AZ31

ATM ( IC50 = 1.2 nM ); ATM ( IC50 = 46 nM )
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) - Wild Type (WT) (IC₅₀ = 0.03 μM, recombinant kinase assay) [2]
EGFR - T790M/L858R Double Mutation (IC₅₀ = 0.015 μM, recombinant kinase assay) [2]
EGFR - Exon 19 Deletion (IC₅₀ = 0.02 μM, recombinant kinase assay) [2]
Other Kinases (selectivity vs. EGFR T790M/L858R): HER2 (IC₅₀ = 0.8 μM), HER4 (IC₅₀ = 1.2 μM), IGFR1 (IC₅₀ = 5.6 μM), VEGFR2 (IC₅₀ = 6.3 μM), CDK2 (IC₅₀ > 10 μM) [2]

体外活性：AZ31 是一种新型、有效、口服生物可利用且可穿透血脑屏障的 ATM 抑制剂，在无细胞测定中 IC50 在 nM 范围内。经过药物筛选分析和先导化合物的精制后，它被鉴定出来。在多形性胶质母细胞瘤 (GBM) 放疗过程中抑制共济失调毛细血管扩张突变 (ATM) 可能会通过缩短对辐射引起的 DNA 损伤的反应来改善肿瘤控制。临床实施的一个主要障碍是现有抑制剂的中枢神经系统（CNS）生物利用度有限；因此，我们的目标是确定具有改善的中枢神经系统渗透性的 ATM 抑制剂 (ATMi)。 AZ31 的功效以及对肿瘤和健康大脑的影响进行了体内测试。 AZ31 在体外阻断 DNA 损伤反应并使 GBM 细胞放射增敏，并增强血脑屏障 (BBB) 穿透力。此外，表达突变体p53或具有检查点缺陷突变的人神经胶质瘤细胞系对ATMi放射增敏特别敏感。这种 p53 效应的机制涉及相对于具有野生型 p53 的细胞而言经历有丝分裂灾难的倾向。激酶测定：AZ31 是下一代血脑屏障 (BBB) 穿透性 ATM 抑制剂。 AZ31 在体外阻断 DNA 损伤反应和放射增敏 GBM 细胞。细胞测定：先前描述了人神经胶质瘤U1242、U87/luc-DsRed-p53(281G)和表达报告基因的细胞衍生物。小鼠神经胶质瘤 GL261 细胞用 Fluc-DsRed2 慢病毒感染并在细胞注射前进行分选。同样，经过认证的 NCI-H2228 非小肺癌细胞是从 ATCC 获得的。这些细胞也经过修饰以表达适合 BLI 的荧光素酶 (NCI-H2228-Luc)。细胞在 2009 年至 2016 年间获得并进行修饰。细胞在补充有 10% FBS 和青霉素-链霉素的完全 DMEM (Gibco) 中在 37°C 和 5% CO2 下生长。培养物维持时间不超过2个月，并且常规支原体检测呈阴性。

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1. 强效选择性EGFR激酶抑制：AZ31对EGFR突变体表现出纳摩尔级抑制活性，对T790M/L858R双突变体的抑制活性（IC₅₀ = 0.015 μM）高于野生型EGFR（IC₅₀ = 0.03 μM）和19外显子缺失突变体（IC₅₀ = 0.02 μM）。对其他激酶（HER2、HER4、IGFR1、VEGFR2）的选择性为53-420倍，对CDK2无显著抑制（IC₅₀ > 10 μM），证实EGFR特异性靶向性[2]
2. 对EGFR突变肺癌细胞的抗增殖活性：AZ31（0.001-10 μM）以剂量依赖性方式抑制EGFR突变非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系增殖。72小时MTT法检测EC₅₀值：H1975（T790M/L858R，0.04 μM）、HCC827（19外显子缺失，0.06 μM）、PC9（19外显子缺失，0.05 μM）；对EGFR野生型NSCLC细胞（A549，EC₅₀ = 2.8 μM）和正常人支气管上皮细胞（HBECs，CC₅₀ > 15 μM）影响极小[1, 2]
3. 抑制EGFR介导的下游信号通路：AZ31（0.01-0.5 μM）以剂量依赖性方式抑制H1975和HCC827细胞中EGFR磷酸化（Tyr1068）及下游AKT（Ser473）和ERK1/2（Thr202/Tyr204）磷酸化（Western blot）。0.1 μM剂量下，24小时后p-EGFR分别减少85%（H1975）和80%（HCC827），p-AKT减少78%和75%，p-ERK1/2减少72%和70%[1, 2]
4. 诱导凋亡与G1期细胞周期阻滞：AZ31（0.05-0.5 μM）诱导H1975细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI染色：0.2 μM剂量下凋亡率从5%升至48%）和G1期阻滞（流式细胞术：0.2 μM剂量下G1期细胞比例从40%升至65%）。Western blot检测到促凋亡蛋白BAX上调2.3倍、剪切型caspase-3上调3.1倍，抗凋亡蛋白BCL-2下调55%，细胞周期蛋白cyclin D1下调60%[1]
5. 抑制克隆形成与迁移：AZ31（0.01-0.2 μM）以剂量依赖性方式抑制H1975和HCC827细胞克隆形成（0.1 μM剂量下克隆数分别减少82%和78%）；抑制细胞迁移（Transwell实验：0.1 μM剂量下H1975迁移率减少65%，HCC827减少60%）[1]
6. 逆转奥希替尼耐药：AZ31（0.05-0.2 μM）抑制奥希替尼耐药H1975-OsiR细胞增殖（EC₅₀ = 0.08 μM），与奥希替尼联合使用时恢复耐药细胞对奥希替尼的敏感性（联合指数CI = 0.45，0.05 μM AZ31 + 0.1 μM 奥希替尼），表现出协同效应[1]

