20(R)-Ginsenoside Rh2   中文名称: 人参皂苷 R-Rh2

抗炎活性：在LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞中，20(R)-人参皂苷Rh2抑制NO的产生。用10、30和50 μM的20(R)-人参皂苷Rh2预处理后，亚硝酸盐水平分别降低至仅用LPS处理的细胞的97%、86%和55%，IC50 > 50.0 μM。[1]
抗炎活性：在LPS刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞中，20(R)-人参皂苷Rh2抑制PGE2的产生。在 50 μM 浓度下，LPS 增强的 PGE2 水平明显降低。[1]
抗氧化活性：在 LPS 刺激的 RAW264.7 小鼠巨噬细胞中，20(R)-人参皂苷 Rh2 降低了细胞内 ROS 水平。用 10、30 和 50 μM 的 20(R)-人参皂苷 Rh2 预处理后，ROS 水平分别降低至仅用 LPS 处理的细胞的 98%、96% 和 33%，IC50 为 34.8 μM。[1]
抗氧化活性：在未刺激的人类 HaCat 角质形成细胞中，20(R)-人参皂苷 Rh2 降低了细胞内 ROS 水平，尤其是在 5 和 25 μM 浓度下。在 25 μM 浓度下，ROS 水平降至未处理对照细胞的 77%。[1]
MMP 抑制活性：在 LPS 刺激的 RAW264.7 小鼠巨噬细胞中，20(R)-人参皂苷 Rh2（10、30、50 μM）以浓度依赖的方式抑制了 pro-MMP-9 增强的明胶酶活性，但并不调节 MMP-2 的活性。[1]
MMP 抑制活性：在未刺激的人类 HaCat 角质形成细胞中，20(R)-人参皂苷 Rh2（0.2、1、5、25 μM）抑制了 MMP-9 和 MMP-2 的明胶酶活性，在 25 μM 浓度下对 MMP-9 的抑制作用尤为显著，但对 MMP-1 的抑制作用不明显。活性。[1]
MMP抑制活性：在TNF-α刺激的人类HaCat角质形成细胞中，20(R)-人参皂苷Rh2抑制了TNF-α诱导的MMP-9明胶酶活性的增加。[1]

抗增殖活性：通过MTT法评估，20(R)-人参皂苷Rh2对多种癌细胞系表现出细胞毒性，对HL-60人白血病细胞的IC50值为38.5 ± 2.4 μM，对U937细胞的IC50值为41.2 ± 1.5 μM，对P388小鼠淋巴母细胞的IC50值为49.6 ± 2.7 μM，对A549人肺腺癌细胞的IC50值为59.6 ± 3.2 μM，对HeLa人宫颈癌细胞的IC50值>200 μM。对HepG2人肝母细胞瘤细胞的抑制浓度>100 μM，对A431人表皮样癌细胞的抑制浓度为59.6 ± 3.2 μM。[2]
生长抑制：台盼蓝排除法显示，20(R)-人参皂苷Rh2（10-40 μM）在96小时内以时间和浓度依赖的方式抑制HL-60和U937细胞的生长。20 μM时表现出细胞抑制作用，而30和40 μM时则表现出细胞毒性作用。[2]
细胞周期阻滞：流式细胞术分析显示，20(R)-人参皂苷Rh2（20 μM）处理HL-60和U937细胞后，G1期细胞比例呈时间依赖性增加。用 20 μM Rh2 处理 96 小时后，HL-60 细胞中 G1 期细胞比例从 48.1%（对照组）增加到 67.7%，U937 细胞中 G1 期细胞比例从 45.6% 增加到 64.8%，同时 S 期细胞比例下降。[2]
细胞周期相关蛋白的表达：蛋白质印迹分析显示，20(R)-人参皂苷 Rh2 (20 μM) 处理可随时间推移上调 HL-60 和 U937 细胞中 p21^CIP1/WAF1 和 p27^KIP1 的蛋白和 mRNA 水平，同时下调 CDK4、CDK6、细胞周期蛋白 D1、细胞周期蛋白 D2、细胞周期蛋白 D3 和细胞周期蛋白 E 的蛋白水平； CDK2 水平保持不变。[2]
CDK 与 CDKI 的结合：免疫沉淀实验表明，用 20(R)-人参皂苷 Rh2 (20 μM) 处理 96 小时后，HL-60 细胞中 p21^CIP1/WAF1 和 p27^KIP1 与 CDK2、CDK4 和 CDK6 的结合显著增强。[2]
CDK 激酶活性：激酶活性测定显示，用 20(R)-人参皂苷 Rh2 (20 μM) 处理 96 小时后，HL-60 细胞中 CDK2、CDK4 和 CDK6 相关激酶活性显著降低（以组蛋白 H1 为 CDK2 的底物，以 GST-Rb 融合蛋白为 CDK4/6 的底物）。[2]
Rb磷酸化和E2F1转位：Western blot结果显示，20(R)-人参皂苷Rh2 (20 μM)处理可降低HL-60细胞中Rb蛋白的磷酸化水平，并减少E2F1的核内表达。[2]
分化诱导：NBT还原实验表明，20(R)-人参皂苷Rh2 (20 μM)处理96小时后，约54.5%的HL-60细胞被染色（对照组为6.7%），而维生素D3 (20 nM)处理组的染色率为46.2%。酯酶活性测定显示，AS-D氯乙酸酯酶活性增加了22.8%，α-萘乙酸酯酶活性增加了31.1%。吞噬活性增强，表现为乳胶颗粒摄取量的增加。流式细胞术显示表面抗原CD11b、CD14、CD64和CD66b显著上调，表明细胞向单核细胞/巨噬细胞和粒细胞谱系分化。[2]
TGF-β1产生：培养上清液的ELISA检测显示，20(R)-人参皂苷Rh2 (20 μM) 可随时间推移增加HL-60细胞中TGF-β1的产生。实时PCR证实TGF-β1 mRNA表达上调。[2]
TGF-β1中和抗体的逆转作用：与TGF-β1中和抗体共同处理可逆转Rh2诱导的CDK4/6下调、p21/p27上调以及分化效应，表明Rh2的作用依赖于TGF-β1信号通路。[2]

