Fluorescent dye

使用1-NBDG作为荧光葡萄糖类似物，在用稳定表达hSGLT2的pcDNAhSGLT1和CHO–K1细胞瞬时转染的COS-7细胞中进行葡萄糖摄取测定，分别用于筛选SGLT1抑制剂和SGLT2抑制剂。在这里，我们证明了使用pcDNAhSGLT2瞬时转染的COS-7细胞（hSGLT2/COS-7）来筛选SGLT2抑制剂也是可行的。该方法也从24孔格式扩展到适合高通量筛选的96孔格式。将使用1-NBDG的验证方法应用于测试樟科约60种植物的195种粗甲醇提取物，以寻找新的天然SGLT抑制剂，并从大桂皮的叶子中鉴定出两种有效的天然SGLT1和SGLT2抑制剂（Yang等人，制备中的手稿）。这两种化合物（I和II）的IC50值在纳摩尔范围内，与根皮苷相当，根皮苷是最有效的天然SGLT抑制剂，在我们的测定系统中，SGLT1和SGLT2的IC50分别为110±10.2 nM和9.65±1.83 nM。

葡萄糖是细胞的重要能量来源。葡萄糖转运由两种类型的葡萄糖转运蛋白介导：活性钠偶联葡萄糖协同转运蛋白（SGLTs）和被动葡萄糖转运蛋白（GLUTs）。开发一种简单的方法来检测细胞对葡萄糖的吸收，这对研究很有价值。1-（N-（7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）氨基）-1-脱氧-d-葡萄糖（1-NBDG）是一种新合成的荧光葡萄糖类似物。2-NBDG是GLUT但不是SGLT的良好底物，与此不同，1-NBDG可以通过GLUT和SGLT运输。因此，1-NBDG可用于筛选SGLT1和SGLT2抑制剂。在这里，我们进一步表征了1-NBDG，并将其与2-NBDG进行了比较。1-NBDG和2-NBDG的荧光在碱性条件下都被猝灭，但在中和后只能恢复1-NBDG荧光。HPLC分析显示，2-NBDG被分解导致荧光损失，而1-NBDG在NaOH溶液中保持完整。因此，在细胞摄取后，可以简单地通过在NaOH溶液中的细胞裂解，然后用HCl溶液中和，在平板读取器上检测1-NBDG荧光。一旦细胞裂解，1-NBDG的荧光稳定性稳定达5小时；然而，与2-NBDG类似，细胞内1-NBDG不稳定，并且荧光在一小时内显著减弱。还可以在单细胞水平上检测1-NBDG摄取，并且可以通过流式细胞术检测SGLT抑制剂对1-NBDG摄入的抑制。此外，1-NBDG成功地用于基于高通量细胞的方法来筛选潜在的SGLT1和SGLT2抑制剂。对从植物中纯化的67种黄酮类化合物和黄酮苷的SGLT抑制活性进行了评估，并鉴定了几种选择性SGLT1、选择性SGLT2以及双SGLT1/2抑制剂。结构-活性关系分析表明，糖苷基残基是至关重要的，因为糖苷配基没有显示出SGLT抑制活性。此外，糖的相互连接及其对苷元的取代位置不仅影响抑制活性，还影响对SGLT1和SGLT2的选择性。[1]

1-NBDG和2-NBDG在碱性、酸性条件下或不同pH下的稳定性测定。[1]
将1-NBDG或2-NBDG在pH值为6.8、7.5、8.0、8.8和9.8的0.2N NaOH、0.2N HCl或20mM Tris缓冲液中稀释。使用SpectraMax Paradigm多模微孔板读取器（Molecular Devices）在黑色96孔板中检测荧光，1-NBDG的激发波长为458nm，发射波长为528nm（458/528nm），2-NBDG的发射波长为475/550nm

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HPLC分析[1]
Mightysil RP-18GP柱用于HPLC分析，流动相为水和乙腈的梯度，从4分钟的100%水到30分钟的100%乙腈，流速为1mL/min。注入10微升样品，并通过UV/Vis检测器（设定在475nm）进行检测

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1-NBDG和2-NBDG细胞内稳定性的测定[1]
将SCC131细胞以1×105个细胞/孔接种到24孔板中，并在第二天进行葡萄糖摄取测定。用500μL温胆碱缓冲液冲洗细胞两次，然后用200μL 160μM 1-NBDG或2-NBDG在钠缓冲液中孵育2小时。然后用温胆碱缓冲溶液洗涤细胞两次、在CO2培养箱中于37°C的500μL PBS中保持0-5小时，并在600μL中性缓冲液中裂解，该缓冲液含有1%脱氧胆酸钠、1%NP-40、40mM KCl和20mM Tris–HCl，pH 7.5。将100微升等分的细胞裂解物转移到黑色96孔板上，用于检测荧光强度。