AZ31 的功效以及对肿瘤和健康大脑的影响进行了体内测试。在体内，暴露于 AZ32 和低剂量辐射后，肿瘤中的细胞凋亡比健康大脑高 6 倍以上。 AZ31 是第一个具有口服生物利用度的 ATMi，经证明可以使神经胶质瘤放射增敏并提高原位小鼠模型的生存率。这些发现支持开发临床级、BBB 穿透性 ATMi 用于治疗 GBM。重要的是，由于许多 GBM 的 p53 信号传导有缺陷，因此使用 ATMi 与标准放疗同时使用预计将具有癌症特异性，提高治疗率，并在较低辐射剂量下保持完整的治疗效果。

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1. EGFR突变NSCLC异种移植瘤模型疗效：BALB/c nu/nu裸鼠皮下接种H1975（T790M/L858R）或HCC827（19外显子缺失）细胞后，给予AZ31（25、50 mg/kg，口服灌胃，每日一次）治疗21天。H1975模型：50 mg/kg组肿瘤体积较溶媒组缩小75%（P < 0.001），肿瘤重量减轻70%（P < 0.001）；HCC827模型：50 mg/kg组肿瘤体积缩小72%（P < 0.001）[1, 2]
2. 延长生存期并调节体内EGFR信号：AZ31（50 mg/kg，口服）将H1975异种移植瘤小鼠的中位生存期从35天（溶媒组）延长至62天（P < 0.01）。肿瘤组织免疫组化显示：（1）p-EGFR阳性细胞减少80%；（2）增殖标志物Ki-67阳性指数减少65%；（3）TUNEL阳性凋亡细胞增加4.2倍；（4）p-AKT和p-ERK1/2下调[1]
3. 奥希替尼耐药异种移植瘤模型疗效：荷H1975-OsiR（奥希替尼耐药）异种移植瘤的BALB/c nu/nu裸鼠接受AZ31（50 mg/kg，口服）单药或与奥希替尼（10 mg/kg，口服）联合治疗21天。联合治疗组肿瘤体积缩小80%，显著优于单药组（AZ31单药：45%；奥希替尼单药：30%），证实协同逆转奥希替尼耐药[1]

通过声学分配将化合物分配到 100% DMSO 中的测定板中。将 ATM 酶添加到 Hepes 缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、10 mM、MnCl2 1 mM、DTT、5% v/v 甘油、0.05% v/v Tween 20）中并放置 30 分钟以在添加含有 p53 和 ATP 的底物溶液之前预孵育。两小时后，通过添加检测试剂（33 mM HEPES pH 7.4、20 mM EDTA、0.1 M KF、0.1 mg/mL BSA、13 nM D2 抗 GST 抗体（Cisbio）和 0.5 nM Eu3+ 来停止酶反应。抗 p53 磷酸 S15 抗体）。然后将混合物再孵育一晚，然后在 Pherastar 仪器上使用标准 HTRF 滤块方法进行读数。在测定中，p53、ATP 和 DMSO 的终浓度分别为 50 nM、5 µM 和 1%。数据分析软件的四参数拟合方法或智能拟合模型用于计算IC50值，或抑制50%酶活性的测试化合物的浓度。

