FITC-Dextran (MW 70000)   中文名称: FITC-dextran

Fluorescent Dye

异硫氰酸荧光素 (FITC) 葡聚糖荧光染料（Ex=495 nm；Em=525 nm）被称为 FITC-葡聚糖（MW 500000）。为了研究细胞封闭的早期和晚期阶段并识别热休克引起的细胞损伤，可以使用 FITC-葡聚糖 (MW 500000) 作为标记物。对于细胞通透性研究，例如血脑屏障通透性和血脑屏障破坏程度的评估，使用 FITC-葡聚糖 (MW 500000)。储存：避免阳光直射。

标准操作流程
（以下为我们建议的实验方案，请根据具体应用需求进行调整。）

肠道屏障功能检测 [5]

1. 禁食处理
实验前使小鼠禁食4小时。
2. FITC-葡聚糖（分子量70,000）给药
采用灌胃方式给予FITC-葡聚糖（0.6 mg/g体重）。
3. 荧光强度检测
给药后4小时内测定血清荧光强度。

检测参数：
激发波长(Ex)：490 nm
发射波长(Em)：520 nm

关键说明：
本实验通过检测FITC-葡聚糖向循环系统的渗漏来评估肠道通透性。
荧光强度越高表明肠道屏障完整性受损越严重。
需确保规范的禁食处理以避免食物消化对实验结果的干扰。

（注：实验条件可根据具体研究需求进行相应调整。）

细胞培养与FITC-葡聚糖负载（参见注释2）[3]
1. 将培养于细胞培养基中的人源成纤维细胞置于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养，每周传代一次（参见注释3）。
2. 用胰酶消化细胞，计数后以9000个细胞/cm²的密度接种于直径35mm细胞培养皿中（参见注释4）。建议每组样品设置至少三个复孔，并建立包含五个pH值（如pH 4.05、4.5、5.0、5.5和6.0）的标准曲线（参见注释5）。同时设置未染色样本对照。
3. 配制1 mg/ml的FITC-葡聚糖细胞培养基溶液，使用0.22μm孔径的亲水性聚醚砜膜针头过滤器进行除菌过滤。
4. 制备终浓度为0.1 mg/ml的FITC-葡聚糖细胞培养基（参见注释6）。
5. 吸除原培养液，加入1ml含FITC-葡聚糖的新鲜培养基，置于37°C、5% CO2培养箱中孵育3天（参见注释7）。

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溶酶体pH值检测准备（参见注释7）[3]
1. 通过吸除培养基并更换新鲜培养液，使FITC-葡聚糖定位于溶酶体，继续培养2小时（参见注释8）。如需验证，可用荧光显微镜观察FITC-葡聚糖是否呈溶酶体特征性点状分布（图2）。此期间可同时加入溶酶体膜通透性诱导剂或抑制剂（参见注释9）。
2. 孵育结束后，用胰酶消化细胞并转移至离心管。
3. 300×g离心5分钟，吸除上清。
4. 用1ml室温PBS洗涤细胞，再次300×g离心5分钟。
5. 弃PBS，将样本置于冰上。
6. 按每个标准样品0.5ml的体积配制不同pH值的Britton-Robinson缓冲液。添加终浓度50mM的叠氮化钠和2-脱氧葡萄糖，以及终浓度10μM的尼日利亚菌素（参见注释10）。缓冲液需保持冰浴状态。

[1]. Fluorescein isothiocyanate-dextran can track apoptosis and necrosis induced by heat shock of peripheral blood mononuclear cells and HeLa cells. Open Biological Sciences Journal, 2015, 1(1).

[2]. Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextran Extravasation as a Measure of Blood-Brain Barrier Permeability. Curr Protoc Neurosci. 2017 Apr 10;79:9.58.1-9.58.15.

[3]. Analysis of Lysosomal pH by Flow Cytometry Using FITC-Dextran (MW 70000) Loaded Cells. Methods Mol Biol. 2017;1594:179-189.

