SETDB1/KMT2G
SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) targets SETDB1 triple tudor domain (TTD/3TD) with KD = 0.088 ± 0.045 μM (ITC assay) and KD = 0.106 ± 0.002 μM (SPR assay) [1].
In a TR-FRET competition assay, it displaced H3K9me2K14ac peptide from SETDB1 3TD with IC50 = 1.7 ± 0.47 μM [2].
It showed no binding to the inactive enantiomer (S,S)-59 [1][2].

SETDB1-TTD-IN-1 对 JMJD2A 和 53BP1 均表现出一定的活性，其 Kd 值分别为 4.3 μM 和 86 μM。在针对 16 个 Tudor 结构域（Kd>100 μM）的测试中，SETDB1-TTD-IN-1 未表现出任何活性。(1) SETDB1-TTD-IN-1（2.5-40 μM）在 HEK293T 细胞中稳定 SETDB1-TTD 蛋白表现出显著的剂量依赖性作用 [1]。在人急性单核细胞白血病THP-1细胞中，SETDB1-TTD-IN-1（2.5–40 μM；24 h）可显著改变72个基因的表达[1]。

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SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59)在等温滴定量热法(ITC)竞争实验中抑制内源性H3肽（H3K9me/K14ac、H3K9me2/K14ac、H3K9me3/K14ac）与SETDB1-TTD的结合，预孵育后可完全阻止其结合[1]。
在HTRF实验中，它抑制TTD-H3K9me2/K14ac的相互作用，IC50值为0.93 μM，抑制TTD-H3K9me3/K14ac的相互作用，IC50值为0.75 μM[1]。
相反，它促进SETDB1甲基转移酶活性。体外实验表明，Akt1-K64肽以剂量依赖的方式增加甲基化水平，浓度为100 μM时增加高达50%，EC50 = 19 μM [2]。
动力学分析显示，kcat值增加（从0.29 h⁻¹增至0.50 h⁻¹），而SAM KM值保持不变（≈0.9-1.0 μM），表明催化效率增强（kcat/KM值从0.32 μM⁻¹ h⁻¹增至0.49 μM⁻¹ h⁻¹）[2]。
在细胞（转染HA-Akt1的HEK293T细胞）中，用SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59)处理可剂量依赖性（0-10 μM，24 h）和时间依赖性（0-24 h，10 μM）地增加Akt1三甲基化和T308磷酸化水平，免疫印迹结果显示。 [2].
在稳定表达HA-Akt1的DLD1细胞中也观察到了类似的效果[2].
在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，低剂量（2.5和5 μM）的SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59)促进了细胞增殖（处理72小时），而较高剂量（>5 μM）则没有显示出任何效果；对映体 (S,S)-59 没有作用 [2]。
在表达 Flag-SETDB1-TTD 的 HEK293T 细胞中，CETSA 显示，浓度 ≥5 μM 的 SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) 可剂量依赖性地稳定 TTD 蛋白，而 (S,S)-59 则没有此作用 [1]。
在用 6 μM SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) 处理 293T 细胞 18 小时后，使用 EGFP 标记的 SETDB1-TTD (WT) 进行 FRAP 检测，结果显示，与 DMSO (1.45 ± 0.34 s) 或 (S,S)-59 (1.50 ± 0.31 s) 相比，归一化半衰期恢复时间 (t₁/₂ = 1.05 ± 0.33 s) 显著缩短，表明蛋白质迁移率和靶标结合增加[1]。
用 10 μM SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) 处理 THP-1 细胞 24 小时后，RNA-seq 检测到 72 个基因的表达受到影响（>4 倍），其中 49 个基因与 (S,S)-59 或 DMSO 相比受到独特影响[1]。

