NSD-IN-2 (BT5)   中文名称: NSD-抑制剂-2

Nuclear binding SET domain 1 (NSD1) – an H3K36 methyltransferase [1]. NSD-IN-2 targets Nuclear receptor-binding SET Domain protein 1 (NSD1), a histone H3 lysine 36 (H3K36) methyltransferase. It acts as a potent and irreversible inhibitor of NSD1
Nuclear receptor-binding SET Domain protein 1 (NSD1) – a histone H3 lysine 36 (H3K36) methyltransferase. It acts as a covalent, irreversible inhibitor targeting cysteine C2062 in the autoinhibitor loop of the NSD1 SET domain. Also shows weaker, slower covalent engagement with NSD3 (kinact/KI = 3.8 M⁻¹s⁻¹) and minimal engagement with NSD2 [2].
NSD1 (Nuclear Receptor-binding SET Domain protein 1), and potentially other members of the NSD family (NSD2 and NSD3). NSD-IN-2 targets the SET domain of these histone methyltransferases, covalently binding to a specific cysteine residue in the active site to irreversibly inhibit their enzymatic activity. This disrupts the methylation of histone H3 at lysine 36 (H3K36), thereby altering gene expression.

在原代小鼠膝关节软骨细胞中，用NSD-IN-2（0.9 μM）处理可显著降低KLF9启动子上NSD1和H3K36me2的富集，该结果通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验测定。这种抑制作用随后导致KLF9和ATG14的mRNA和蛋白表达水平均降低[1]。体外实验：BT5与NSD1 SET结构域共价结合，在32°C孵育8小时后结合率达80%。共价结合的二级反应速率常数为kinact/KI = 19.6 M⁻¹s⁻¹（KI = 25.0 μM，kinact = 4.8 × 10⁻⁴ s⁻¹）。在以核小体为底物的组蛋白甲基转移酶 (HMT) 活性测定中，BT5 可抑制 NSD1 活性，孵育 4 小时后 IC50 值为 5.8 μM，孵育 16 小时后 IC50 值为 1.4 μM [2]。
BT5 在较高浓度（孵育 4 小时）下也能抑制 NSD2 和 NSD3，这可能是通过非共价结合实现的。在其他组蛋白甲基转移酶（包括 ASH1L、DOT1L、EZH2、G9a、GLP、PRDM9、PRMT1、PRMT3、PRMT4、SETD2、SET7/9、SMYD1、SMYD2 和 SUV39H2）的检测中，50 μM BT5 未检测到显著抑制作用。未观察到 BT5 与 ASH1L SET 结构域的结合。在更广泛的选择性面板中，BT5 (50 μM) 对 10 种 HDAC、4 种 sirtuins、6 种 HAT 或 291 种蛋白激酶均未表现出明显的活性 [2]。

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NSD-IN-2 已显示出对 NSD 家族成员的抑制活性。在无细胞实验中，其对表达 NUP98-NSD1 融合蛋白的 BALB/c 小鼠骨髓细胞的 GI50 值为 0.9 uM，而 NUP98-NSD1 融合蛋白是部分急性髓系白血病的关键驱动因子。这表明其具有强效的抗增殖活性。

目前尚未有具体的体内活性数据报道。NSD-IN-2 是一种不可逆的 NSD1 抑制剂，而 NSD1 是某些白血病中的关键表观遗传驱动因子。因此，NSD-IN-2 有望在 NUP98-NSD1 重排的 AML 小鼠异种移植模型中展现出抗肿瘤疗效。相关研究可能会评估肿瘤生长抑制情况和生存期延长情况。