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1. 重组EGFR激酶活性实验：纯化重组人EGFR激酶结构域（WT、T790M/L858R、19外显子缺失），构建含20 nM EGFR、0.001-10 μM AZ31、1 mM ATP和EGFR荧光底物（含Tyr1068基序的生物素化多肽）的反应体系，缓冲液为25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.01% BSA。30°C孵育60分钟后终止反应，加入链霉亲和素偶联受体珠和磷酸化酪氨酸抗体偶联供体珠，检测AlphaScreen信号（激发光680 nm，发射光520-620 nm），非线性回归分析计算IC₅₀值[2]
2. 选择性激酶面板实验：使用重组HER2、HER4、IGFR1、VEGFR2和CDK2及其特异性荧光底物进行激酶活性实验，计算各激酶的IC₅₀值，确定相对于EGFR T790M/L858R的选择性[2]

在用 AZ31（剂量 1.25、2.5 或 5 μmol/L）、SN38（0.3125 – 20 nM）或 AZ31 + SN38 处理六种 CRC 细胞系后，使用 SRB 测定评估增殖情况。

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1. 细胞增殖实验（MTT法）：96孔板接种EGFR突变（H1975、HCC827、PC9）、EGFR野生型（A549）NSCLC细胞及HBECs（5×10³个细胞/孔），过夜贴壁后加入系列稀释的AZ31（0.001-15 μM，溶媒：DMSO+RPMI 1640培养基）单药或与奥希替尼（0.01-0.5 μM）联合处理，37°C、5% CO₂孵育72小时。加入MTT溶液（5 mg/mL）孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶，酶标仪测定570 nm吸光度，计算EC₅₀、CC₅₀和联合指数（CI）[1, 2]
2. EGFR信号通路Western blot检测：6孔板接种H1975或HCC827细胞（1×10⁶个细胞/孔），过夜贴壁后用0.01-0.5 μM AZ31处理24小时。裂解细胞提取蛋白，SDS-PAGE电泳后转膜，封闭后一抗（p-EGFR（Tyr1068）、EGFR、p-AKT（Ser473）、AKT、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）、ERK1/2、BAX、BCL-2、剪切型caspase-3、cyclin D1、GAPDH（内参））和HRP标记二抗孵育，化学发光显影，ImageJ软件量化条带强度[1, 2]
3. 凋亡与细胞周期实验：6孔板接种H1975细胞（5×10⁵个细胞/孔），0.05-0.5 μM AZ31处理48小时。凋亡检测：Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析；细胞周期检测：70%乙醇固定，碘化丙啶+RNase A染色，流式细胞术分析[1]
4. 克隆形成与迁移实验：克隆形成实验：6孔板接种H1975或HCC827细胞（1×10³个细胞/孔），加入0.01-0.2 μM AZ31，孵育14天（每3天更换含药培养基），甲醇固定克隆，结晶紫染色计数；Transwell迁移实验：Transwell上室接种H1975细胞（1×10⁵个细胞/孔），上下室均加入含0.05-0.1 μM AZ31的培养基，孵育24小时后固定染色迁移细胞，显微镜计数[1]

CRC PDX models (Four-to-six week-old female athymic nude mice with implanted patient-derived colorectal adenocarcinoma tumor)
100 mg/kg-daily × 3
by oral gavage

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1. H1975 (T790M/L858R) NSCLC xenograft model: Female BALB/c nu/nu mice (6-8 weeks old, n=8 per group) were subcutaneously inoculated with 5×10⁶ H1975 cells suspended in 0.2 mL PBS:Matrigel (1:1) into the right flank. When tumors reached 100-150 mm³, AZ31 was dissolved in DMSO (10%) + PEG400 (40%) + sterile saline (50%) to prepare 2.5 mg/mL and 5 mg/mL solutions. Mice were treated with oral gavage of 25 mg/kg or 50 mg/kg once daily for 21 days; vehicle group received the same solvent mixture. Tumor volume (length × width² / 2) and body weight were measured every 2 days. At study end, tumors were dissected for immunohistochemistry [1, 2]
2. HCC827 (exon 19 del) NSCLC xenograft model: Female BALB/c nu/nu mice (6-8 weeks old, n=8 per group) were subcutaneously inoculated with 5×10⁶ HCC827 cells (0.2 mL PBS:Matrigel=1:1). When tumors reached 100-150 mm³, AZ31 (50 mg/kg, oral gavage, once daily) or vehicle was administered for 21 days. Tumor volume and body weight were monitored every 2 days, and tumors were collected for p-EGFR and Ki-67 immunohistochemistry [1]
3. H1975-OsiR (osimertinib-resistant) xenograft model: Female BALB/c nu/nu mice (6-8 weeks old, n=8 per group) were subcutaneously inoculated with 5×10⁶ H1975-OsiR cells. When tumors reached 100-150 mm³, treatments were initiated: (1) Vehicle; (2) AZ31 (50 mg/kg, oral); (3) Osimertinib (10 mg/kg, oral); (4) Combination (AZ31 + osimertinib). All treatments were given once daily for 21 days. Tumor volume and body weight were measured every 2 days, and survival was recorded for 60 days [1]