[4]. Cdc42 activates paracellular transport in polarised submandibular gland cells. Arch Oral Biol. 2021 Dec;132:105276.

[5]. ACE2 contributes to the maintenance of mouse epithelial barrier function. Biochem Biophys Res Commun. 2020 Dec 17;533(4):1276-1282.

关键参数 [2]
1. 使用正确剂量的氯胺酮/赛拉嗪混合液进行麻醉至关重要。剂量应足以使大鼠保持手术麻醉深度，但又不至于致死。为了确保良好的灌注，在向左心室注射肝素时，心脏应保持规律的跳动。注射肝素是为了防止血小板在血管内聚集，并在灌注过程中提供无回压的血液自由流动，从而最大限度地减少小血管和毛细血管的破裂。
2. 灌注液的流速需要保持在不宜过高的水平，因为过高的流速会增加小毛细血管的压力，导致其破裂。另一方面，必须维持足够的压力以灌注最小直径的毛细血管。3. 右心房用于血液流出的切口必须足够大（约0.5厘米），以便血液能够自由流出而不会产生回压。4. 灌注中使用的FITC-葡聚糖（分子量70000）溶液的浓度应足够高，以克服灌注过程中血管内血液的稀释作用。灌注中使用的FITC-葡聚糖（分子量70000）的最佳浓度应由实验者根据动物体重进行经验性确定。
5. 必须确保FITC-葡聚糖（分子量70000）粉末在灌注前完全溶解且处于低温状态。
6. 用FITC-葡聚糖（分子量70000）灌注完成后，必须立即将大鼠断头并取出脑组织。这样可以最大限度地减少在泵未主动灌注的情况下，FITC-葡聚糖（分子量 70000）从血管中的人为渗漏。7. 对大脑进行低温保护至关重要，可以防止在速冻过程中细胞发生突然的渗透压变化，从而避免细胞壁破裂、组织损伤以及 FITC-葡聚糖（分子量 70000）的人为渗漏。8. 不要将大脑浸入 2-甲基丁烷中超过 5 分钟，因为这会导致组织破裂。9. 使用预先处理过的载玻片来固定组织切片有助于组织粘附在载玻片上并使其平整。此外，它还可以防止切片在 DRAQ5 中孵育时从载玻片上脱落。10. 必须将大脑与低温恒温器的温度平衡至少 2 小时。通常情况下，大脑外部温度与内部区域温度不同，这会影响切片厚度的一致性，也会影响切片的质量。
11.切片温度至关重要。温度过高会导致组织结块并粘连在一起。相反，如果冰冻切片机温度过低，组织会开裂并紧紧卷曲，难以展开而不造成组织损伤。冷冻切片机的合适温度设置取决于环境温度和湿度，应在对目标区域进行切片之前，通过评估非目标脑区切片的质量来确定。
12. 切片后，应使用细毛刷小心轻柔地将组织切片从冷冻切片机刀片上转移至载玻片上，因为机械晃动可能导致血管破裂，FITC 也可能从毛细血管中渗出。
13. 使用灌注了 FITC-葡聚糖（分子量 70000）的脑组织时，应保持弱光环境，以最大程度地减少环境强光猝灭造成的荧光衰减。弱光环境以及用铝箔覆盖脑组织有助于维持荧光。
14. 载玻片上的组织切片在涂抹 Fluoromount-G 封片剂和盖玻片之前，需要用 PBS（含或不含 DRAQ5）完全复水。 Fluoromount-G 是一种封片剂，适用于湿组织，但用于干燥脱水切片时，封片剂固化过程中会产生大量小气泡。
15. 与 DRAQ5 孵育后请勿清洗切片，否则可能会洗掉 FITC-葡聚糖 (MW 70000)，降低 DRAQ5 信号，导致成像时难以确定正确的焦平面。
16. 每次实验均需对对照组和处理组进行成像。这将考虑共聚焦显微镜和载玻片处理过程中任何日常的变异性或意外变化。
17. 对照组和实验组应在一次成像过程中对相同的脑区/区域进行成像，而不是先对一组的所有脑区进行成像，然后再对另一组进行成像。
18. 一旦成像参数确定，进行分析的研究人员应不知晓处理条件，以避免对成像测量结果引入偏差。

