| 规格 | 价格 | |
|---|---|---|
| 500mg | ||
| 1g | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
CBFβ SMMHC-RUNX1
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|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
为了开发CBFβ-SMMHC功能的靶向抑制剂，我们使用先前描述的荧光共振能量转移（FRET）测定法，用Venus-CBFβ-SSMHC代替Venus-CBFb（图S1），以筛选美国国立癌症研究所，NIH，Diversity Set中抑制CBFβ/SMMHC与RUNX1 Runt结构域结合的化合物。该筛选确定了活性化合物AI-4-577，其50%抑制浓度（IC50）为22μM，而缺乏甲氧基官能团的衍生物AI-4-88是无活性的（表1）。小分子结合后，蛋白质核磁共振（NMR）光谱中化学位移的变化是确认与蛋白质结合的有力方法。我们记录了具有CBFβ和Runt结构域的AI-4-57的二维2D 15N-1H异核单量子相干（HSQC）光谱和1D饱和转移差（STD）NMR实验。Runt结构域没有观察到相互作用，但我们可以证明，在添加AI-4-57后，CBFβ的HSQC光谱发生了化学位移扰动（图1A），在添加无活性衍生物AI-4-88后没有变化（图S2），这表明该化合物与CBFβ结合。骨架和两个芳香侧链[位置113（W113）的色氨酸和位置96（Y96）的酪氨酸]中的化学位移扰动表明，该化合物在空间上靠近CBFβ的位点结合，但不在CBFβ上的蛋白质相互作用表面上结合，也就是说，它以变构方式抑制结合[1]。
CBFβ-RUNX结合小分子抑制剂与CBFβ结合的初步研究[2] 我们最近报道了2-吡啶基苯并咪唑AI-4-57作为一种化合物，它与CBFβ-SMMHC融合蛋白的CBFβ部分结合，并抑制其与RUNX蛋白Runt结构域的结合（Illundula等人，2015）。使用我们之前描述的用于CBFβ氨基酸1-141部分与Runt结构域结合的FRET测定法（Gorczynski等人，2007），我们表明该化合物也是野生型CBFβ与RUNX1 Runt结构区结合的适度效力抑制剂（见图1，表3）。为了开发更有效的类似物用作探针RUNX和CBFβ蛋白功能的工具化合物，我们合成了一个AI-4-57类似物库，并对其活性进行了表征。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
对AI-4-57的药代动力学特性的分析表明，该化合物在小鼠血浆中的半衰期较短（t½=37分钟）（图S5），甲氧基官能团的甲基损失是主要代谢产物。三氟甲氧基（CF3O）取代已被证明反应性较低，因此我们用这种取代合成了AI-10-47。FRET测量表明，这种取代实际上增强了单价化合物的活性（表1）。肝微粒体稳定性的测量表明，AI-10-47降低了代谢责任，因此证明了二价衍生物AI-10-49的合成是合理的（表1）。AI-10-49是强效的（FRET IC50=260nM）（表1）[等温滴定量热法（ITC）测量得出解离常数（KD）=168 nM]（图S6），改善了体内药代动力学特性（t½=380min）（图S5），与母体质子化二价化合物AI-4-83（IC50约为3μM）相比，对ME-1细胞生长的抑制活性增强（IC50=0.6 mM）（图1F）（图1E）。请注意，AI-10-49在正常人骨髓细胞中显示出可忽略的活性（IC50>25μM）（图1G），这表明了一个强大的潜在治疗窗口。在11种人类白血病细胞系中，ME-1细胞是唯一对AI-10-49高度敏感的细胞系[1]。
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| 酶活实验 |
Docking[2]
在网格生成中，在对接选项卡下，我们将该位点用作蛋白质中结合位点残基的质心。通过蛋白质与AI-4-57结合的15N-1H和13C-1H HSQC NMR实验中的化学位移扰动来确定活性位点残基。选择以下残基进行网格生成：V86、L88、R90、E91、Y96、K98、A99、K111、G112、W113、M122、G123、C124。对接是使用虚拟筛选工作流框架进行的。所有化合物都灵活对接，对接后，100%具有所有良好状态的最佳化合物由MM-GBSA评分。 CBFβ突变蛋白[2] 野生型CBFβ（1-141）和CBFβ突变体R90E、K98E和K111E在15N标记的最低培养基中于15°C下表达。使用Ni-NTA柱纯化蛋白质，用rTev蛋白酶消化过夜，然后进行尺寸排阻色谱以去除亲和标签和杂质。将150μM的蛋白质样品透析，插入核磁共振缓冲液中，用600μM AI-4-57滴定。所有15N-1H HSQC都记录在配备有冷冻探针的布鲁克800 MHz NMR光谱仪上。 核磁共振波谱[2] 所有基于NMR的实验都是使用CBFβ（1-141）溶液在含有50 mM KPi、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、0.01%（w/v）叠氮化钠、5%（v/v）DMSO和5%（v/v）D2O的缓冲液中获得的，最终pH值为7.5。