BMS-8

PD-1/PD-L1 PPI; PD-L1 protein
BMS-8 targets the PD-1/PD-L1 immune checkpoint interaction (IC₅₀ = 7.2 μM for inhibiting PD-1/PD-L1 binding) [1]
BMS-8 acts on PD-L1 to induce its homodimerization, thereby interfering with PD-1/PD-L1 interaction [1]
BMS-8 binds to the cavity formed by two PD-L1 monomers, interacting with key residues including Ile54, Tyr56, Met115, Ala121, and Tyr123 on PD-L1 [2]

其中一个PD-L1单体往往比另一个单体具有更稳定的与BMS-8的结合模式，并且通过Ile54、Tyr56、Met115、Ala121的非极性相互作用进一步稳定诱导PD-L1二聚化的小分子和 Tyr123 位于 ALys124 的单体和水桥上[2]。

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通过AlphaLISA®实验检测发现，BMS-8对PD-1/PD-L1相互作用具有抑制效果，其IC₅₀值为7.2 μM[1]
- 分子动力学模拟显示，在PD-L1二聚体体系中，BMS-8与其中一个PD-L1单体（构象A）的结合模式比另一个单体（构象B）更稳定；BMS-8的核心骨架在模拟过程中保持相对稳定的均方根偏差（RMSD）值[2]
- 残基能量分解分析表明，BMS-8主要通过与两个PD-L1单体上的Ile54、Tyr56、Met115、Ala121和Tyr123残基发生非极性相互作用来与PD-L1二聚体结合，同时涉及Lys124ₐ的水桥也稳定了BMS-8与PD-L1二聚体的结合[2]
- 元动力学模拟显示，BMS-8解离后PD-L1的二聚化状态仍保持稳定，说明BMS-8诱导的PD-L1二聚体形成是其发挥抑制活性的关键因素[2]

NP19 [[an analog of BMS-8]]在H22肝癌小鼠模型[3]
中的体内抗肿瘤活性 鉴于NP19在黑色素瘤B16-F10肿瘤模型中具有良好的体内抗肿瘤效果，且PD-1/PD-L1抑制剂具有广谱的抗肿瘤活性，我们进一步利用H22肝癌模型BALB/c小鼠对复方NP19的体内抗肿瘤效果进行了评价。每只小鼠右侧皮下注射80万个H22细胞。当肿瘤体积达到约100 mm3时，随机选取小鼠，通过腹腔注射NP19或载体溶液治疗14天。如图8所示，NP19在25 mg/kg剂量下具有显著的体内抗肿瘤功效，TGI为76.5%（图8A， 8B, 8C）。此外，NP19没有引起明显的体重减轻（图8D），表明该化合物耐受性良好。 <人力资源> NP19 [an analog of BMS-8]在B16-F10小鼠黑色素瘤模型中的体内抗肿瘤活性[3]
为了确定新合成化合物的体外抗pd -1/PD-L1活性是否可以转化为体内功效，我们在小鼠黑色素瘤B16-F10肿瘤模型上测试了化合物NP19的抗肿瘤活性。选择NP19进行体内疗效研究，是因为与更有效的化合物NP2或同样有效的化合物NP12相比，NP19易于合成且细胞毒性较小（表9）。我们将携带黑色素瘤的BALB/c小鼠分别以载药对照和NP19 （25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）灌胃治疗，每天1次，持续15天。如图6所示，治疗15天后，NP19治疗显著抑制了黑色素瘤的生长。 <人力资源> NP19的体内药代动力学性质[an analog of BMS-8][3]
由于化合物NP19在体外表现出较高的药效，接下来通过静脉注射和口服给药来评估雄性Sprague-Dawley大鼠的药代动力学（PK）谱。表8总结了关键po和静脉给药PK参数。单次静脉给药1 mg/kg化合物NP19后，NP19的半衰期（t1/2）为1.5±0.5 h，清除率（CL）为0.9±0.2 L/h/kg，表观分布体积（Vss）为2.1±0.5 L/kg。NP19口服给药剂量为10 mg/kg时，观察到NP19的口服吸收（Tmax = 0.6±0.2 h）、长半衰期（t1/2 = 10.9±7.7 h）和口服生物利用度（F = 5%）。此外，在大鼠中未观察到明显的不良反应。NP19经口服灌胃后的半衰期（10.9 h）比静脉注射的半衰期（1.5 h）长得多；这可能是由于NP19的高亲脂性（logP = 7.9）或水溶性差。结果，NP19表现出翻转式药代动力学。这种翻转式药代动力学有时会发生在像利巴米胺这样水溶性差的化合物上，由于其水溶性差（7.6 μg/mL），其t1/2 (p.o)/t1/2 （i.v）比为13.5。另一个例子是李建明等人报道的亲脂化合物IAT（一种水溶性为19 μg/mL的抗微管蛋白剂），其t1/2 (p.o.)/t1/2 （i.v.）的比值为~ 5，与NP19 [t1/2 (p.o.)/t1/2 (i.v.) = 7.1]相似。由于化合物NP19的口服生物利用度较低，我们推测需要高剂量才能提供足够的药物浓度以显示抗肿瘤功效。因此，我们进一步研究了化合物NP19的体内活性。

