BI-882370

Braf (Ki = 2 nM); JNK1 (IC50 = 45 nM); JNK2 (Ki = 4 nM); JNK2 (Ki = 160 nM); JNK3 (Ki = 52 nM)
BI-882370 is a highly potent and selective RAF kinase inhibitor. It binds to the DFG-out (inactive) conformation of BRAF kinase. Biochemical inhibitory potencies (IC₅₀) are: BRAF^V600E 0.4 nM, BRAF^WT 0.8 nM, CRAF 0.6 nM. Dissociation constants (K_D) determined by SPR are: BRAF^V600E 4 nM, BRAF^WT 6 nM, CRAF 3 nM. [1]

BI-882370（0.9-6000 nM；3 天）的 EC50 范围为 1-10 nM，可抑制具有 BRAF 突变的人类黑色素瘤和结直肠癌细胞的增殖[1]。 BI 882370（0.1-100 nM，0.1-3000 nM；2 小时）降低 BRAFV600E 突变 A375 细胞中 p-MEK1/2、p-ERK1/2 和细胞周期蛋白 D1/D2 的表达；在 WT BRO 细胞中，它会增加 ERK1/2 的磷酸化并磷酸化 MEK1/2 (3–300 nM)[1]。在 BRAFV600E 突变 A375 细胞中，浓度为 1 nM 或更高的 BI 882370（0.1-100 nM、0.1-3000 nM；24 小时）可抑制细胞周期蛋白 D1/D2 表达并增加 Kip1/p27 表达。 WT BRO 细胞中细胞周期蛋白 D1/D2 或 Kip1/p27 的表达不受影响。

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BI-882370 抑制人 BRAF 突变黑色素瘤细胞（如 A375, SK-MEL-28, G-361）的增殖，EC₅₀ 值在 0.9 至 6 nM 范围内，其效力比威罗菲尼强约 100 倍。野生型 BRAF 细胞系（如 BRO, HCT-116）在浓度高达 1,000 nM 时不受影响，EC₅₀ 值 > 5,000 nM。[1]
在 A375 黑色素瘤细胞（BRAF^V600E）中，用 BI-882370 处理 2 小时导致免疫印迹中磷酸化 MEK1/2 和磷酸化 ERK1/2 水平呈剂量依赖性降低，在 3 nM 时观察到完全抑制。处理 24 小时后，它抑制了细胞周期蛋白 D1/D2 的表达并诱导了 Kip1/p27 的表达，表明细胞周期阻滞在 G1 期。[1]
在基于细胞的 ELISA 实验中，BI-882370 抑制 ERK 磷酸化，在 A375 细胞中的 EC₅₀ 为 0.5 nM，在 SK-MEL-28 细胞中为 0.7 nM。[1]
BI-882370 在药理学相关浓度下，不会在 BRAF 野生型、NRAS 突变的 BRO 黑色素瘤细胞中诱导显著的 RAF 异二聚体（CRAF/BRAF 或 CRAF/ARAF）形成，这与工具化合物 GDC-0879 不同。然而，在 3 至 300 nM 的浓度下，它确实在这些细胞中诱导了 MEK 和 ERK 的磷酸化，但不影响细胞周期蛋白 D1/D2 或 Kip1/p27 的表达。[1]
BI-882370 对通路抑制的作用是持久的。在 A375 细胞中进行 2 小时处理并随后洗脱后，ERK 磷酸化的抑制持续存在，洗脱后 24 小时 EC₅₀ 值仍在 10-20 nM 范围内。这与威罗菲尼形成对比，后者的通路活性在洗脱后 1 小时内恢复至基线水平。[1]

BI-882370（口服给药；25 mg/kg、50 mg/kg；每天两次；2 周）在多种结直肠和 BRAF 突变黑色素瘤小鼠模型中比 Vemurafenib、Dabrafenib 或 Trametinib 更有效[1]。 BI-882370（口服；25 mg/kg；每天两次；40 天）在三周内出现耐药性，但曲美替尼辅助二线治疗五周并未显示出耐药性[1]。通过临床化学、血液学、病理学和毒理基因组学测量，BI-882370（口服；60 mg/kg；每天一次；2 周）显示对大鼠没有毒性[1]。