所有实验均在配备CryoProbe™的Bruker 18.8 T光谱仪上记录在25°C下浓缩至0.5 mM的均匀标记的15N CBFβ样品上。所有NMR数据均使用NMRPipe进行处理。通过在100%DMSO中加入AI-4-57以产生等摩尔蛋白质化合物溶液来制备含有化合物的样品。 15N和13C化学位移扰动分别由在AI-4-57存在和不存在的情况下收集的15N-和13C-HSQC实验确定。使用先前已知的共振来分配峰，并使用CcpNMR软件套件叠加和比较光谱（Vranken等人，2005）。如袁等人（2002）所述，通过使用方程式∆15N+1HN）=| \8710》δHN|+（|∇δN|/4.69）计算加权化学位移变化（百万分之几）。0.1 ppm或更大的共振偏移被认为是显著的。 所有15N弛豫测量都是用CBFβ+AI-4-57和单独的CBFβ样品进行的。使用10、180、300、500、1300、1800和2300 ms的弛豫延迟进行15N T1实验。15N T2实验使用10、25、50、75、100、150、200、225和250 ms的弛弛豫延迟。峰值强度符合y=Ae-Bx，其中B是弛豫速率（R），使用CcpNMR确定T1和T2弛豫时间。R1和R2弛豫率是T1和T2的倒数，用于计算蛋白质与化合物和蛋白质与DMSO单独的R1*R2和R2/R1值。计算CBFβ+AI-4-57单独CBFβ样品的R1、R2、R1*R2和R2/R1值之间的差异。R1*R2变化大于两个标准差的残基，高于或低于由60%数据中位数组成的修剪平均值，被认为存在显著差异。 饱和转移差异NMR样品由200μM CBFβ、2 mM AI-4-57、10%D2O和5%DMSO组成，溶于50 mM KPi、1 mM DTT、0.1 mM EDTA、001%w/v NaN3、pH 7.5，最终体积为200μl。所有STD实验均使用600 MHz Bruker NMR光谱仪在25°C下进行，饱和时间为500、750、1000、1500和2000 ms。样品在0.4 ppm（蛋白质）和30 ppm（非共振对照）下照射，并使用MestReNova计算差谱。 |
| 动物实验 |
药代动力学研究[1]
在研究开始前，小鼠禁食至少3小时，并可自由饮水。动物饲养于12小时光照/12小时黑暗循环、温度72-74°C、相对湿度30-50%的环境中。腹腔注射给药时，将24-28克雄性C57BL/6小鼠进行人工固定，并在胸骨和耻骨之间中点（略偏离小鼠中线）的腹腔内进行注射。每次注射均使用1毫升注射器和27号针头。根据预定的时间点采集动物血液。动物用异氟烷麻醉，并通过心脏穿刺采集血液。血液立即转移至1.5毫升肝素化微量离心管中，并在4000转/分钟下离心10分钟。然后将血浆转移至干净的离心管中并冷冻保存。由于放血，动物未从麻醉中苏醒，并通过开胸手术在麻醉状态下确保死亡。该方法符合美国兽医协会（AVMA）关于安乐死的指南中关于使用放血作为安乐死手段的建议。使用PK Solutions 2.0软件对受试化合物的血浆浓度-时间数据进行非房室药代动力学分析。[1] |
| 药代性质 (ADME/PK) |
具有良好ADMET特性的抑制剂 开发可用于体内研究的实用工具化合物不仅需要优化化合物的活性，还需要优化其在体内的代谢稳定性。在我们之前关于CBFβ-SMMHC特异性小分子抑制剂的开发工作中（Illendula等人，2015），我们发现AI-4-57在小鼠体内的半衰期较短，其代谢产物是甲氧基上的甲基脱落。引入三氟甲氧基可以消除这种代谢不稳定性。在AI-4-57中引入三氟甲氧基取代基后，得到的化合物（AI-10-47）在FRET测定（见表1）和细胞活性测定（见下文）中均表现出更高的活性。将该取代基引入化合物 7a（补充图 1）后，得到抑制剂 AI-10-104，其 IC50 为 1.25 μM（表 1）。然而，以 178 mg/kg 的剂量腹腔注射（IP）卡普替索制剂给小鼠服用 AI-10-104 后，小鼠在 30 秒内即出现显著的镇静作用，并在约 1 小时内恢复；而以 200 mg/kg 的剂量注射纳米颗粒制剂则在约 3.5 小时内致死。我们推测这种效应是由脱靶活性引起的，因此设计了其他类似物（AI-12-126、AI-14-55 和 AI-14-91，见表 1），在吡啶环上连接吗啉环取代基，从而改变了化合物的结构和极性。这些化合物在FRET检测中保持了与母体化合物相似的活性（见表3）。重要的是，AI-12-126和AI-14-91与captisol配制成盐酸盐，并以100 mg/kg的剂量腹腔注射给药时，不会像AI-10-104那样引起镇静作用，且小鼠耐受性良好。这些化合物在小鼠体内的药代动力学特性测定（见补充图2）表明，在100 mg/kg的剂量下，我们可以获得体内有效的化合物浓度和合理的半衰期（AI-14-91，灌胃给药，t1/2 = 203 min）。因此，这些衍生物是研究CBFβ和RUNX功能的可行体内研究对象。
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| 参考文献 |
[1]. Chemical biology. A small-molecule inhibitor of the aberrant transcription factor CBFβ-SMMHC delays leukemia in mice. Science. 2015 Feb 13;347(6223):779-84.