体外甲基转移酶活性测定：将活性重组全长SETDB1（SETDB1-FL）与生物素标记的Akt1-K64肽（10 μM）和[³H]-SAM（5 μM）在缓冲液（20 mM Tris pH 8.5，5 mM DTT，0.01% Triton X-100）中于23°C孵育60分钟。加入7.5 M盐酸胍终止反应，并将掺入的放射性物质捕获在SAM2生物素捕获膜上，通过液体闪烁计数进行定量。为测试化合物效应，使用 0.5 μM SETDB1-FL 和不同浓度的 SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) (0-100 μM) [2]。
ITC 测定：采用等温滴定量热法测定 SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) 与 SETDB1-TTD 蛋白的结合亲和力。KD 值为 0.088 ± 0.045 μM [1]。
SPR 测定：在 Biacore 8K 系统上于 25°C 下进行表面等离子共振实验。将生物素化的 SETDB1-TTD 固定在 SA 传感器芯片上。将不同浓度的SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59)溶液流过固定化蛋白（接触时间120秒，解离时间300秒，流速30 μL/min）。使用Biacore评估软件分析数据，得到KD = 0.106 ± 0.002 μM [1]。对于分离的3TD，SPR测得KD = 4.8 ± 1.6 μM [2]。
DSF测定：使用实时荧光定量PCR系统进行差示扫描荧光测定。将SETDB1-TTD (10-20 μM)与SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) (100-200 μM)和Sypro Orange染料孵育。温度梯度为25至90°C，升温速率为1°C/min。 ΔTm 值：5.79°C [1] 和 2.9 ± 0.20°C [2]。
HTRF 竞争性分析：时间分辨荧光能量转移分析使用 6×His 标签的 SETDB1 (40 nM)、生物素化的 H3K9me2K14ac 肽 (40 nM)、Lance Eu-链霉亲和素 (2 nM) 和 ULight-抗 6×His 抗体 (10 nM)，溶于 pH 7.0 的 PBS 缓冲液（含 0.005% Tween 20 和 2 mM DTT）。化合物以 10 倍系列稀释（3 倍稀释）加入。平衡 1 小时后，在 320 nm 激发波长和 615 nm 及 655 nm 发射波长下读取荧光光谱。 SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) 的 IC50 为 1.7 ± 0.47 μM [2]。
TR-FRET 竞争性 H3 肽置换：使用 GST-SETDB1-TTD 和生物素标记的 H3 肽（H3K9me2/K14ac 或 H3K9me3/K14ac）进行类似实验，得到的 IC50 值分别为 0.93 μM 和 0.75 μM [1]。
CETSA：将稳定转染 Flag-SETDB1-TTD 的 HEK293T 细胞用不同浓度的 SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) 或 (S,S)-59 处理 6 小时，然后在 50°C 加热，并通过冻融循环裂解细胞。通过蛋白质印迹法分析可溶性蛋白含量。浓度≥5 μM的化合物可剂量依赖性地稳定TTD蛋白[1]。
FRAP：将转染了EGFP标记的SETDB1-TTD（野生型或Y268A突变体）的293T细胞用6 μM的SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59)、(S,S)-59或DMSO处理18小时。测量光漂白后的荧光恢复情况，并计算归一化半衰期恢复时间(t₁/₂)。野生型细胞用(R,R)-59处理后：1.05 ± 0.33 s；用(S,S)-59处理后：1.50 ± 0.31 s； DMSO：1.45 ± 0.34 秒 [1]。
RNA-seq：THP-1 细胞用 10 μM SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59)、(S,S)-59 或 DMSO 处理 24 小时。收集细胞并进行 RNA 测序。处理影响了 72 个基因（变化倍数 >4 倍，p<0.05），其中 49 个基因仅受 (R,R)-59 影响 [1]。