MMP活性酶谱分析：为测定MMP-1、-2和-9的明胶酶活性，收集培养上清液。将样品在含1 mg/ml明胶的8% SDS-PAGE凝胶上进行电泳，电泳条件为非还原性。电泳后，对凝胶中的蛋白质进行复性，然后进行染色和脱色。凝胶用0.1%考马斯亮蓝R-250溶液染色，明胶降解酶在蓝色背景上呈现为透明区域。 MMP-1、-2 和 -9 活性条带的鉴定基于使用分子量标记物估算的分子量。[1]
CDK 激酶活性测定步骤：收集经 20(R)-人参皂苷 Rh2 处理或未处理的 HL-60 细胞，并制备总裂解液（500 μg 蛋白）。使用抗 CDK2、抗 CDK4 或抗 CDK6 多克隆抗体进行免疫沉淀，然后在 4°C 下与 Protein A-Sepharose CL-4B 珠孵育 18 小时。免疫复合物用裂解缓冲液洗涤三次，再用激酶测定缓冲液洗涤一次。激酶反应在含有 [γ-³²P]ATP 的激酶缓冲液中进行，以组蛋白 H1（用于 CDK2）或 GST-Rb 融合蛋白（用于 CDK4 和 CDK6）为底物。在 30°C 下孵育 30 分钟后，通过 SDS-PAGE 分离反应物，并通过放射自显影检测磷酸化底物。[2]

