| 规格 | 价格 | |
|---|---|---|
| 1mg | ||
| 5mg | ||
| 10mg | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
EZH2; Hippel-Lindau (VHL) or cereblon (CRBN)
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|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
YM181和YM281通过vhl依赖性泛素-蛋白酶体系统降解EZH2蛋白[1]
如图3A所示，在24 h内，YM181和YM281均以浓度依赖的方式消除了EZH2蛋白水平和H3K27me3度，且对EZH2同源EZH1蛋白水平无显著影响（图3B和S2）。当浓度为2 μM时，降解效果达到80%。时间过程研究表明，EZH2降解可以在2 h内检测到，并且在4 h时达到最大值（图3C）。据报道，在没有任何核心亚基的情况下，PRC2复合体会崩溃。为了测试EZH2降解物对PRC2复合物的影响，我们在2 μM的YM181处理的SU-DHL-2和22Rv1细胞中检测了另外两个亚基EED和SUZ12的蛋白水平（图3D）。在24 h内，YM181显著降低了EED和SUZ12的水平。结果表明，YM181和YM281快速删除EZH2蛋白，从而导致PRC2复合物因完整性丧失而不稳定。（25,37,38）另外，EZH2附近的EED和/或SUZ12也可能被EZH2- protac介导的三元络合物泛素化。在接下来的实验中，如图3E所示，可以通过添加蛋白酶体抑制剂MG132或MLN-4924来恢复YM181的降解效果，MLN-4924是激活VHL E3连接酶系统所必需的类化修饰抑制剂。同时，EZH2抑制剂EPZ6438与YM181竞争占据催化口袋，从而阻止蛋白质降解。此外，合成的VHL配体VH032的加入也逆转了YM181引起的EZH2降解。为了进一步证实VHL对ym181诱导的EZH2降解的要求，我们在22Rv1细胞中通过sirna敲低VHL。VHL敲除细胞暴露于YM181并没有降低EZH2蛋白水平，而EZH2蛋白在对照细胞中已经大量降解（图3F）。此外，Co-IP实验清楚地显示，YM181和YM281介导的EZH2泛素化显著增加，而12 h内全蛋白水平下降（图3G）。这些结果证实了这两种化合物对EZH2的降解确实与vhl依赖性泛素-蛋白酶体系统有关。 <人力资源> EZH2降解剂在淋巴瘤细胞株中表现出比EPZ6438更强的抗癌作用[1] 鉴于EZH2抑制剂对DLBCL的干预有效，EZH2降解剂的抗癌作用首先在三种DLBCL细胞系SU-DHL-2、SU-DHL-4和SU-DHL-6中进行了测试。MTS实验证实，在所有三种细胞系中，YM181和YM281都比EPZ6438更强烈地导致细胞活力下降（图4A）。与EPZ6438相比，YM181和YM281可以诱导几乎完全的细胞活力抑制，尽管它们的初始有效浓度略高。同时，EPZ6438对SU-DHL-2和SU-DHL-4的抑制作用仅为一半，对SU-DHL-6的抑制作用为70%。此外，所有其他对EZH2抑制剂耐药的淋巴瘤细胞系也显示出对EZH2降解剂的完全应答（图S3A）。Western blot分析进一步证实，YM181诱导EZH2大量降解（图4B和S3B，C）。EPZ6438在低纳摩尔浓度下可显著降低H3K27me3水平，而YM181则需要高剂量。连接体和VHL配体基序的安装都可能导致EZH2抑制活性丧失，这解释了EZH2降解剂需要更高的起效浓度的原因。为了研究连接体和VHL配体战斗部是否会带来脱靶效应，我们还评估了结构相似但不诱导EZH2降解的V6和V7的细胞抑制作用。V6和V7都没有引起明显的细胞活力抑制（图S3D，E）。同时，我们合成了YM281的异构体YM620，它改变了羟基脯氨酸的两个立体中心，降低了对VHL的结合亲和力（图S3F）。实际上，YM620对EZH2蛋白水平没有明显的影响，但却能显著抑制EZH2酶活性（图S3G）。与YM281相比，YM620在两种测试的癌细胞系中具有较弱的抗增殖能力（图S3H）。所有这些数据都排除了EZH2降解剂的脱靶效应。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
EZH2降解剂体内抑制肿瘤生长并降低原发性淋巴瘤患者细胞的细胞活力[1]