所有结合研究均在 HTRF 测定缓冲液中进行，该缓冲液由 dPBS 组成，并补充有 0.1%（含 v）牛血清白蛋白和 0.05%（v/v）Tween-20。对于 PD-l-Ig/PD-Ll-His 结合测定，将抑制剂与 PD-Ll-His（最终浓度为 10 nM）在 4 μL 测定缓冲液中预孵育 15 m，然后添加 PD-l- Ig（最终 20 nM）溶于 1 μL 测定缓冲液中，并进一步孵育 15 m。使用来自人类、食蟹猴或小鼠的 PD-L1。 HTRF 检测是使用铕穴酸盐标记的抗 Ig（最终 1 nM）和别藻蓝蛋白 (APC) 标记的抗 His（最终 20 nM）实现的。将抗体在 HTRF 检测缓冲液中稀释，并在结合反应上分配 5 μL。让反应混合物平衡 30 分钟，并使用 En Vision 荧光计获得信号（665 nm/620 nm 比率）。在 PD-1-Ig/PD-L2-His（分别为 20、5 nM）、CD80-His/PD-Ll-Ig（分别为 100、10 nM）和 CD80-His/CTLA4- 之间建立了额外的结合测定。 Ig（分别为 10、5 nM）。

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采用AlphaLISA®实验检测BMS-8对PD-1/PD-L1相互作用的抑制作用：建立检测PD-1与PD-L1结合的实验体系，向反应体系中加入不同浓度的BMS-8，通过AlphaLISA®技术检测产生的发光信号，并根据剂量-反应曲线计算出BMS-8抑制PD-1/PD-L1相互作用的IC₅₀值[1]
- 运用分子对接模拟预测BMS-8与PD-L1二聚体的结合模式：以PD-L1二聚体的晶体结构（PDB ID:5J8O）为受体模型，构建并优化BMS-8的三维结构，进行对接过程以获得BMS-8在PD-L1二聚体空腔中的结合构象，分析BMS-8与PD-L1关键残基的相互作用[2]
- 对BMS-8-PD-L1二聚体复合物进行常规分子动力学模拟：以复合物为核心构建模拟体系，对体系进行溶剂化和离子化处理；在特定力场条件下运行模拟，计算复合物、PD-L1单体和BMS-8的均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）等参数，评估结合体系的稳定性[2]
- 采用元动力学模拟研究BMS-8从PD-L1二聚体中的解离过程：定义集体变量（CV1和CV2）来描述解离过程，获得解离过程的自由能景观；通过监测PD-L1关键残基之间的距离，分析解离过程中BMS-8和PD-L1二聚体的构象变化[2]

特别是在肿瘤细胞裂解成为关注焦点的肿瘤微环境中，程序性死亡 1/程序性死亡配体 1 (PD-1/PD-L1) 之间的相互作用在抑制 T 细胞反应中发挥着主导作用。 PD-1/PD-L1 抑制剂 2 的 IC50 值为 18 nM，据说可以阻止 PD-L1 与 PD-1 相互作用。

