AMZ30

PME-1 (IC50 = 0.60 μM)
Protein phosphatase methylesterase-1 (PME-1, a serine hydrolase) (IC50 = 600 nM in vitro; IC50 = 3.5 µM in situ)

1. 化合物 AMZ30 在人类细胞裂解液（HEK 293T可溶性蛋白质组）中能选择性灭活PME-1，通过基于凝胶的竞争性活性蛋白质谱分析（使用氟磷酸酯-罗丹明探针）测定其IC50为600 nM。在蛋白质组中对其他丝氨酸水解酶显示出超过100倍的选择性。[1]
2. AMZ30 对PME-1的抑制很可能是共价且不可逆的，因为凝胶过滤层析后酶活性没有恢复。[1]
3. 在HEK 293T细胞可溶性蛋白质组的基于凝胶的竞争性ABPP实验中，AMZ30（浓度高达100 µM）未显示出与其他丝氨酸水解酶的交叉反应性。[1]
4. 通过Western blot分析，AMZ30 (20 µM) 能显著降低稳定过表达PME-1的HEK 293T细胞中去甲基化蛋白磷酸酶2A的水平，并增加甲基化PP2A的水平。对去甲基化PP2A的降低程度与结构无关的抑制剂1 (ABL127) 所引起的效果相似。[1]
5. 在表达基础水平PME-1的未转染HEK 293T细胞中，用AMZ30 (20 µM) 处理也能降低PP2A的去甲基化形式，其程度与用抑制剂1 (500 nM) 处理相似。[1]
6. AMZ30 (100 µM) 不会改变经处理的HEK 293T细胞可溶性蛋白质组中任何蛋白质被氯乙酰胺-罗丹明或磺酸酯-罗丹明活性探针标记的强度，表明它不是一种具有普遍硫醇反应活性的化合物。[1]

1. 丝氨酸水解酶活性竞争性ABPP实验： 将可溶性蛋白质组（例如来自HEK 293T或MDA-MB-231细胞）在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.5）中稀释至蛋白浓度为1 mg/mL。蛋白质组样品（总反应体积25 µL）首先与测试化合物（溶于DMSO）或DMSO载体对照在25°C下孵育30分钟。随后，加入氟磷酸酯-罗丹明活性探针至终浓度2 µM，标记反应在25°C下进行45分钟。然后通过加入2× SDS-PAGE上样缓冲液（还原性）终止反应。样品使用10%丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE分离。标记的丝氨酸水解酶通过平板荧光扫描仪在凝胶内可视化。与DMSO对照相比，PME-1条带荧光强度的降低表明存在抑制作用。[1]
2. IC50测定（体外）： 为测定IC50，将可溶性蛋白质组（1 mg/mL）与一系列浓度的测试化合物（一式三份）在37°C下孵育45分钟。然后样品用FP-罗丹明（2 µM）标记45分钟，进行SDS-PAGE处理，并通过凝胶内荧光扫描可视化。通过使用图像分析软件测量PME-1条带的积分光密度来量化剩余的PME-1活性百分比。通过使用适当软件拟合剂量反应数据来计算IC50值。[1]
3. 抑制可逆性实验： 将纯化的重组PME-1蛋白（500 nM，溶于PBS）与DMSO或抑制剂AMZ30 (50 µM) 在25°C下孵育30分钟。取出等份样品用于直接与FP-罗丹明标记（组分A）。将剩余的反应混合物通过尺寸排阻色谱柱（例如Sephadex G-25）以去除未结合的抑制剂。洗脱出的蛋白（组分B）然后在相同条件下与FP-罗丹明标记。两个组分均通过SDS-PAGE和凝胶内荧光扫描进行分析。与组分A相比，组分B中PME-1活性未恢复表明是不可逆抑制。[1]