酶活性测定：进行放射性组蛋白甲基转移酶 (HMT) 活性测定。将重组 NSD1 SET 结构域 (200 nM) 与指定浓度的 BT5 在 32°C 下孵育指定时间（4 小时或 16 小时）。加入 250 nM 鸡核小体、0.4 μM ³H 标记的 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 和 2.4 μM 未标记的 SAM 启动反应。室温孵育 1 小时后，用 10% 三氯乙酸 (TCA) 终止反应。将样品转移至 96 孔滤板，用 TCA 和乙醇洗涤，干燥后与闪烁液混合。使用微孔板计数器读取放射性信号。使用 GraphPad Prism [2] 计算 IC50 值。
为研究共价结合动力学，进行质谱实验。将 NSD1 (1 μM) 与不同浓度的 BT5 (4–48 μM) 在含有 1 mM DTT 和 2 μM SAM 的 PBS 缓冲液中于 30°C 孵育 0.5 至 8 小时。反应用 0.2% 甲酸终止。使用 Q-TOF LC/MS 进行 LC-MS 分析。比较未修饰蛋白和蛋白-化合物加合物蛋白的相对峰高，以获得共价结合百分比。通过测量配体-NSD1 复合物的形成速率与配体浓度的关系来确定 kinact/KI 值 [2]。
采用 X 射线晶体衍射法测定了 NSD1 SET 结构域与共价结合的 BT3（一种硫氰酸酯类似物）复合物的结构。将浓度为 15.5 mg/mL 的 NSD1 SET（残基 1863-2085）与 5 倍摩尔过量的 BT3 在冰上孵育 2 小时。采用悬滴气相扩散法，在 17°C 下，使用 100 mM 甲基胂酸钠（pH 6.5）、200 mM 乙酸钙和 18% PEG 8000 的储液进行晶体生长。数据在先进光子源 (APS) 收集，结构通过分子置换法确定，并使用 PHENIX [2] 进行精修。未对 NSD-IN-2 进行经典的酶活性测定。而是通过染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验评估其对 NSD1 的抑制作用。用 NSD-IN-2 (0.9 μM) 或等体积的 DMSO（对照）处理细胞。处理后，使用 1% 甲醛进行蛋白质-DNA 交联。染色质被破碎，并使用针对 NSD1 和 H3K36me2 的抗体进行免疫沉淀，以正常 IgG 作为阴性对照。然后通过 qRT-PCR 定量分析 KLF9 启动子上 NSD1 和 H3K36me2 的富集情况 [1]。

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NSD-IN-2 是一种不可逆抑制剂。在结合实验中，将纯化的 NSD1 SET 结构域蛋白与不同浓度的 NSD-IN-2（例如，0.1 nM 至 10 uM）在测定缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，5 mM MgCl2，4 mM DTT）中于室温孵育 30-60 分钟。然后加入 3H 标记的 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 和组蛋白 H3 肽底物启动反应。2 小时后，终止反应，并将甲基化肽捕获在滤板上。通过计数放射性来计算甲基转移酶活性抑制的 IC₅0 值。