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在 BRAF^V600E 黑色素瘤（A375）的小鼠异种移植模型中，口服 BI-882370（25 mg/kg，每日两次）可诱导所有肿瘤完全或部分消退，显示出优于威罗菲尼（120 mg/kg，每日一次）和达拉菲尼（60 mg/kg，每日一次）的疗效。[1]
在 G-361 黑色素瘤模型（杂合 BRAF^V600V/E）中，BI-882370（12.5 或 25 mg/kg，每日两次）诱导肿瘤消退，而威罗菲尼仅导致初始稳定，随后再生长。[1]
在获得性耐药模型中，对初始威罗菲尼治疗后进展的 A375 肿瘤进行再治疗。BI-882370（25 mg/kg，每日两次）作为单药诱导了肿瘤消退，但耐药性在 2-3 周内出现。BI-882370（25 mg/kg，每日两次）与 MEK 抑制剂曲美替尼（0.25 mg/kg，每日两次）的联合治疗导致了更明显的消退，在为期 5 周的二线治疗期间未观察到再生长。[1]
在 BRAF^V600E 结直肠癌模型中，BI-882370（25 mg/kg，每日两次）在 COLO 205 肿瘤中诱导完全或部分消退，并在敏感性较低的 HT-29 模型中显示出显著的肿瘤生长抑制作用。[1]
BI-882370 与 EGFR 抑制剂西妥昔单抗或 ErbB 抑制剂阿法替尼，或与曲美替尼的联合治疗，在 HT-29 结直肠癌模型中协同提高了疗效。[1]
对治疗小鼠肿瘤样本的免疫组织化学分析显示，磷酸化 ERK 信号被强烈抑制。[1]

采用 RAF-MEK-ERK 级联测定法来测定 RAF 激酶抑制活性。使用 Z-LYTE 技术测量 ERK 对荧光底物的活性。简言之，将测定组分（RAF、MEK、ERK 激酶和底物）在缓冲液中混合，并以剂量反应方式加入化合物。孵育后，测量荧光信号，并通过非线性回归计算 IC₅₀ 值。[1]
使用表面等离子体共振技术测定化合物与纯化的 BRAF 和 CRAF 激酶结构域的结合亲和力（K_D）。将蛋白质固定在传感器芯片上，使不同浓度的化合物流过表面。实时监测结合和解离速率，并计算平衡解离常数。[1]

对于增殖实验，将细胞接种到 96 孔板中。第二天，加入连续稀释的化合物（最终 DMSO 浓度 1%）。处理 3 天后，测定抗增殖效果。对于大多数细胞系，使用 alamarBlue 试剂测量剩余细胞的代谢活性。读取荧光值，并通过非线性回归计算 EC₅₀ 值。对于 HT-29 和 COLO 205 细胞，改用 ³H-胸腺嘧啶掺入实验。化合物处理 3 天后，加入 ³H-胸腺嘧啶 16 小时。然后裂解细胞，将 DNA 收集到滤膜板上，并使用微孔板闪烁计数器测量放射性以确定 EC₅₀。[1]
对于磷酸化 ERK 的基于细胞的 ELISA，铺板 A375 或 SK-MEL-28 细胞，用化合物处理 2 小时，然后固定。将细胞透化、封闭，并与抗磷酸化 ERK 一抗孵育过夜。洗涤后，加入 HRP 偶联的二抗，然后是 TMB 底物。终止反应，并在 450 nm 处测量吸光度以确定 EC₅₀ 值。[1]
对于免疫印迹，用化合物处理细胞 2 或 24 小时，裂解，通过 SDS-PAGE 分离蛋白质。转印至膜后，用针对磷酸化 MEK、MEK、磷酸化 ERK、ERK、细胞周期蛋白 D1/2、Kip1/p27 和 α-微管蛋白（上样对照）的抗体进行探测，然后进行 ECL 检测。[1]
对于评估 RAF 二聚化的免疫共沉淀，将细胞处理 1 小时，裂解，并使用特异性抗体免疫沉淀 CRAF。然后使用针对 ARAF、BRAF 和 CRAF 的抗体通过 Western blotting 分析免疫沉淀物。[1]

Human melanoma xenografts in nude mice with BRAF-mutant melanomas and colorectal carcinomas cells (A375, COLO 205; G-361, HT-29 cells)[1]
25 mg/kg; 50 mg/kg
Deliver orally; 25 mg/kg, 50 mg/kg; twice daily; 2 weeks

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For efficacy studies in mouse xenograft models, female immunodeficient mice were subcutaneously injected with tumor cells (e.g., A375, COLO 205). When tumors were well-established (approx. 50-100 mm³), mice were randomized into treatment groups. [1]
BI-882370 was formulated as a solution in 0.5% Natrosol (hydroxyethylcellulose), adjusted to pH 3 with citric acid. [1]
Compounds were administered orally (intragastrically) at a volume of 10 mL/kg body weight. BI-882370 was typically dosed twice daily (bid) at 6.25, 12.5, or 25 mg/kg. Treatment duration varied from 2 to 6 weeks depending on the experiment. [1]
Tumor diameters were measured 3 times per week, and volumes were calculated. Body weight was monitored as a measure of tolerability. [1]
For pharmacodynamic and pharmacokinetic analyses, blood samples and tumors were collected at specified time points after the last dose for drug concentration measurement or for immunohistochemical analysis. [1]