细胞培养和转染：HEK293T、DLD1 和 MDA-MB-231 细胞培养于含 10% FBS、青霉素和链霉素的 DMEM 培养基中。转染采用聚乙烯亚胺进行。对于 Akt1 实验，细胞用 HA-Akt1 质粒或稳定表达慢病毒 HA-Akt1 的载体进行转染 [2]。
免疫印迹和免疫沉淀：细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 EBC 缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、120 mM NaCl、0.5% NP-40）或 Triton X-100 缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1% Triton X-100）中裂解。测定蛋白浓度，并取等量蛋白进行 SDS-PAGE 电泳。免疫沉淀实验中，将 1 mg 总裂解液与抗 HA 琼脂糖珠在 4°C 下孵育 3-4 小时。用 NETN 缓冲液（20 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40）洗涤。所用抗体：抗 HA (1:1000)、抗三甲基赖氨酸基序 (1:1000)、抗磷酸化 Akt-Thr308 (1:1000) [2]。
细胞增殖实验：将 MDA-MB-231 细胞（96 孔板，每孔 5000 个细胞）用指定剂量的 SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) 或 (S,S)-59 处理 72 小时。采用 Cell Titer-Glo 试剂盒检测发光强度来分析细胞增殖[2]。
CETSA：将稳定转染 pLVX-mCherry-N1-SETDB1-TTD 质粒的 HEK293T 细胞用浓度为 0、0.625、1.25、2.5、5、10 和 20 μM 的化合物处理 6 小时。然后将细胞加热至 50°C，并用液氮反复冻融循环裂解细胞。通过蛋白质印迹法测定可溶性蛋白含量[1]。
FRAP：将转染 EGFP 标记的 SETDB1-TTD 野生型或 Y268A 突变体质粒的 293T 细胞用 6 μM 化合物或 DMSO 处理 18 小时。测量光漂白后的荧光恢复情况。每组18个细胞，采用单因素方差分析（ANOVA）并进行Dunnett校正（p<0.05）[1]。
RNA测序：将人急性单核细胞白血病THP-1细胞用10 μM SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59)、(S,S)-59或DMSO处理24小时，然后收集细胞进行RNA测序分析。表达倍数变化>4倍且p<0.05的基因被认为具有统计学意义[1]。

[1]. Structure-Guided Discovery of a Potent and Selective Cell-Active Inhibitor of SETDB1 Tudor Domain. Angew Chem Int Ed Engl. 2021 Apr 12;60(16):8760-8765.

[2]. SETDB1 Triple Tudor Domain Ligand, (R, R)-59, Promotes Methylation of Akt1 in Cells. ACS Chem Biol. 2023 Aug 18;18(8):1846-1853.

SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59) 是一种首创的高效选择性 SETDB1 三重 Tudor 结构域小分子抑制剂，它是通过对先导化合物 Cpd1 (KD 4.4 μM) 进行结构导向优化而发现的 [1]。
它与 SETDB1-TTD 的 Tudor 结构域 2 和 Tudor 结构域 3 之间的区域结合，形成关键相互作用，包括与 Y268 的氢键和与 D299 的静电相互作用 [1]。
共晶结构（PDB 登录号 7CJT）揭示了 Y268 酚羟基与丙烯基 C=C 双键之间的 α²-π 相互作用 [1]。
对映体 (S,S)-59 在所有检测中均完全无活性，可作为阴性对照 [1][2]。
出乎意料的是，SETDB1-TTD-IN-1 ((R,R)-59)作为SETDB1甲基转移酶活性的正向变构调节剂，促进Akt1 K64甲基化和随后的Akt1 T308磷酸化，从而导致SETDB1过表达的乳腺癌细胞增殖增加[2]。
该化合物是首个报道的SETDB1甲基转移酶活性的小分子激活剂[2]。
SETDB1的3TD结构域是Akt1-K64有效甲基化所必需的，因为缺失3TD结构域的构建体（SETDB1-S）未显示出明显的甲基化[2]。

C28H31N5O2

469.58

469.247

2755823-12-0

SETDB1-TTD-IN-1 TFA

155884456

White to off-white solid powder

3.9

73

2

4

8

35

758

2

C1(N[C@@H]2C[C@H](C3=CC=C(OCC4=CC=CC=C4)C=C3)CN(C)C2)N(CC=C)C(=O)C2NC=CC=2N=1

NBDJDKAXIGWAIM-XZOQPEGZSA-N

InChI=1S/C28H31N5O2/c1-3-15-33-27(34)26-25(13-14-29-26)31-28(33)30-23-16-22(17-32(2)18-23)21-9-11-24(12-10-21)35-19-20-7-5-4-6-8-20/h3-14,22-23,29H,1,15-19H2,2H3,(H,30,31)/t22-,23+/m0/s1

2-[[(3R,5R)-1-methyl-5-(4-phenylmethoxyphenyl)piperidin-3-yl]amino]-3-prop-2-enyl-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： (1). 本产品在运输和储存过程中需避光。  (2). 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 125 mg/mL (266.20 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。