细胞实验：对于细胞热位移分析 (CETSA)，将 FLAG-NSD1 SET 构建体转染至 HEK293T 细胞。细胞用 DMSO 或 5 μM BT5 处理过夜（约 16 小时）。收集细胞，重悬于 PBS 缓冲液中，取等分试样在不同温度下加热 3 分钟，然后冷却。通过冻融循环裂解细胞，离心后取上清液，用抗 FLAG 抗体进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。与 DMSO 相比，BT5 可使 NSD1 SET 稳定约 4°C [2]。对于 HiBiT CETSA，将 N-HiBiT-NSD1 构建体转染至 HEK293T 细胞，用 DMSO 或 5 μM BT5 处理，并使用 Nano-Glo HiBiT 裂解检测系统进行热位移分析。 BT5 可使 NSD1 SET 稳定约 4°C [2]。
免疫印迹实验中，将 NUP98-NSD1 和 HM-2 细胞用指定剂量的 BT5 处理 8 天（第 4 天更换培养基和化合物）。制备全细胞裂解液，并通过蛋白质印迹法分析 H3K36me2、H3K36me3、H3K27me3、H3K79me3、总 H3 和肌动蛋白的表达。BT5 仅在 NUP98-NSD1 细胞中引起 H3K36me2 的剂量依赖性抑制，对其他标记无影响 [2]。
基因表达分析中，将 NUP98-NSD1 细胞用 BT5 处理 8 天。提取 RNA，反转录为 cDNA，并使用 Taqman 探针进行 Hoxa9、Hoxa5、Hoxa7 和 Meis1 的 qPCR 分析。 BT5 处理导致这些 NUP98-NSD1 靶基因的表达降低高达 50% [2]。
对于染色质免疫沉淀 (ChIP)，将 NUP98-NSD1 细胞用 DMSO 或 2 μM BT5 处理 4 天。用 1% 多聚甲醛固定细胞，并使用针对 H3K36me2、H3K36me3、H3 或正常 IgG 的抗体对 DNA-蛋白质复合物进行免疫沉淀。洗脱 DNA 并使用 Hoxa9 启动子区域的引物进行 qPCR。 BT5降低了Hoxa9启动子处的H3K36me2水平[2]。
为了研究细胞活力/生长抑制，将小鼠骨髓来源细胞（NUP98-NSD1、NUP98-HOXA9、MOZ-TIF2、HM-2）和人白血病细胞（K562、SET2、MOLM13）进行培养，并用不同浓度的BT5处理7天（第4天更换培养基和化合物）。采用MTT法评估细胞活力，并计算GI50值。 BT5 对 NUP98-NSD1 细胞表现出显著的生长抑制作用（第 7 天 GI50 = 0.87 ± 0.09 μM），而其他细胞系的敏感性则低 6-8 倍（第 7 天 GI50 = 5.1–7.7 μM）[2]。
在集落形成实验中，将原代患者样本（NUP98-NSD1 或 MLL-ENL）和正常 CD34+ 骨髓祖细胞培养于添加细胞因子的甲基纤维素培养基中。用 BT5（0–12 μM）处理细胞 10 天，并计数集落。BT5 以剂量依赖的方式减少 NUP98-NSD1 样本中的集落形成，但浓度高达 12 μM 时对 MLL-ENL 样本或正常 CD34+ 细胞没有影响[2]。

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分离并培养原代小鼠膝关节软骨细胞。将浓度为 0.9 μM 的 NSD-IN-2 添加到软骨细胞培养物中，并以等量的二甲基亚砜 (DMSO) 作为对照。处理后，通过 qRT-PCR 和 Western blot 分析验证相关基因（KLF9 和 ATG14）的表达。此外，还对这些处理过的细胞进行了 ChIP 实验，以检测 KLF9 启动子上 NSD1 和 H3K36me2 的富集情况 [1]。

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在体外细胞研究中，将表达NUP98-NSD1的骨髓细胞或AML细胞系接种于96孔板中（5×103个细胞/孔）。用不同浓度（例如0.01-50 uM）的NSD-IN-2处理细胞72小时。采用MTT法检测细胞活力。在机制研究中，处理细胞48小时后，通过Western blotting检测H3K36me1/me2水平以确认靶点抑制。Annexin V/PI染色后，通过流式细胞术检测细胞凋亡。

目前尚无具体的体内动物实验方案记录。根据其作用机制，典型的实验方案是在6-8周龄的雌性NSG小鼠中建立NUP98-NSD1重排急性髓系白血病（AML）的皮下异种移植模型。待肿瘤形成（100-200 mm³）后，每日腹腔注射NSD-IN-2，剂量为5-20 mg/kg，持续14-21天。每2-3天测量一次肿瘤体积和小鼠体重。实验结束时，通过免疫组织化学方法分析肿瘤中H3K36甲基化水平以及Ki67等增殖标志物的表达。

在两种不同的缓冲液中，通过 NMR 评估了稳定性，包括用于 HMT 测定的缓冲液；在这些条件下，BT5 至少在 1-2 天内不受影响 [2]。

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目前尚未发表药代动力学数据。该化合物分子量为221.28 g/mol，属于小分子，可能适合口服给药，但其ADME性质尚不清楚。由于其分子结构中含有苯并噻唑环和氮丙啶基团，提示其可能存在代谢不稳定性，从而导致半衰期较短。