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故障排除
1. 对照组大鼠图像过暗或看不到毛细血管可能是由于灌注不良所致。
a. 肝脏清除率可作为灌注的指标。开始灌注后，肝脏应在 5-10 秒内开始清除。如果上述情况未发生，请重新调整16G针头在心室内的位置，确保斜面尖端不抵住心壁或室间隔。
b. 增加灌注的FITC-葡聚糖（分子量70000）的体积。建议的FITC-葡聚糖（分子量70000）用量（12 mL）适用于体重在250-300 g之间的大鼠。体重较重的大鼠可能需要更大体积的灌注FITC-葡聚糖（分子量70000）才能充满脑部的小毛细血管。
c. 也可以尝试增加泵的流速，但需要注意的是，更高的流速（从而更高的压力）可能会导致脑毛细血管破裂并渗漏FITC-葡聚糖（分子量70000），从而导致血脑屏障破坏的假阳性结果。保持所有对照组和实验组的泵速一致，以避免泵速变化意外导致血脑屏障破坏程度的差异。
2. 成像过程中切片和载玻片上出现明亮的荧光斑点
a. 切片或放置于载玻片上时，过度扰动组织切片可能导致血管和毛细血管破裂，造成FITC-葡聚糖（分子量 70000）渗漏。
b. 金佰利擦拭纸或其他实验室用纸巾可能会留下在不同波长下发出荧光的斑点和碎屑，不应用于清洁载玻片。使用柔软的超细纤维布擦拭载玻片是更好的选择。
c. 冷冻过程也可能导致组织上出现明亮的荧光斑点。在2-甲基丁烷中孵育超过5分钟可能导致组织脱水和细胞膜破裂。

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血脑屏障（BBB）部分由构成脑毛细血管和微血管的血管内皮细胞形成。该屏障的功能是维持脑微环境的稳态，并缓冲脑部免受外周环境变化的影响。血脑屏障功能障碍会导致通常局限于外周的循环分子和病原体进入脑部，干扰正常的脑功能。由于血脑屏障通透性增加与多种神经病理学相关，因此拥有一种可靠且灵敏的方法来测定血脑屏障的通透性和破坏程度至关重要。本文详细介绍了一种通过经心灌注10,000 Da FITC标记的葡聚糖分子并对其进行可视化以确定其从脑微血管外渗程度来评估血脑屏障完整性的方案。 [2]溶酶体腔的酸性环境为酸性水解酶提供了最佳的活性环境，并且对于内体-溶酶体隔室的融合/分裂以及货物的分类也至关重要。有证据表明，维持溶酶体的酸性对于预防疾病至关重要。本章介绍了一种利用荧光探针异硫氰酸荧光素 (FITC)-葡聚糖以及适用于流式细胞术的双发射比率技术分析培养细胞中溶酶体 pH 值的方案。荧光标记的葡聚糖被内吞并积累在溶酶体隔室中。在最大发射波长处分析时，FITC 的荧光强度随 pH 值变化；而在等吸收点处分析时，荧光强度则无变化。因此，该比率可用于测定溶酶体的 pH 值。通过使用离子载体尼日利亚菌素平衡溶酶体内的 pH 值和细胞外的 pH 值，可以获得标准曲线。该方案还包括有关诱导溶酶体碱化和溶酶体膜通透性的方法的信息。[3]

C21H13NO6S.XUNSPECIFIED

70000

60842-46-8

Yellow to orange solid powder

C1=C(O)C=CC2C3(OC(=O)C4=CC=CC=C34)C3=C(C=C(ONC(=O)S)C=C3)OC1=2

FITC-Dextran (MW 70000)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~50 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。