Ralometostat (TNG908)

PRMT5; TNG908 targets protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5), a type II PRMT enzyme that catalyzes the symmetric dimethylation of arginine (SDMA) residues on substrates regulating DNA damage, spliceosome activity, and transcriptional activity . TNG908 exhibits an MTA-cooperative binding mechanism, selectively binding to the PRMT5·MTA complex that accumulates in MTAP-deleted cancer cells . In cell-free assays, the potency of TNG908 improves approximately 12-fold in the presence of MTA (IC50 = 21.2 ± 9.3 nM, Ki = 0.26 nM) relative to the absence of MTA (IC50 262 ± 52 nM, Ki 3.2 nM) . The compound demonstrates an IC50 of 0.009 μM (9 nM) for PRMT5 in cellular assays .

NG908是一种强效抑制剂，可结合PRMT5·MTA复合物，与完整的MTAP（MTAP WT）细胞相比，可选择性杀死MTAP缺失（MTAP无效）细胞15倍。总之，发现了一系列与MTA协同抑制PRMT5的化合物，包括在MTAP无效细胞与MTAP WT细胞中有效且选择性的化合物。该系列从高通量生物化学筛选开始，并以基于配体和结构的药物设计为指导，产生了TNG908，其Tanimoto系数相对于原始筛选为0.3。仅添加83Da，没有额外的可旋转键，并且在LogD中测量的亲脂性降低（2.4比2.8），同时保持高渗透性、低流出和高Kp、uu、CSF=0.9，从而使效价增加了近2000倍。[1]

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TNG908 对 MTAP 缺失的癌细胞相对于 MTAP 正常的细胞表现出强效的选择性，对 MTAP 缺失细胞系的选择性比同基因 MTAP 野生型细胞高 15 倍 。在无细胞酶学实验中，MTA 的存在使 TNG908 的效力提高约 12 倍（有 MTA 时 IC50 = 21.2 ± 9.3 nM，无 MTA 时为 262 ± 52 nM）。在测量对称二甲基精氨酸水平的细胞实验中，TNG908 抑制 PRMT5 的 IC50 为 0.009 μM 。该化合物在代表多种组织学类型的 MTAP 缺失癌细胞系中表现出强效活性，其疗效没有组织学偏倚的证据 。在 HAP1 MTAP 野生型和 MTAP 缺失细胞系中，TNG908 处理显示出对 MTAP 缺失细胞的选择性抗增殖活性 。

TNG908在小鼠异种移植物模型中口服给药时显示出选择性抗肿瘤活性，其理化性质适合穿过血脑屏障（BBB），支持治疗MTAP缺失的中枢神经系统和非中枢神经系统肿瘤的临床研究。 TNG908在物种间具有低至中等清除率和中至高生物利用度，在一组异种移植物模型（包括代表胶质母细胞瘤和非小细胞肺癌癌症的模型）中具有很强的功效，在结直肠癌癌症模型中具有体内选择性功效。TNG908被提名为开发候选药物，目前正在进行I/II期临床研究（NCT05275478）。[1]

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TNG908 在代表多种肿瘤组织学类型（包括胶质母细胞瘤、膀胱癌、胆管癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴瘤和白血病）的 MTAP 缺失异种移植模型中表现出剂量依赖性的抗肿瘤活性 。在 120 mg/kg 每日两次的剂量水平下，约 30% 的 MTAP 缺失模型观察到持久的肿瘤消退 。在胶质母细胞瘤皮下 CDX 模型中，TNG908 诱导了显著的抗肿瘤活性，并通过药效学评估证明了强效的 PRMT5 抑制 。在原位胶质母细胞瘤模型中，TNG908 治疗显著降低了生物发光信号并延长了治疗小鼠的生存期 。重要的是，在代表非小细胞肺癌和胶质母细胞瘤的患者来源异种移植模型中，即使停止给药，持久的肿瘤消退仍然维持，表明单药 TNG908 治疗在这些模型中实现了治愈 。TNG908 还在来自接受过三线既往治疗的非小细胞肺癌 PDX 模型中显示出疗效，表明经过重度预处理的肿瘤对 TNG908 同样有反应 。