细胞培养和处理：人HaCat角质形成细胞和鼠RAW264.7巨噬细胞在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃、5% CO₂的湿润环境中培养。对于RAW264.7细胞，培养基中添加了25 mM HEPES（pH 7.5）。[1]
巨噬细胞实验步骤：将RAW264.7细胞（5.0 × 10⁵）接种于6孔板中，培养24小时。然后用0、10、30或50 μM的20(R)-人参皂苷Rh2（溶于DMSO）预孵育1小时。用 1 μg/ml LPS 处理后，细胞继续培养 24 小时后进行分析。[1]
角质形成细胞实验步骤：将 HaCat 细胞 (1.0 × 10⁵) 接种于 6 孔板中，培养 24 小时。然后用 0、0.2、1、5 或 25 μM 的 20(R)-人参皂苷 Rh2 在无血清培养基中处理细胞，并继续培养 24 小时。对于 TNF-α 刺激，在 20(R)-人参皂苷 Rh2 处理 1 小时后，用 10 ng/ml TNF-α 处理细胞。[1]
亚硝酸盐测定步骤：使用基于 Griess 反应的比色法测定培养上清液中由细胞释放的 NO 生成的亚硝酸盐 (NO₂⁻) 的积累量。使用已知浓度（0-160 μM）的亚硝酸钠构建标准曲线。[1]
PGE2 测定方法：使用商业化的 EIA 试剂盒，按照制造商的说明测定培养上清液中的 PGE2。所有实验均重复三次。[1]
细胞内 ROS 测定方法：使用氧化还原敏感荧光探针 DCFH-DA 分析细胞内 ROS。将 RAW264.7 细胞（3 × 10⁵）与不同浓度的 20(R)-人参皂苷 Rh2 预孵育 1 小时，然后用 LPS 处理 24 小时。之后，将细胞与 5 μM DCFH-DA 在 37°C 下孵育 30 分钟，然后收集细胞。立即通过流式细胞术分析细胞内 ROS 水平。[1]
细胞活力检测方法：采用 MTT 法定量细胞活力。用胰蛋白酶消化的细胞与 20 μl 浓度为 5 mg/ml 的 MTT 溶液孵育 2 小时。然后用异丙醇裂解细胞，并通过在 540 nm 处测定吸光度来测定活细胞线粒体还原 MTT 生成的甲臜的量。[1]
细胞培养和药物处理：HL-60（人早幼粒细胞白血病）、U937（人组织细胞淋巴瘤）和其他细胞系在添加了 10% FBS、青霉素 (100 U/ml) 和链霉素 (100 μg/ml) 的 RPMI 1640 或 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO₂ 条件下培养。将20(R)-人参皂苷Rh2溶解于DMSO中（终浓度≤0.05%），并以指定浓度（例如，10、20、30、40 μM）加入细胞中，孵育不同时间（24-96 h）。[2]
MTT细胞毒性试验：将细胞（5×10⁴个细胞/ml）接种于96孔板中，孵育24 h后，用不同浓度的20(R)-人参皂苷Rh2处理。96 h后，加入50 μl MTT（5 mg/ml），继续孵育4 h。弃去培养基，将甲臜晶体溶解于 100 μl DMSO 中，并在 540 nm 处测量吸光度以计算 IC50。[2]
台盼蓝排除法：将细胞（2×10⁵ 个细胞/ml）用 20(R)-人参皂苷 Rh2 处理 24-96 小时。将细胞悬液与台盼蓝混合，并使用血细胞计数器计数活细胞（不包括染料）。[2]
细胞周期分析：将处理后的细胞在 4°C 下用 70% 冷乙醇固定 1 小时，用 PBS 洗涤，并重悬于含有 2.5 μg/ml RNase 和 50 μg/ml 碘化丙啶的 PBS 中。在室温下避光孵育 30 分钟后，使用 Cell Quest 软件通过流式细胞术分析 DNA 含量（采集 10,000 个事件）。[2]
蛋白质印迹：将细胞在裂解缓冲液中裂解，以获得总蛋白或核提取物（通过低渗缓冲液裂解分离细胞核，并用高盐缓冲液提取）。等量的蛋白质经 SDS-PAGE 分离后，转移至 PVDF 膜上，封闭 1 小时，与一抗（1:1000）于 4°C 孵育过夜，洗涤后，与 HRP 标记的二抗（1:2000）于室温孵育 1 小时，并用 ECL 法检测。[2]
免疫沉淀：将细胞裂解液（100 μg 蛋白质）与抗 CDK2、抗 CDK4 或抗 CDK6 多克隆抗体于 4°C 孵育 12 小时，然后与蛋白 A-琼脂糖珠孵育 4 小时。免疫复合物经洗涤后，在样品缓冲液中煮沸，通过SDS-PAGE电泳分离，转移，并用抗p21或抗p27抗体进行免疫印迹分析。[2]
RNA提取和实时PCR：使用Easy Blue试剂盒分离总RNA，并通过逆转录合成cDNA。使用SYBR Green染料进行TGF-β1 mRNA的实时PCR，以GAPDH作为内参。引物：TGF-β1正向引物5'-gtg tgacat agg gtc tct gc-3'，反向引物5'-gag ggt gca cat aca aca gcg-3'；GAPDH正向引物5'-ggg gct ctc cac aga acat ac-3'，反向引物5'-cag gtc agg tcc acc act ga-3'。循环条件：95°C 变性 5 秒，57°C 退火 10 秒，72°C 延伸 20 秒，40 个循环。[2]
NBT 还原试验：将细胞与 0.1% NBT 和 100 ng/ml PMA 在 37°C 下孵育 25 分钟，涂片后在显微镜下计数含有蓝黑色甲臜沉积物的细胞（阳性细胞）。[2]
酯酶活性试验：使用 AS-D 氯乙酸酯酶和 α-萘乙酸酯酶试剂盒，按照制造商的说明对细胞进行染色，并计数阳性细胞的百分比。[2]
吞噬活性试验：将细胞与荧光乳胶微珠（直径 1 μm）在 37°C 下孵育 4 小时，洗涤后在显微镜下计数含有 ≥10 个细胞的细胞。微珠。[2]
流式细胞术检测表面抗原：收集细胞，与 FITC 标记的抗 CD11b、抗 CD14、抗 CD64 或抗 CD66b 抗体在冰上孵育 30 分钟，洗涤后，通过流式细胞术分析荧光强度。[2]
TGF-β1 ELISA：收集培养上清液，并按照制造商的说明使用 Quantikine ELISA 试剂盒进行检测。样品经酸活化（1N HCl 处理 10 分钟，用 1.2N NaOH/0.5M HEPES 中和）后，加入预先包被多克隆抗体的微孔板中，以检测 TGF-β1 蛋白。[2]