为了研究EZH2降解物在体内的抗肿瘤活性，我们首先建立了DLBCL细胞系SU-DHL-6的异种移植小鼠模型。与体外实验结果一致，YM281 （80 mg/kg）腹腔注射，每周6次，连续3周显著抑制肿瘤体积（图5A）。然而，当EPZ6438与YM281 （42.5 mg/kg）的摩尔剂量相等时，EPZ6438无效。EPZ6438和YM281均未引起小鼠明显的体重减轻（图S5A）。肿瘤组织Western blot分析显示，YM281显著降低EZH2蛋白和H3K27me3水平（图5B）。EPZ36438虽然能显著降低H3K27me3水平，但不能阻止肿瘤的生长，说明酶促抑制EZH2可能不足以在体内减弱淋巴瘤细胞。在肿瘤切片中，免疫组化进一步证实了YM281诱导EZH2的显著不稳定和肿瘤增殖抑制（Ki67染色）（图5C）。在套细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1小鼠异种移植模型中验证了DLBCL的体内抗癌效果（图5D-F和S5B）。更重要的是，YM281处理小鼠的肿瘤重量与EZH2蛋白水平明显相关（图S5C，D）。最后，为了评估EZH2降解剂在所有不同淋巴瘤细胞系中都有良好疗效的潜在临床意义，如图S3A所示，我们从各种淋巴瘤患者样本中提取原发淋巴瘤细胞进行进一步的测试。首先，EZH2降解剂YM281在一名DLBCL患者的原代细胞中诱导剂量依赖性EZH2降解（图5G和表S1）。此外，我们还对11例淋巴瘤患者（包括2例BLBCL）的淋巴瘤原代细胞进行了YM281的疗效检测。与EPZ6438相比，YM281增加了caspase-3和-7的活性，同时在三磷酸腺苷（ATP）检测中观察到细胞活力降低（图5H， 1）。 |
| 细胞实验 |
细胞活力测定[1]
正如我们之前报道的那样，用MTS法测定细胞活力。 细胞周期与凋亡[1] 采用流式细胞术检测细胞周期，采用商业细胞周期分析试剂盒。根据商业细胞凋亡分析试剂盒（BD, Franklin Lakes， NJ），流式细胞术检测Annexin-V和碘化丙啶的凋亡分析。Caspase-3/7的活性通过Caspase-Glo 3/7测定法根据制造商的说明进行评估。 细胞ATP的测定 [1] 根据制造商的说明，使用基于ATP的CellTiter-Glo发光细胞活力试剂盒检测细胞ATP浓度。 Western Blot [1] 细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，然后用蛋白酶抑制剂鸡尾酒在裂解缓冲液中裂解。用比辛胆酸（BCA）蛋白测定法将蛋白浓度归一化后，用标准十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品，并将样品转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。随后，用5%的牛奶在室温下阻断膜1小时，然后在4°C下用指示的第一抗体进行印迹过夜。用TBST（含0.1% Tween-20的tris缓冲盐水）洗涤后，用辣根过氧化物酶偶联的二抗在rt下探针1小时。利用增强化学发光进行信号检测。 免疫组织化学[1] 肿瘤取材于福尔马林，脱水后包埋于石蜡中。然后将组织切片去蜡，水化，并用PBS冲洗。在柠檬酸缓冲液中煮沸4-6分钟用于抗原提取后，用3% H2O2在室温下进行过氧化物阻断20分钟。切片与EZH2、H3K27me3和Ki67 （Abcam）一起孵育，按照建议的浓度在37℃下孵育过夜。然后，用二抗在37℃下探针1 h。所有载玻片用3,3 ' -二氨基联苯胺染色，苏木精反染色。 免疫沉淀反应[1] 使用含有蛋白酶抑制剂混合物的NP40收集细胞。30min后，细胞裂解液4000g在4℃下离心15min，上清液与EZH2抗体或IgG在4℃下孵育过夜。随后用蛋白A/ g包被的琼脂糖珠在4℃下继续孵育3小时。用冰冷的NP40洗涤6次后，800g离心2 min，取上清，用免疫印迹上样缓冲液在95℃下分离5 min。收集上清液，SDS凝胶分离后进行免疫印迹分析。 Caco-2细胞通透性测定[1] 将Caco-2细胞以2 × 105个/孔的密度接种到聚碳酸酯12孔Transwell过滤器上。用21天获得的融合单层来评估体外通透性。每2天更换一次根尖室和基底外侧室的培养基，用荧光素检测单层的完整性。实验前，用预热好的汉克平衡盐溶液（HBSS）代替两个培养室的培养基。37℃稳定培养30分钟。为了进行渗透研究，在根尖侧加入0.2 mL用HBSS稀释的药物制剂，基底侧替换为1 mL新鲜HBSS。处理后的细胞在37±0.5℃下孵育。从基底外侧腔室取50 μL样品，分别于1、2、3 h用50 μL新鲜HBSS置换，蒸发后用甲醇重组，用液相色谱-质谱法测定样品中药物的浓度。计算各剂型ETP的表观渗透性（Papp），其中dQ/dt为药物累积渗透随时间的斜率（μg/s）， A为单层的表面积（1.12 cm2）， V为基底侧HBSS的体积（1ml）， C0为根尖侧化合物的初始浓度（μg/mL）。 |
| 动物实验 |