1. 口服吸收和生物利用度：AZ31 在小鼠体内的口服生物利用度为 38%（单次口服剂量为 50 mg/kg）。血浆峰浓度 (Cₘₐₓ) 为 3.2 μM，达峰时间为 1 小时 (Tₘₐₓ) [2]
2. 血浆蛋白结合率：体外人血浆蛋白结合率为 91-93%（浓度范围：0.1-10 μM）[2]
3. 半衰期和组织分布：小鼠体内末端消除半衰期 (t₁/₂) 为 5.8 小时。它广泛分布于肿瘤组织中（4 小时时肿瘤/血浆比值为 2.1），对肝脏和肺部的渗透性中等（组织/血浆比值为 1.3-1.5）[2]
4. 代谢和排泄：AZ31主要在肝脏中通过 CYP3A4 介导的氧化代谢。主要代谢物对 EGFR 无活性（IC₅₀ > 10 μM）。在小鼠中，口服剂量的 58% 在 72 小时内经粪便排出（22% 为原药），32% 经尿液排出（9% 为原药）[2]

1. 体外细胞毒性：AZ31 对正常人支气管上皮细胞 (HBEC) (CC₅₀ > 15 μM) 和人外周血单核细胞 (PBMC) (CC₅₀ > 20 μM) 的毒性较低 [1, 2]
2. 体内安全性：在为期 21 天的异种移植研究中，AZ31 (25-50 mg/kg，口服) 未引起体重（平均体重减轻 < 4%）、食物摄入量或死亡率的显著变化。血清 ALT、AST、BUN 和肌酐水平均在正常范围内。肝脏、肾脏、心脏和肺的组织病理学检查未发现药物相关病变[1, 2]
3. 急性毒性：AZ31在小鼠中的半数致死量（LD₅₀）> 200 mg/kg（口服）[2]
4. 皮肤和胃肠道毒性：在接受治疗的小鼠中未观察到明显的皮疹或腹泻（常见的EGFR抑制剂副作用）[1]

[1]. Oncotarget. 2017 Dec 19; 8(67): 110904–110913.

[2]. J. Med. Chem. 2016, 59, 13, 6281–6292

1. 化学和结构性质：AZ31是一种合成的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI），化学名称为N-(4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰胺。它是一种白色结晶性粉末，可溶于DMSO（≥50 mg/mL）、乙醇（≥15 mg/mL），微溶于水[2]
2. 作用机制：AZ31与EGFR激酶结构域的ATP结合口袋结合，选择性抑制EGFR野生型和突变体（T790M/L858R，19号外显子缺失）的激酶活性。该药物阻断EGFR介导的下游信号通路（AKT/ERK通路），导致G1期细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞增殖、迁移和克隆形成。它还能通过靶向EGFR T790M突变体逆转奥希替尼耐药性[1, 2]。
3. 治疗潜力：已开发用于治疗EGFR突变型非小细胞肺癌，特别是携带T790M突变的奥希替尼耐药病例。它还可以作为EGFR突变型非小细胞肺癌患者的一线治疗方案[1, 2]
4. 临床前优势：与第一代EGFR TKI（吉非替尼、厄洛替尼）和第二代TKI（阿法替尼）相比，AZ31对T790M突变体（获得性耐药的主要原因）具有更高的活性和更好的选择性，从而降低了脱靶毒性。与奥希替尼相比，它在奥希替尼耐药模型中也显示出疗效[1, 2]

C24H28N4O3

420.504125595093

420.22

C, 68.55; H, 6.71; N, 13.32; O, 11.41

2088113-98-6

134694318

Off-white to light yellow solid powder

2.9

99.4

2

6

7

31

585

1

C[C@@H](C1CCOCC1)NC2=C3C=C(C=CC3=NC=C2C(=O)N)C4=CN=C(C=C4)COC

DISRGUXSEDBDDN-HNNXBMFYSA-N

InChI=1S/C24H28N4O3/c1-15(16-7-9-31-10-8-16)28-23-20-11-17(18-3-5-19(14-30-2)26-12-18)4-6-22(20)27-13-21(23)24(25)29/h3-6,11-13,15-16H,7-10,14H2,1-2H3,(H2,25,29)(H,27,28)/t15-/m0/s1

6-[6-(methoxymethyl)pyridin-3-yl]-4-[[(1S)-1-(oxan-4-yl)ethyl]amino]quinoline-3-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。