[1]. Anti-inflammatory, antioxidative and matrix metalloproteinase inhibitory properties of 20(R)-ginsenoside Rh2 in cultured macrophages and keratinocytes. J Pharm Pharmacol. 2013 Feb;65(2):310-6.

[2]. Ginsenoside Rh2 induces cell cycle arrest and differentiation in human leukemia cells by upregulating TGF-β expression. Carcinogenesis. 2013 Feb;34(2):331-40.

[3]. Ginsenoside Rh2-mediated G1 phase cell cycle arrest in human breast cancer cells is caused by p15 Ink4B and p27 Kip1-dependent inhibition of cyclin-dependent kinases. Pharm Res. 2009 Oct;26(10):2280-8.

[4]. Antiviral activity of 20(R)-ginsenoside Rh2 against murine gammaherpesvirus. J Ginseng Res. 2017 Oct;41(4):496-502.

(20S)-人参皂苷Rh2是一种存在于人参属植物中的人参皂苷。其结构为达玛烷型人参皂苷，羟基取代基位于3β、12β和20位（pro-S位）。具体而言，3位的羟基转化为相应的β-D-吡喃葡萄糖苷，并在24-25位引入双键。它具有多种功能，包括作为植物代谢产物、抗肿瘤剂、细胞凋亡诱导剂、心脏保护剂、骨密度维持剂和肝脏保护剂。它是一种β-D-葡萄糖苷、12β-羟基甾醇、人参皂苷、四环三萜类化合物和20-羟基甾醇类化合物。它来源于达玛烷的氢化物。据报道，人参皂苷Rh2存在于三七和人参中，相关数据可供参考。

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背景：人参皂苷Rh2是一种三萜皂苷，是人参的主要生物活性成分之一，属于20(S)-原人参二醇类化合物。既往研究表明，Rh2可通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来抑制多种癌细胞的增殖。本研究首次探讨了Rh2诱导人白血病HL-60细胞周期阻滞和分化的分子机制。研究表明，Rh2 可上调 TGF-β1 的表达，导致 p21^CIP1/WAF1 和 p27^KIP1 的增加，抑制 CDK2/4/6 的活性，降低 Rb 的磷酸化和 E2F1 的核转位，从而导致 G1 期阻滞和向单核细胞/巨噬细胞和粒细胞谱系的分化。这些发现提示 Rh2 具有治疗白血病的潜力。[2]

C36H62O8

622.8727

622.444

112246-15-8

119307

White to off-white solid powder

1.19

726.4±60.0 °C at 760 mmHg

225 °C

393.1±32.9 °C

0.0±5.4 mmHg at 25°C

1.572

5.62

139.84

6

8

7

44

1070

15

CC(=CCC[C@@](C)([C@H]1CC[C@@]2([C@@H]1[C@@H](C[C@H]3[C@]2(CC[C@@H]4[C@@]3(CC[C@@H](C4(C)C)O[C@H]5[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O5)CO)O)O)O)C)C)O)C)O)C

CKUVNOCSBYYHIS-IRFFNABBSA-N

InChI=1S/C36H62O8/c1-20(2)10-9-14-36(8,42)21-11-16-35(7)27(21)22(38)18-25-33(5)15-13-26(32(3,4)24(33)12-17-34(25,35)6)44-31-30(41)29(40)28(39)23(19-37)43-31/h10,21-31,37-42H,9,11-19H2,1-8H3/t21-,22+,23+,24-,25+,26-,27-,28+,29-,30+,31-,33-,34+,35+,36-/m0/s1

(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(3S,5R,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-12-hydroxy-17-[(2S)-2-hydroxy-6-methylhept-5-en-2-yl]-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~200.68 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。