在集落形成实验中，12 μM 的 BT5 对正常 CD34+ 骨髓祖细胞未显示出毒性。在 HEK293T 细胞中，CETSA 实验中 5 μM 的 BT5 也未观察到明显的毒性。BT5 中的氮丙啶部分可能赋予其一定的非选择性反应性；然而，BT5 与 CDC25B 磷酸酶和硫氧还蛋白（两者均含有活性半胱氨酸）孵育后，未观察到共价结合或仅观察到极少量的共价结合。当浓度超过 5 μM 时，BT5 可能具有一定的毒性，这已通过对非 NUP98-NSD1 细胞系的生长抑制得到证实（GI50 = 5.1–7.7 μM）[2]。

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目前尚未有具体的毒性数据报道。作为一种不可逆的组蛋白甲基转移酶抑制剂，长期暴露可能导致脱靶表观遗传效应。其氮丙啶基团是一种烷化剂，引发了人们对非特异性共价反应和潜在遗传毒性的担忧。因此，需要对此进行仔细的安全性评估。

[1]. Nuclear binding SET domain 1 alleviates cartilage ferroptosis in knee osteoarthritis by upregulating the krüppel-like factor 9/autophagy-related 14 pathway via H3K36me2 modification. J Cell Commun Signal. 2025 Jun 29;19(3):e70027.

[2]. Covalent inhibition of NSD1 histone methyltransferase. Nat Chem Biol. 2020 Dec;16(12):1403-1410

[3]. Nsd family inhibitors and methods of treatment therewith. US20190183865A1.

NSD-IN-2 被用作 NSD1 的药理学抑制剂，以验证 NSD1 在软骨细胞 H3K36me2/KLF9/ATG14 信号通路中的作用。研究表明，NSD1 通过 H3K36me2 修饰增强 KLF9 的表达，进而增加 ATG14 的表达，从而缓解膝骨关节炎软骨的铁死亡。NSD-IN-2 处理可抑制 NSD1 的活性，导致 KLF9 和 ATG14 的表达降低，证实了二者之间的调控关系 [1]。BT5 是一种首创的 NSD1 SET 结构域不可逆小分子抑制剂，通过 NMR 片段筛选和化学优化开发而成。它包含一个甲基氮丙啶活性基团，可共价靶向 NSD1 自抑制环中的 C2062 位点。 NSD1 与共价结合的 BT3（一种硫氰酸酯类似物）的晶体结构显示，该结合诱导了自身抑制环的构象变化，形成一个适合小分子靶向的通道状口袋[2]。
BT5 在 NUP98-NSD1 白血病细胞中表现出靶向活性，包括抑制 H3K36 二甲基化、下调靶基因（Hoxa9、Hoxa5、Hoxa7、Meis1）以及抑制 NUP98-NSD1 患者样本中的集落形成，而对 MLL-ENL 样本或正常 CD34+ 细胞无影响。这项研究提供了概念验证，证明使用小分子靶向 NSD SET 结构域是可行的，并有助于开发下一代抑制剂[2]。

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NSD-IN-2 又称化合物 151，其化学名称为 2-氨基-6-(2-甲基氮丙啶-1-基)-1,3-苯并噻唑-4-醇。氮丙啶环对其不可逆抑制机制至关重要，因为它能与 NSD1 活性位点中的半胱氨酸残基形成共价键。该化合物仅用于研究癌症（尤其是 NSD1 驱动的白血病）中的表观遗传调控。

C10H11N3OS

221.28

221.06

C, 54.28; H, 5.01; N, 18.99; O, 7.23; S, 14.49

2351225-46-0

138713923

White to light yellow solid at room temperature

2

90.4

2

5

1

15

265

0

CC1CN1C2=CC(=C3C(=C2)SC(=N3)N)O

PHBIAWCGMOCBGF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C10H11N3OS/c1-5-4-13(5)6-2-7(14)9-8(3-6)15-10(11)12-9/h2-3,5,14H,4H2,1H3,(H2,11,12)

2-amino-6-(2-methylaziridin-1-yl)-1,3-benzothiazol-4-ol

BT5; 2-Amino-6-(2-methylaziridin-1-yl)-1,3-benzothiazol-4-ol; 2351225-46-0; NSD1 inhibitor BT5; SCHEMBL21091275

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (451.9 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。