In tumor-bearing mice treated with BI-882370 at 25 mg/kg twice daily for 2-3 weeks, the drug exposure (AUC_0-24h) at the end of the treatment period ranged from 12,000 to 25,000 nmol·h/L. [1]
After a single oral dose of BI-882370 (50 mg/kg) in mice, drug concentrations in tumor tissue were higher than in plasma at all time points investigated, indicating favorable tissue distribution. [1]
In rats, a dose of 60 mg/kg once daily for 2 weeks resulted in an exposure (AUC) of 43,000 nmol·h/L. [1]

BI-882370 was well tolerated in mice at doses up to 50 mg/kg twice daily for several weeks, with no significant body weight loss or clinical signs of toxicity observed. A maximum tolerated dose (MTD) was not defined in these studies. [1]
Histopathological examination of multiple organs (skin, heart, lung, bladder, stomach, liver, kidney) from tumor-bearing mice treated with BI-882370 at highly efficacious doses (25 mg/kg bid) for 2 weeks revealed no evidence of drug-induced hyperplasia or other pathological alterations. [1]
In an exploratory 2-week toxicology study in male rats, daily oral doses of BI-882370 up to 60 mg/kg (resulting in AUC > 43,000 nmol·h/L) did not cause any adverse clinical observations or relevant findings in clinical chemistry, hematology, histopathology, or toxicogenomic analysis of liver and skin. [1]

[1]. A Novel RAF Kinase Inhibitor with DFG-Out-Binding Mode: High Efficacy in BRAF-Mutant Tumor Xenograft Models in the Absence of Normal Tissue Hyperproliferation. Mol Cancer Ther. 2016 Mar;15(3):354-65.

pan-RAF Inhibitor XP-102 is an orally bioavailable, second-generation inhibitor of all members of the serine/threonine protein kinase Raf family, including A-Raf, B-Raf and C-Raf protein kinases, with potential antineoplastic activity. Upon administration, pan-RAF kinase inhibitor XP-102 specifically binds to the ATP binding site of the Raf kinase positioned in the inactive DFG-out conformation, and inhibits the activity of Raf, including B-Raf mutated forms such as the B-Raf V600E mutation. This prevents the activation of Raf-mediated signal transduction pathways, which may inhibit tumor cell growth. Raf protein kinases play a key role in the RAF/mitogen-activated protein kinase kinase (MEK)/extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway, which is often dysregulated in human cancers and plays a key role in tumor cell proliferation and survival. The valine to glutamic acid substitution at residue 600 accounts for the majority of BRAF gene mutations. The oncogenic product, BRAF(V600E) kinase, exhibits elevated activity that over-activates the MAPK signaling pathway.

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BI-882370 is a DFG-out (Type II) kinase inhibitor, binding to the inactive conformation of BRAF, in contrast to first-generation inhibitors like dabrafenib and vemurafenib which are DFG-in (Type I) binders. [1]
Its binding mode stabilizes the DFG-out conformation via specific hydrogen bonds and a T-stacking interaction with Phe595, contributing to its high potency. [1]
A key feature of BI-882370 is its lack of induction of RAF heterodimer formation in BRAF wild-type cells at pharmacologically relevant concentrations, which is associated with the paradoxical activation of the MAPK pathway and hyperproliferative side effects (like skin lesions) seen with some other RAF inhibitors. [1]
BI-882370 demonstrates a long duration of action in cells and in vivo, providing sustained pathway suppression. [1]
It shows superior efficacy as a single agent compared to vemurafenib, dabrafenib, and trametinib in multiple BRAF-mutant xenograft models when dosed to achieve exposures comparable to those in patients. [1]
BI-882370 in combination with trametinib showed promising activity in a model of acquired resistance to vemurafenib. [1]

C28H33F2N7O2S

569.669131040573

569.238

C, 59.03; H, 5.84; F, 6.67; N, 17.21; O, 5.62; S, 5.63

1392429-79-6

1392429-79-6

60152613

Off-white to gray solid powder

1.4±0.1 g/cm3

666.8±65.0 °C at 760 mmHg

357.0±34.3 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.660

2.59

105

1

10

9

40

913

0

S(CCC)(NC1=CC=C(C(=C1F)N1C=C(C2=CN=CN=C2)C2=C1C=CC(=N2)N(C)C1CCN(CC)CC1)F)(=O)=O

AEJACXAFHXBVHF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C28H33F2N7O2S/c1-4-14-40(38,39)34-23-7-6-22(29)28(26(23)30)37-17-21(19-15-31-18-32-16-19)27-24(37)8-9-25(33-27)35(3)20-10-12-36(5-2)13-11-20/h6-9,15-18,20,34H,4-5,10-14H2,1-3H3

N-[3-[5-[(1-ethylpiperidin-4-yl)-methylamino]-3-pyrimidin-5-ylpyrrolo[3,2-b]pyridin-1-yl]-2,4-difluorophenyl]propane-1-sulfonamide

BI882370; BI 882370; BI-882370

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~5 mg/mL (~8.78 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。