使用1-NBDG的SGLT1和SGLT2抑制剂的基于细胞的筛选方法[1] 如前所述，用pcDNAhSGLT1或pcDNAhSG LT2转染COS-7细胞，并在第二天以3-5×104个细胞/孔的速度接种到96个孔中。让细胞附着过夜并达到100%汇合，然后在含有测试化合物和100或160μM 1-NBDG的钠缓冲液中在37°C下进行葡萄糖摄取测定1.5小时（SGLT1）或2小时（SGLTE2）。用150μL温胆碱缓冲液冲洗96孔中的细胞，然后用50μL含有1-NBDG和测试化合物的钠缓冲液孵育。孵育后，用冷胆碱缓冲液洗涤细胞两次，在显微镜下检查细胞条件，然后在75μL 0.2 N NaOH中裂解，并用75μL 0.2N HCl中和。将裂解物（100μL）转移到黑色96孔板中进行荧光检测。Phlorizin用作SGLT抑制剂的阳性对照，胆碱缓冲液中的1-NBDG用于通过GLUT测量钠非依赖性葡萄糖摄取。使用不含1-NBDG的钠缓冲液中的细胞来测量自发荧光（细胞背景）。

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流式细胞术检测葡萄糖摄取[1]
用1 mL温胆碱缓冲液冲洗6孔板中指数生长的细胞两次，然后在37°C下与500μL的100μM 1-NBDG或2-NBDG在钠缓冲液或胆碱缓冲液中孵育30分钟。然后用温热的胆碱缓冲液洗涤细胞3次，并通过胰蛋白酶消化收获细胞。离心后，将细胞重悬于冷PBS中，并通过FACSCalibur进行流式细胞术分析，FL1通道的激发波长为488nm。Phlorizin用于抑制葡萄糖通过hSGLT1的转运。流动软件2用于定量分析。

[1]. Characterization of a fluorescent glucose derivative 1-NBDG and its application in the identification of natural SGLT1/2 inhibitors. J Food Drug Anal. 2021; 29(3): 521–532.
[2]. Development of a novel non-radioactive cell-based method for the screening of SGLT1 and SGLT2 inhibitors using 1-NBDG. Mol Biosyst. 2013 Aug;9(8):2010-20. doi: 10.1039/c3mb70060g.

Glucose is an important energy source for cells. Glucose transport is mediated by two types of glucose transporters: the active sodium-coupled glucose cotransporters (SGLTs), and the passive glucose transporters (GLUTs). Development of an easy way to detect glucose uptake by the cell can be valuable for research. 1-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino)-1-deoxy-d-glucose (1-NBDG) is a newly synthesized fluorescent glucose analogue. Unlike 2-NBDG, which is a good substrate of GLUTs but not SGLTs, 1-NBDG can be transported by both GLUTs and SGLTs. Thus, 1-NBDG is useful for the screening of SGLT1 and SGLT2 inhibitors. Here we further characterized 1-NBDG and compared it with 2-NBDG. The fluorescence of both 1-NBDG and 2-NBDG was quenched under alkaline conditions, but only 1-NBDG fluorescence could be restored upon neutralization. HPLC analysis revealed that 2-NBDG was decomposed leading to loss of fluorescence, whereas 1-NBDG remained intact in a NaOH solution. Thus, after cellular uptake, 1-NBDG fluorescence can be detected on a plate reader simply by cell lysis in a NaOH solution followed by neutralization with an HCl solution. The fluorescence stability of 1-NBDG was stable for up to 5 h once cells were lysed; however, similar to 2-NBDG, intracellular 1-NBDG was not stable and the fluorescence diminished substantially within one hour. 1-NBDG uptake could also be detected at the single cell level and inhibition of 1-NBDG uptake by SGLT inhibitors could be detected by flow cytometry. Furthermore, 1-NBDG was successfully used in a high-throughput cell-based method to screen for potential SGLT1 and SGLT2 inhibitors. The SGLT inhibitory activities of 67 flavonoids and flavonoid glycosides purified from plants were evaluated and several selective SGLT1, selective SGLT2, as well as dual SGLT1/2 inhibitors were identified. Structure-activity relationship analysis revealed that glycosyl residues were crucial since the aglycon showed no SGLT inhibitory activities. In addition, the sugar inter-linkage and their substitution positions to the aglycon affected not only the inhibitory activities but also the selectivity toward SGLT1 and SGLT2.[1]

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342.0812

C, 42.11; H, 4.12; N, 16.37; O, 37.40

2376921-70-7

186689-07-6 (2-NBDG)

Typically exists as solids at room temperature

-1.1

187Ų

ZXXYZPVBLJMGPU-UJDFUTJXSA-N

InChI=1S/C12H14N4O8/c17-3-6-9(18)10(19)11(20)12(23-6)13-4-1-2-5(16(21)22)8-7(4)14-24-15-8/h1-2,6,9-13,17-20H,3H2/t6-,9-,10+,11-,12-/m1/s1

(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(hydroxymethyl)-6-[(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-7-yl)amino]oxane-3,4,5-triol

1-NBDG; 1NBDG; 1 NBDG; EX-A4323A; (2R,3S,4S,5R,6R)-2-(Hydroxymethyl)-6-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)amino)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol; 2376921-70-7; 1-NBDG; EX-A4323A; (2R,3S,4S,5R,6R)-2-(Hydroxymethyl)-6-((7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)amino)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。