雄性Sprague-Dawley大鼠药代动力学研究[3]
本研究采用雄性Sprague-Dawley大鼠（200-220 g）研究化合物NP19（BMS-8类似物）的药代动力学。实验前12小时禁食，但可自由饮水。分别于口服（10 mg/kg）或静脉注射（1 mg/kg）化合物NP19后0.0833、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12和24小时，从尾静脉采集血样（0.3 mL）至肝素化1.5 mL聚乙烯管中。该化合物溶于 5% DMSO 和 95% PEG-300 的混合溶液中用于静脉注射，或悬浮于 0.5% 羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 溶液中用于口服。样品立即以 3000 g 离心 10 分钟。所得血浆 (100 μL) 储存于 -20 °C 直至分析。使用 DAS（药物与统计）软件，通过非房室模型分析，根据个体动物数据确定药代动力学 (PK) 参数。PK 研究的仪器和分析条件：使用配备电喷雾电离 (ESI) 接口的 ACQUITY I-Class UPLC 和 XEVO TQD 三重四极杆质谱仪的 UPLC-MS/MS 系统分析血液样本。UPLC 系统由二元溶剂管理器 (BSM) 和带流通针的样品管理器 (SM-FTN) 组成。使用 Masslynx 4.1 软件进行数据采集和仪器控制。采用多反应监测 (MRM) 模式，分别监测 NP19 的 m/z 555.35 → 181.03 和卡马西平的 m/z 237 → 194.1 进行定量分析。

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小鼠 B16F10 黑色素瘤模型体内疗效研究[3]
使用 6-8 周龄的 BALB/c 小鼠研究 NP19（BMS-8 类似物）对皮下移植黑色素瘤细胞模型的抑制作用。将处于对数生长期的小鼠 B16F10 黑色素瘤细胞悬浮于 PBS 缓冲液中，细胞密度为 2 × 10⁶ 个/mL。每只小鼠皮下接种 200 μL 含有 4 × 10⁵ 个细胞的细胞悬液。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为四组（n = 10），分别给予NP19（25、50、100 mg/kg）和溶剂对照。药物通过灌胃法每日一次给药，持续15天。溶剂对照组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）。在整个实验期间监测动物的活动和体重，以评估急性毒性。治疗开始16天后处死小鼠，收集肿瘤组织和主要器官（肝脏、脾脏、胸腺和肾脏）样本。收集的肿瘤组织和器官（肝脏、肾脏）用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，苏木精-伊红（H&E）染色，并在显微镜下观察。肿瘤生长抑制值 (TGI) 的计算公式为：TGI(%) = [1 – Wt/Wv] × 100%，其中 Wt 和 Wv 分别为治疗组和载体对照组的平均肿瘤重量。

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小鼠 H22 肝癌模型体内疗效研究[3]
采用 6-8 周龄雄性 BALB/c 小鼠。根据肿瘤移植研究方案，将 8 × 10⁵ 个 H22 细胞接种到每只小鼠的右侧腹部。NP19（BMS-8 的类似物）溶解于 5% DMSO、40% PEG-200 和 55% 生理盐水中，配制成所需浓度。对照组小鼠腹腔注射 200 μL 载体溶液。每隔2天使用可溯源的电子数显卡尺测量肿瘤体积，并使用公式a × b² × 0.5计算，其中a和b分别代表肿瘤的长径和短径。治疗结束后处死小鼠，切除肿瘤并称重。

[1]. Preparation of Biphenyl-Conjugated Bromotyrosine for Inhibition of PD-1/PD-L1 Immune Checkpoint Interactions. Int J Mol Sci. 2020 May 21;21(10):3639.

[2]. Computational Insight Into the Small Molecule Intervening PD-L1 Dimerization and the Potential Structure-Activity Relationship. Front Chem. 2019 Nov 12;7:764.

[3]. Discovery of Novel Resorcinol Dibenzyl Ethers Targeting the Programmed Cell Death-1/Programmed Cell Death-Ligand 1 Interaction as Potential Anticancer Agents. J Med Chem. 2020 Aug 13;63(15):8338-8358.

近期有报道称，小分子化合物可通过诱导PD-L1二聚化来阻断PD-1/PD-L1相互作用。所有这些抑制剂都具有共同的骨架结构，并与两个PD-L1单体形成的空腔相互作用。这种特殊的相互作用模式为基于结构的药物设计提供了线索，但也暴露出其在发现具有新型骨架的小分子抑制剂方面的局限性。本研究通过传统的分子动力学和元动力学模拟，预测了现有靶向PD-L1二聚化的小分子抑制剂的结合和解离机制，从而揭示了它们的构效关系。在结合过程中，代表性抑制剂（BMS-8 和 BMS-1166）与其中一个 PD-L1 单体的结合模式比与另一个单体的结合模式更稳定。诱导 PD-L1 二聚化的小分子进一步受到两个单体上 Ile54、Tyr56、Met115、Ala121 和 Tyr123 的非极性相互作用以及 Alys124 参与的水桥的稳定作用。解离过程预测表明，配体解离后 PD-L1 二聚化仍然保持稳定。这表明，诱导 PD-L1 二聚化的小分子的形成和稳定性是这些配体发挥抑制活性的关键因素。接触分析、基于R基团的定量构效关系（QSAR）分析和分子对接进一步表明，配体核心骨架上的每个连接点在通过结构修饰提高抑制活性时，对药效团元素具有特定的偏好性。综上所述，本研究结果可指导PD-L1靶向新型小分子抑制剂的结构优化和进一步发现。[2]