[2]. Small Molecule Inhibitor of CBFβ-RUNX Binding for RUNX Transcription Factor Driven Cancers. EBioMedicine. 2016 Jun;8:117-131. |
| 其他信息 |
急性髓系白血病 (AML) 是成人白血病中最常见的类型。在染色体倒位 inv(16)(p13q22) 的 AML 中表达的转录因子融合体 CBFβ-SMMHC（核心结合因子 β 与平滑肌肌球蛋白重链）会与野生型 CBFβ 竞争结合转录因子 RUNX1，从而扰乱造血过程中 RUNX1 的活性，并诱发 AML。目前，采用非选择性细胞毒性化疗治疗 inv(16) AML 可获得良好的初始疗效，但长期生存率有限。本文报道了一种蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂 AI-10-49 的研发，该抑制剂可选择性地与 CBFβ-SMMHC 结合，并破坏其与 RUNX1 的结合。AI-10-49 可恢复 RUNX1 的转录活性，具有良好的药代动力学特性，并能延缓小鼠白血病的进展。用AI-10-49治疗原发性inv(16) AML患者的原始细胞可诱导选择性细胞死亡。这些数据表明，直接抑制致癌的CBFβ-SMMHC融合蛋白可能是inv(16) AML的有效治疗方法，并为其他癌症的转录因子靶向治疗提供了支持。[1]
转录因子传统上一直被视为不具可行性的药物靶点，但它们具有全新的作用机制的潜力，可以更有效地解决干细胞样特性（例如自我更新和化疗耐药性），而这些特性正是导致传统化疗失败的原因。核心结合因子（CBF）是一种异二聚体转录因子，由三种RUNX蛋白（RUNX1-3）之一和一个CBFβ结合伴侣组成。CBFβ通过解除自身抑制来增强RUNX亚基的DNA结合。RUNX1和CBFβ在人类白血病中均经常发生突变。最近的研究表明，RUNX蛋白在多种上皮癌中发挥着关键作用，提示靶向该通路可能具有广泛的应用前景。为了验证这一假设，我们开发了能够与CBFβ结合并抑制其与RUNX结合的小分子。这些抑制剂能够降低RUNX1与靶基因的结合，改变RUNX1靶基因的表达，并影响细胞的存活和分化。这些抑制剂对白血病细胞以及基底样（三阴性）乳腺癌细胞均显示出疗效。这些抑制剂为探索靶向RUNX转录因子功能在其他癌症中的应用价值提供了有效的工具。[2] |
| 分子式 |
C13H12CLN3O
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|---|---|
| 分子量 |
261.71
|
| 精确质量 |
225.09
|
| 元素分析 |
C, 59.66; H, 4.62; Cl, 13.55; N, 16.06; O, 6.11
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| CAS号 |
63053-14-5
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| PubChem CID |
186762
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| 外观&性状 |
Typically exists as solid at room temperature
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| 密度 |
1.268g/cm3
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| 沸点 |
459.9ºC at 760mmHg
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| 闪点 |
164.7ºC
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| LogP |
2.633
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| tPSA |
50.8
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
1
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
3
|
| 可旋转键数目(RBC) |
2
|
| 重原子数目 |
17
|
| 分子复杂度/Complexity |
261
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
COC1=CC2=C(C=C1)N=C(N2)C3=CC=CC=N3
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| InChi Key |
FXXLTIFEBMOGOJ-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C13H11N3O/c1-17-9-5-6-10-12(8-9)16-13(15-10)11-4-2-3-7-14-11/h2-8H,1H3,(H,15,16)
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| 化学名 |
6-methoxy-2-pyridin-2-yl-1H-benzimidazole
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| 别名 |
AI-4-57 Hydrochloride; AI457 Hydrochloride; 63053-14-5; 6-methoxy-2-pyridin-2-yl-1H-benzimidazole; 5-methoxy-2-(pyridin-2-yl)-1h-benzimidazole; 5-Methoxy-2-pyridin-2-yl-1H-benzoimidazole; MLS001208923; SMR000503813; 5-Methoxy-2-(pyridin-2-yl)-1H-benzo[d]imidazole; 1H-Benzimidazole, 6-methoxy-2-(2-pyridinyl)-; AI 4 57 Hydrochloride; AI 4 57 HCl; AI457 HCl; AI-4-57 HCl
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 3.8210 mL | 19.1051 mL | 38.2102 mL | |
| 5 mM | 0.7642 mL | 3.8210 mL | 7.6420 mL | |
| 10 mM | 0.3821 mL | 1.9105 mL | 3.8210 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
PHPS1 Sodium
BE 2254
环胞啶硫酸盐
Azido-PEG5-acid
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