The animal experiment was conducted in compliance with a protocol approved by the Institutional Animals Care and Use Committee of Sun Yat-sen University Cancer Center and was carried out in the Center of Experiment Animal of Sun Yat-sen University (North Campus, approval no.: L102012019050K). Balb/c nude mice (female) were bought from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. For SU-DHL-6 xenografts, and five million cells were injected subcutaneously. After 2 weeks, when tumors reached 100–200 mm3, mice were randomly divided into three groups (6 mice per group) and administrated with a vehicle control (80% PBS, 10% castor oil, and 10% DMSO) or indicated doses of compounds (YM281: 80 mg/kg; EPZ6438: 42.5 mg/kg) through intraperitoneal injection 6 times weekly. Tumor sizes and animal weights were measured 2–3 times per week. The mice were sacrificed after 3 weeks’ drug administration, and the tumor tissue was harvested for analyses. For Jeko-1 xenografts, two million cells were injected subcutaneously. Ten days later, most of the tumors grow about 100 mm3, mice were then randomly divided into three groups (5 mice per group), and intraperitoneally administrated daily with the control (70% PBS, 20% castor oil, and 10% DMSO) or indicated doses of compounds (YM281: 100 mg/kg; EPZ6438: 50 mg/kg). Tumor sizes and animal weights were measured every 3 days. The mice were sacrificed after 30 days’ drug treatment, and then the tumor tissue was harvested for analyses.[1]
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| 参考文献 | |
| 其他信息 |
传统的EZH2抑制剂旨在抑制酶促甲基化活性，但由于EZH2在癌症发展中具有非酶促功能，其治疗应用可能存在局限性。本文报道了一种基于蛋白水解靶点嵌合体（PROTAC）的EZH2降解剂，用于靶向淋巴瘤中的整个EZH2蛋白。我们设计并合成了两系列EZH2降解剂，分别劫持含有von Hippel-Lindau (VHL)或cereblon (CRBN)的E3连接酶系统。部分基于VHL的化合物能够介导EZH2的降解。其中，两种效果最佳的降解剂YM181和YM281在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和其他亚型淋巴瘤中均能显著抑制细胞活力，其疗效优于临床常用的EZH2抑制剂EPZ6438（tazemetostat），后者仅对DLBCL有效。 EZH2降解剂在淋巴瘤异种移植模型和患者来源的原发性淋巴瘤细胞中均展现出良好的抗肿瘤活性。我们的研究表明，EZH2降解剂的治疗活性优于EZH2抑制剂，这可能为淋巴瘤的治疗提供一种潜在的抗癌策略。[1]