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单克隆抗体（mAb）的开发彻底改变了癌症免疫疗法，这些抗体能够抑制免疫检查点分子（例如程序性死亡受体1 (PD-1)）与其配体PD-L1之间的相互作用。然而，基于mAb的药物存在一些缺点，包括肿瘤穿透性差和生产成本高，而小分子药物有望克服这些缺点。BMS-8是一种有效的小分子药物，它能诱导PD-L1的同源二聚化，从而抑制其与PD-1的结合。我们的检测系统显示，BMS-8 能抑制 PD-1/PD-L1 相互作用，IC50 值为 7.2 μM。为了提高 IC50 值，我们基于 BMS-8 的分子结构，通过计算机模拟设计并合成了一种小分子。结果，我们成功制备了一种联苯偶联的溴酪氨酸 (X)，其 IC50 值为 1.5 μM，比 BMS-8 提高了约五倍。我们进一步制备了 X 的氨基酸偶联物 (氨基-X)，以阐明氨基-X 的对接模式与 IC50 值之间的相关性。结果表明，氨基-X 从 PD-L1 同源二聚体口袋中的 BMS-8 上脱离的程度与 IC50 值相关。这一观察结果为我们进一步了解如何对化合物 X 进行衍生化以获得更好的抑制效果提供了思路。[1]

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本研究描述了用 BMS-8 化合物修饰金电极的方法，该化合物可与免疫检查点蛋白程序性死亡配体 1 (PD-L1) 相互作用。结果表明，我们利用电化学阻抗谱 (EIS) 证实了浓度范围为 10⁻¹⁸ 至 10⁻⁸ M 的 sPD-L1 的存在，其检测限 (LOD) 为 1.87 × 10⁻¹⁴ M (S/N = 3.3)；此外，我们还利用循环伏安法 (CV) 检测到了浓度为 10⁻¹⁴ M 的 sPD-L1。此外，我们还应用高分辨率 X 射线光电子能谱 (XPS)、接触角和表面自由能测量来验证电极的功能化。我们研究了该电极对其他蛋白质的选择性：程序性死亡受体1 (PD-1)、分化簇160 (CD160) 和B细胞和T细胞衰减因子 (BTLA)，浓度为10⁻⁸ M。通过分析修饰金电极表面电容效应频率色散，实现了PD-L1和PD-1的区分。PD-L1和PD-1的浓度范围为10⁻¹⁸至10⁻⁸ M。PD-L1和PD-1的异质性存在显著差异。准电容研究结果表明，BMS-8与PD-L1蛋白具有强而特异的相互作用。 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33517203/

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BMS-8是一种强效的小分子药物，可抑制PD-1/PD-L1免疫检查点相互作用，克服了单克隆抗体类药物肿瘤渗透性差、生产成本高等缺点[1]
- BMS-8诱导PD-L1同源二聚化，这是其抑制PD-1/PD-L1结合的主要机制[1]
- BMS-8的结构修饰可参考基于R基团的定量构效关系(QSAR)分析所揭示的构效关系；BMS-8核心骨架上的每个连接点在提高抑制活性时对药效团元素具有特定的偏好[2]

C27H28BRNO3

494.43

493.125

C, 65.59; H, 5.71; Br, 16.16; N, 2.83; O, 9.71

1675201-90-7

117941742

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

616.9±55.0 °C at 760 mmHg

326.9±31.5 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.620

6.28

49.8

1

4

7

32

596

0

BrC1=C(C=CC(=C1)CN1CCCCC1C(=O)O)OCC1C=CC=C(C2C=CC=CC=2)C=1C

QRXBPPWUGITQLE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H28BrNO3/c1-19-22(10-7-11-23(19)21-8-3-2-4-9-21)18-32-26-14-13-20(16-24(26)28)17-29-15-6-5-12-25(29)27(30)31/h2-4,7-11,13-14,16,25H,5-6,12,15,17-18H2,1H3,(H,30,31)

1-[[3-bromo-4-[(2-methyl-3-phenylphenyl)methoxy]phenyl]methyl]piperidine-2-carboxylic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。