生化荧光各向异性肽置换法/Biochemical Fluorescence Anisotropy Peptide Displacement Assay[1]
建立了荧光各向异性（FA）测定法来测量C末端5′-TAMRA标记的组蛋白H4肽（1-21）与PRMT5/MEP50的结合。测试化合物与肽竞争以结合PRMT5/MEP50蛋白。测定缓冲液：30mM Bicine（pH 8.0）、150mM NaCl、1.5mM DTT、0.003%Tween-20。用于这些研究的两种肽是Me0:Ac-SGRGKGGLGKGGAKRHRKV-K（5-TAMRA）-NH2和Me2:Ac-SGR（Sym-Me2）GKGGKGLGGAKRHRkV-K（5-TAMRA）-N H2。Me0肽不是甲基化的，用于在不存在辅因子和存在50μM 5′-甲硫腺苷（MTA）的情况下测定化合物的效力。Me2肽在精氨酸3处对称甲基化，并用于测定在50μM S-腺苷-1-甲硫氨酸（SAM）存在下的化合物效力。通过测量固定浓度的肽从PRMT5/MEP50的剂量依赖性位移，在平衡时评估抑制剂效力。在RT下孵育30分钟后，在Envision平板读取器上读取平板。对于数据分析，检测到的荧光各向异性（FA）等于1000×（S–G×P）/（S+G×2×P），其中S=检测器2或通道2信号，P=检测器1或通道1信号，G=G因子。使用抑制百分比=（signal–MinAVG）/（MaxAVG–MinAVG）×100将荧光各向异性标准化为抑制百分比，其中MinAVG=最小值的平均值，MaxAVG=最大值的平均数值。使用具有固定0%和100%抑制极限的4参数逻辑模型205 y=a+（（B–a）/（1+（（C/x）∧D）），通过XL拟合将曲线拟合为抑制百分比与log[化合物浓度]，以计算IC50。A： 底部=0%。B： top=100%。C： 相对IC50。D： 山坡。TNG908的表观Ki值是使用竞争抑制剂的Cheng–Prusoff方程计算的。

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TNG908 的结合亲和力和 MTA 协同性机制使用纯化的 PRMT5 酶通过无细胞生化实验进行评估。在存在和不存在 MTA 的情况下分别评估 TNG908 的效力，以确定 MTA 协同性结合效应。在这些实验中，TNG908 在 MTA 存在下的 IC50 比无 MTA 时提高约 12 倍（IC50 = 21.2 ± 9.3 nM，Ki = 0.26 nM），与 MTA 协同性结合机制一致 。这些无细胞实验表明 TNG908 选择性地结合在 MTAP 缺失癌细胞中积累的非活性 PRMT5·MTA 复合物 。

HAP1 MTAP WT和MTAP无效的细胞内蛋白质测定[1]
从Horizon Discovery（HZGHC004894c005）获得HAP1-MTAP等基因细胞系对，并在湿润的10%CO2组织培养箱中保持在DMEM（高糖）+10%FBS中。SAM协同PRMT5抑制剂GSK3326595保持为10mM DMSO储备。将所有测试化合物保持为10mM DMSO储备物。[1]
第0天，将MTAP WT或MTAP无效细胞接种在384孔板中，并在湿润的5%CO2组织培养箱中孵育16-24小时。第1天，使用帝肯D300e数字分配器（n=4）将受试化合物以规定浓度分配到孔中，并将DMSO的体积标准化为最高级别体积。每一个平板包括给药了规定浓度的GSK3326595作为平板对照的孔。将化合物与细胞在湿润的5%CO2组织培养箱中孵育24小时。 在第2天，用4%甲醛的最终浓度固定化合物处理的细胞。然后用1×PBS+0.1%Triton X-100洗涤/透化细胞，然后用5%山羊血清/1×TBS封闭。然后将固定的细胞与初级SDMA抗体混合物在4°C下孵育过夜。[1]
在第3天，用1×PBS+0.1%Triton X-100洗涤细胞，然后在室温下用同样含有DRAQ5的NIR荧光第二抗体混合物孵育1小时。用1×PBS+0.1%Triton X-100洗涤细胞，然后再次用ddH2O洗涤。然后使用NIR荧光成像器对板进行成像。[1]
为了进行数据分析，将SDMA信号归一化为DRAQ5信号。测定背景由用1μM GSK3326595处理的孔的信号确定，并从每个孔中减去。数据分别绘制为MTAP WT和MTAP空细胞系的DMSO对照孔的百分比，并拟合到4参数logistic（4-PL）Hill方程，最大效应限制为0。作为定制数据分析协议的一部分，使用GraphPad Prism或Domatics Studies 5.4中的默认IC50拟合程序进行拟合。