在这项研究中，EZH2抑制剂的治疗效果仅限于所测试的淋巴瘤细胞系中的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系（图1A）。我们想知道是否可以通过PROTAC技术开发直接降解EZH2的方法，以提高其对其他类型淋巴瘤细胞的靶向能力。在本研究中，我们开发了基于PROTAC的EZH2降解剂，并在体外和体内研究了其对不同类型淋巴瘤的EZH2降解效率和治疗效果。我们的研究表明，只有VHL靶向化合物才能通过7或9个原子长度的合适连接基团实现EZH2的降解。与亲本 EZH2 抑制剂 EPZ6438 相比，我们筛选出的两种最佳 EZH2 降解剂 YM181 和 YM281 能选择性地降解 EZH2 而非 EZH1，并且在弥漫性大B细胞淋巴瘤 (DLBCL) 和其他类型的淋巴瘤细胞系中均表现出有效的抗增殖活性。此外，在有效剂量下，EZH2 降解剂在淋巴瘤异种移植模型中显示出抑制体内肿瘤生长的明显优势，且无明显毒性。然而，YM281 和 YM181 在低浓度下对 EZH2 的降解不完全，且抑制细胞活力的效力也相对较低，这表明仍有进一步优化的空间。未来，或许有必要对与 YM181 和 YM281 具有相同连接长度的不同连接骨架进行构效关系研究，以获得更有效的 EZH2 降解剂。同时，一些癌细胞，例如胰腺癌细胞AsPC1和肺癌细胞NCI-H460，其肿瘤发生可能并不依赖EZH2，尽管YM181和YM281能够降低这些细胞的EZH2水平（图S6）。通过Caco-2细胞的细胞渗透性测定，YM181和YM281的表观渗透能力均显著低于其母体EZH2抑制剂EPZ6438（表S2），表明需要通过进一步的结构优化来提高其口服生物利用度。总而言之，我们的结果表明，EZH2降解剂在治疗淋巴瘤方面可能比EZH2抑制剂具有更好的治疗潜力。我们正在研究EZH2降解剂的确切作用机制及其在其他癌症中的应用。[1] |
| 分子式 |
C34H43N3O7
|
|---|---|
| 分子量 |
605.721129655838
|
| 精确质量 |
605.31
|
| CAS号 |
2750350-39-9
|
| PubChem CID |
166176920
|
| 外观&性状 |
Yellow to brown solid powder
|
| LogP |
4.5
|
| tPSA |
126
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
3
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
8
|
| 可旋转键数目(RBC) |
14
|
| 重原子数目 |
44
|
| 分子复杂度/Complexity |
1050
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| SMILES |
C(O)(=O)COCCCOC1=CC=C(C2=CC(N(CC)C3CCOCC3)=C(C)C(C(NCC3=C(C)C=C(C)NC3=O)=O)=C2)C=C1
|
| InChi Key |
CLDOGTJZRUKKBD-UHFFFAOYSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C34H43N3O7/c1-5-37(27-11-15-42-16-12-27)31-19-26(25-7-9-28(10-8-25)44-14-6-13-43-21-32(38)39)18-29(24(31)4)33(40)35-20-30-22(2)17-23(3)36-34(30)41/h7-10,17-19,27H,5-6,11-16,20-21H2,1-4H3,(H,35,40)(H,36,41)(H,38,39)
|
| 化学名 |
2-[3-[4-[3-[(4,6-dimethyl-2-oxo-1H-pyridin-3-yl)methylcarbamoyl]-5-[ethyl(oxan-4-yl)amino]-4-methylphenyl]phenoxy]propoxy]acetic acid
|
| 别名 |
Tazemetostat de(methylene morpholine)-O-C3-O-C-COOH; 2750350-39-9;
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ≥ 160 mg/mL (264.15 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 1.6509 mL | 8.2546 mL | 16.5093 mL | |
| 5 mM | 0.3302 mL | 1.6509 mL | 3.3019 mL | |
| 10 mM | 0.1651 mL | 0.8255 mL | 1.6509 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
BI-9466
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(Rac)-NSD2-PWWP1-IN-4
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