(6):1473-83;Blood.2010 Jan 28;115(4):824-33.

丝氨酸/苏氨酸Pim激酶在实体瘤和血液系统恶性肿瘤中过度表达，促进细胞生长和存活。本研究发现，一种新型Pim激酶抑制剂SMI-4a或Pim-1 siRNA可通过刺激AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）的磷酸化来激活mTORC1，AMPK是mTORC1的负调控因子，从而阻断雷帕霉素敏感的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTORC1）的活性。敲除所有三种Pim激酶的小鼠胚胎成纤维细胞（三重敲除（TKO）MEF）由于其AMP/ATP比值高于野生型MEF，表现出AMPK激活。与这些发现一致，TKO MEF在体外生长缓慢，并且由于5'端帽依赖性翻译减少，蛋白质合成速率降低。在TKO MEF细胞中单独表达Pim-3足以逆转AMPK的激活，增加蛋白质合成，并促进MEF细胞生长，使其更接近野生型。研究表明，Pim-3的表达显著提高c-Myc和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α (PGC-1α)的蛋白水平，这两种酶分别调节糖酵解和线粒体生物合成，而它们在TKO MEF细胞中的表达水平降低。在TKO MEF细胞中过表达PGC-1α可提高ATP水平并抑制AMPK的激活。这些结果表明，Pim激酶介导能量代谢的调节，从而调节AMPK的活性。我们发现Pim-3在调节c-Myc和PGC-1α蛋白水平以及细胞生长中发挥重要作用。[1]

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SMI-4a是一种亚苄基噻唑烷-2,4-二酮衍生物，可抑制Pim激酶的活性。本文引用的先前研究表明，SMI-4a 可诱导人白血病细胞凋亡，并与雷帕霉素协同作用，下调 4EBP1 磷酸化并抑制细胞生长。在本研究中，SMI-4a 被用作工具，以证明 Pim 激酶抑制以 LKB1 依赖的方式激活 AMPK，从而导致 mTORC1 活性降低和帽依赖性翻译减少。本文未对该化合物进行体内评估。[1]

C11H6F3NO2S

273.23

273.007

C, 48.36; H, 2.21; F, 20.86; N, 5.13; O, 11.71; S, 11.73

327033-36-3

1361334

Typically exists as solid at room temperature

1.5±0.1 g/cm3

1.602

2.3

71.47

1

6

1

18

406

0

O=C(NC/1=O)SC1=C\C2=CC=CC(C(F)(F)F)=C2

NGJLOFCOEOHFKQ-VMPITWQZSA-N

InChI=1S/C11H6F3NO2S/c12-11(13,14)7-3-1-2-6(4-7)5-8-9(16)15-10(17)18-8/h1-5H,(H,15,16,17)/b8-5+

(5E)-5-[[3-(trifluoromethyl)phenyl]methylidene]-1,3-thiazolidine-2,4-dione

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。