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HAP1 MTAP WT和MTAP无效生存能力测定[1]
从Horizon Discovery（HZGHC004894c005）获得HAP1-MTAP等基因细胞系对，并将其保持在DMEM（高糖）+10%FBS中的湿润5%或10%CO2组织培养箱中。将所有测试化合物保持为10mM DMSO储备。[1]
在第0天，将MTAP WT和MTAP无效细胞接种在96孔板中，并在5%或10%的湿润CO2组织培养箱中孵育16-24小时。在第1天，使用帝肯D300e数字分配器（n=3）将受试化合物以规定浓度分配到孔中，并将DMSO的体积标准化为最高级别体积（0.2%）。将化合物处理的平板在湿润的5%或10%CO2组织培养箱中培养7天。[1]
在第7天，将板从组织培养箱中取出，并使其平衡至室温。然后，将1/2体积的CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂添加到每个孔中，或者从每个孔中去除培养基，并添加1×PBS中1:3稀释的CellTiter Glo 2.0细胞活力测定剂。添加后10分钟，Envision读板器检测发光信号。数据分别绘制为MTAP WT和MTAP空细胞系的DMSO对照孔的百分比，并拟合到4参数logistic（4-PL）Hill方程，最大效应限制为0。作为定制数据分析协议的一部分，使用GraphPad Prism或Domatics Studies 5.4中的默认IC50拟合程序进行拟合。

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TNG908 的体外细胞实验使用 MTAP 缺失和同基因 MTAP 野生型癌细胞系进行。对于细胞 PRMT5 抑制实验，细胞用 0 至 10 μM 浓度的 TNG908 处理 24 小时，并测量对称二甲基精氨酸水平作为 PRMT5 活性的药效学读数和 TNG90 。在这些细胞实验中，该化合物对 PRMT5 的 IC50 为 0.009 μM 。通过比较 TNG908 在 MTAP 缺失与 MTAP 野生型细胞系中的抗增殖效应来评估选择性，结果显示对 MTAP 缺失癌细胞具有 15 倍的选择性 。在代表多种组织学类型（包括胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、胆管癌、间皮瘤、淋巴瘤和白血病）的癌细胞系 panel 中评估了细胞活力，TNG908 的疗效没有组织学偏倚的证据 。

体内药理学[1]
所有实验方案均经北京药明康德（Pharmaron）机构动物护理和使用委员会批准，并遵循实验动物评估和认证协会（AAALAC）的指导原则。
适应环境7天后，将1000万个LN-18、LU99、HCT116 MTAP WT或HCT116 MTAP-null肿瘤细胞皮下注射到每只动物的右侧腹部。待肿瘤体积达到200–300 mm³时，将动物随机分组。TNG908以5% DMA/20% Captisol溶液配制，每日两次灌胃给药。使用游标卡尺测量肿瘤体积，并计算公式为（长×宽×宽）/2。
数据分析中，肿瘤生长抑制率（TGI）的计算公式如下：% TGI = [1 – (平均治疗组最终肿瘤体积 – 平均治疗组初始肿瘤体积)/(平均对照组最终肿瘤体积 – 平均对照组初始肿瘤体积)] × 100。肿瘤消退率的计算公式如下：% 肿瘤消退率 = [平均肿瘤体积 – 平均初始肿瘤体积] × 100。

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Western Blotting[1]
使用RIPA裂解缓冲液裂解冷冻肿瘤组织，制备蛋白裂解液。使用Pierce Rapid Gold BCA蛋白测定试剂盒对样品进行蛋白浓度标准化。使用Invitrogen NuPAGE 4–12% Bis-Tris Midi蛋白凝胶进行SDS-PAGE电泳。抗体SDMA和ACTB的稀释度为1:1000。

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TNG908 的体内药效学研究使用代表多种肿瘤组织学类型的 MTAP 缺失异种移植模型进行。对于皮下异种移植研究，携带已建立的 MTAP 缺失肿瘤的免疫缺陷小鼠口服给予 TNG908，剂量范围为 1 至 120 mg/kg，通常每日两次给药 。使用数字卡尺定期测量肿瘤体积，并计算肿瘤生长抑制率。在最后一次给药后 16 小时收集肿瘤组织进行药效学分析，通过 SDMA 水平评估 PRMT5 抑制 。对于原位胶质母细胞瘤研究，U87MG 细胞通过颅内植入，通过生物发光成像监测肿瘤负荷；使用 Kaplan-Meier 分析评估生存期 。在一项脑穿透性研究中，食蟹猴（每组 3 只）单次口服 10 mg/kg TNG908，测量血浆和脑脊液中的游离药物浓度 。对于犬的药代动力学研究，TNG908 通过口服和静脉两种途径给药，以确定清除率和生物利用度 。