1. 细胞内抑制及IC50测定： HEK 293T细胞在标准培养基中培养。将测试化合物（AMZ30）直接以不同浓度加入细胞培养介质中，细胞在37°C下孵育指定时间（例如1小时）。然后用冰PBS洗涤细胞，刮取收集，并通过离心获得细胞沉淀。细胞沉淀重悬于PBS中，超声破碎，离心获得可溶性蛋白质组部分。将此可溶性蛋白质组稀释至1 mg/mL蛋白浓度，然后进行前述“酶活性实验”部分描述的标准竞争性ABPP标记流程（使用FP-罗丹明）。根据来自化合物处理细胞的蛋白质组中PME-1条带的荧光强度生成的剂量反应曲线来确定细胞内IC50值。[1]
2. 细胞靶点选择性评估（SILAC-ABPP）： HEK 293T细胞在“轻”或“重”稳定同位素氨基酸标记培养液中生长。“轻”标记细胞用化合物AMZ30 (20 µM) 处理，“重”标记细胞用DMSO载体处理，均在37°C下处理1小时。处理后，收集细胞并制备可溶性蛋白质组。将等量（按蛋白重量计）的“轻”和“重”蛋白质组合并，并用生物素化的氟磷酸酯活性探针标记。标记的蛋白质使用链霉亲和素珠进行富集，接着进行珠上胰蛋白酶消化。所得肽段通过多维液相色谱联用串联质谱进行分析。通过量化“轻”（抑制剂处理）与“重”（对照）样本中丝氨酸水解酶肽段的相对丰度，来评估抑制剂在细胞环境下对整个丝氨酸水解酶家族的选择性。[1]
3. 通过Western Blot分析PP2A甲基化状态： HEK 293T细胞（野生型或稳定过表达PME-1）用化合物（例如AMZ30，20 µM）或DMSO处理指定时间（例如1小时）。收集细胞，通过在PBS中超声制备总细胞裂解液。裂解液在SDS-PAGE上样缓冲液中变性，通过SDS-PAGE（10%丙烯酰胺）分离，并转移至膜上进行Western blot分析。使用识别PP2A催化亚基去甲基化形式、甲基化形式或总PP2A的特异性抗体孵育膜。同时使用针对上样对照蛋白（如α-微管蛋白）的抗体。使用成像系统可视化和量化条带强度，以评估抑制剂处理后PP2A甲基化状态的变化。[1]
4. 评估化合物在细胞中对蛋白质的普遍反应性： 从用AMZ30或DMSO处理的HEK 293T细胞制备的可溶性蛋白质组，与靶向反应性半胱氨酸残基（CA-罗丹明）或其他亲核残基（SE-罗丹明）的广谱活性探针孵育。标记后，样品通过SDS-PAGE和凝胶内荧光扫描进行分析。与DMSO对照相比，抑制剂处理样品中这些探针的标记图谱没有变化，表明该化合物不会混杂地修饰蛋白质上的反应性残基。[1]

1. Compound AMZ30 (at 100 µM) did not show general reactivity towards protein nucleophilic residues (cysteines and others) in HEK 293T cell proteomes, as assessed by lack of effect on labeling by CA-rhodamine and SE-rhodamine probes, suggesting it is not a broadly toxic, thiol-reactive electrophile under the tested conditions. [1]

[1]. Discovery and optimization of sulfonyl acrylonitriles as selective, covalent inhibitors of protein phosphatase methylesterase-1. J Med Chem. 2011 Jul 28;54(14):5229-36.

2-(4-fluorophenyl)sulfonyl-3-[1-(3-nitrophenyl)sulfonyl-2-pyrrolyl]-2-propenenitrile is a sulfonamide.

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1. Background and Significance: Protein phosphatase methylesterase-1 (PME-1) regulates the methylation state of protein phosphatase 2A (PP2A), a key enzyme involved in numerous cellular processes. Altered PP2A methylation has been implicated in cancer and Alzheimer's disease, making PME-1 a potential therapeutic target. [1]
2. Compound Class and Probe Utility: AMZ30 (NIH Probe ML136) belongs to the sulfonyl acrylonitrile class of covalent inhibitors. It is structurally unrelated to the previously reported aza-β-lactam (ABL) class of PME-1 inhibitors (e.g., compound 1). This structural diversity makes AMZ30 and the ABL inhibitors valuable as a paired set of pharmacological probes to confidently attribute observed cellular effects to PME-1 inhibition and to study the role of PP2A methylation. [1]
3. Mechanism Speculation: Based on structural analogs, it is speculated that AMZ30 inhibits PME-1 via a 1,4-Michael addition mechanism, where the activated olefin serves as the electrophile for covalent attachment to the active-site serine nucleophile of PME-1. However, direct MS evidence of the adduct was not obtained, possibly due to lability during sample preparation. [1]
4. Scaffold Potential: Several analogs of the lead sulfonyl acrylonitrile scaffold showed activity against other serine hydrolases (e.g., acyl-peptide hydrolase (APEH), prolyl endopeptidase (PREP)), suggesting that further optimization of this chemical phenotype could yield selective inhibitors for other members of this large enzyme family. [1]

C19H12FN3O6S2

461.44348526001

461.015

C, 49.46; H, 2.62; F, 4.12; N, 9.11; O, 20.80; S, 13.90

1313613-09-0

1313613-09-0

44607965

Solid powder

1.5±0.1 g/cm3

724.3±70.0 °C at 760 mmHg

391.9±35.7 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.655

3.58

160

0

8

5

31

963

0

S(C1C=CC=C(C=1)[N+](=O)[O-])(N1C=CC=C1/C=C(\C#N)/S(C1C=CC(=CC=1)F)(=O)=O)(=O)=O

GUCUORSUHTZMBW-YBFXNURJSA-N

InChI=1S/C19H12FN3O6S2/c20-14-6-8-17(9-7-14)30(26,27)19(13-21)11-15-4-2-10-22(15)31(28,29)18-5-1-3-16(12-18)23(24)25/h1-12H/b19-11+

(E)-2-(4-fluorophenyl)sulfonyl-3-[1-(3-nitrophenyl)sulfonylpyrrol-2-yl]prop-2-enenitrile

AMZ-30; AMZ 30; AMZ30

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 92~100 mg/mL (199.4~216.7 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。