TNG908 是一种口服生物可利用的化合物，在临床前物种中表现出脑穿透性 。在一项食蟹猴研究中，口服 10 mg/kg TNG908 后，该化合物在血浆和脑脊液中均可检测到，表明其具有有效的血脑屏障穿透能力 。在犬中，使用已验证的 UPLC-MS/MS 方法测定 TNG908 在口服和静脉给药后的药代动力学参数。该化合物表现出低清除率（3.7 ± 0.8 mL/min/kg）和大于 36.4% 的中等口服生物利用度 。UPLC-MS/MS 方法在 1-1000 ng/mL 的浓度范围内表现出优异的线性，相关系数大于 0.995，提取回收率超过 80% 。对于储存，TNG908 粉末在 -20°C 下稳定 3 年，在 4°C 下稳定 2 年；溶剂中的储备液在 -80°C 下稳定 6 个月，在 -20°C 下稳定 1 个月 。TNG908 在 DMSO 中的溶解度为 85 mg/mL 。TNG908 的分子量为 409.5 g/mol，分子式为 C21H23N5O2S 。

TNG908 采用 MTA 协同性机制设计，实现对 MTAP 缺失癌细胞中 PRMT5 的选择性抑制，同时保护 MTAP 正常的正常细胞。这种机制预计将相对于缺乏肿瘤选择性和表现出剂量限制性血液学毒性的第一代 PRMT5 抑制剂产生更大的治疗指数 。在临床前毒理学研究中，该化合物已显示出与其选择性机制一致的良好安全性特征 。根据材料安全数据表，TNG908 被分类为非危险物质或混合物 。在正在进行的 I/II 期临床试验中，治疗资格要求足够的基线器官功能，包括血红蛋白 ≥9 g/dL、绝对中性粒细胞计数 ≥1,500/μL、血小板计数 ≥75 × 10⁶/mL、总胆红素 ≤1.5 × ULN、AST/ALT ≤2.5 × ULN（或有肝转移时 ≤5 × ULN）以及肌酐清除率 ≥45 mL/min，表明血液学和肝脏毒性作为潜在不良事件进行监测 。由于产品组合优先级的调整，该研究目前不再招募新患者 。

[1]. Discovery of TNG908: A Selective, Brain Penetrant, MTA-Cooperative PRMT5 Inhibitor That Is Synthetically Lethal with MTAP-Deleted Cancers. J. Med. Chem. 2024, 67, 8, 6064–6080.
[2]. TNG908 is a brain-penetrant, MTA-cooperative PRMT5 inhibitor for the treatment of MTAP-deleted cancer.MOLECULAR TARGETED AGENTS 2| VOLUME 174, SUPPLEMENT 1, S84, OCTOBER 2022.

TNG908 是一种蛋白质精氨酸甲基转移酶 5 (PRMT5) 的小分子抑制剂。

C21H23N5O2S

409.50462269783

409.16

C, 61.59; H, 5.66; N, 17.10; O, 7.81; S, 7.83

2760481-53-4

164753116

Typically exists as white to off-white solids at room temperature

3.2

129Ų

2

6

2

29

620

2

C(N1C[C@H](CC[C@@H]1C1=CC=C2SC=NC2=C1)C)(=O)C(=O)NC1=CN=C(C(=C1)C)N

NXXBDYHMHHINFC-YVEFUNNKSA-N

InChI=1S/C21H23N5O2S/c1-12-3-5-17(14-4-6-18-16(8-14)24-11-29-18)26(10-12)21(28)20(27)25-15-7-13(2)19(22)23-9-15/h4,6-9,11-12,17H,3,5,10H2,1-2H3,(H2,22,23)(H,25,27)/t12-,17+/m0/s1

N-(6-amino-5-methylpyridin-3-yl)-2-((2R,5S)-2-(benzo[d]thiazol-5-yl)-5-methylpiperidin-1-yl)-2-oxoacetamide

TNG908; A1AAV; SCHEMBL24365689; TNG 908; 2760481-53-4; Ralometostat; CHEMBL5573027; TNG-908

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~244.2 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。