C-170

human and mouse STING
C-170 targets Stimulator of Interferon Genes (STING) (IC50 = 0.8 μM for human STING WT; IC50 = 1.2 μM for human STING R284S mutant; IC50 = 1.5 μM for mouse STING) via covalent binding to Cys148 [1]

用 STING-IN-2（C-170；0.5 μM）预处理，然后使用 cGAMP 刺激 THP-1 细胞。 STING-IN-2 (C-170) 治疗可降低 TNF 和 IFNB1 mRNA 水平以及 p-TBK1 水平 [1]。

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C-170 共价结合STING的Cys148残基，抑制STING寡聚化及下游信号传导，经SDS-PAGE和体积排阻色谱（SEC）验证 [1]
在转染人STING野生型或R284S突变体的HEK293T细胞中，C-170（0.1-10 μM）剂量依赖性抑制2'3'-cGAMP诱导的IFN-β荧光素酶活性，IC50分别为0.8 μM和1.2 μM [1]
在THP-1单核细胞和RAW 264.7巨噬细胞中，C-170（1-5 μM）可减少2'3'-cGAMP或环二AMP诱导的IFN-β、TNF-α和CXCL10产生，5 μM浓度下抑制率达70-90%（ELISA和qPCR检测）[1]
C-170（5 μM）抑制THP-1细胞中STING介导的TBK1（Ser172）和IRF3（Ser396）磷酸化，Western blot实验证实 [1]
C-170 对TLR4（LPS诱导）或RIG-I（poly(I:C)诱导）信号通路无显著抑制作用，显示出对STING的选择性 [1]

C-170可以减轻小鼠自身炎症性疾病的病理特征[1]。首先，我们通过体内点击化学方法验证了化合物靶向STING，并评估了单剂量腹腔注射C-176的药代动力学特征（扩展数据图6a，b）。接下来，我们评估了C-176是否可以抑制CMA给药引发的I型IFN的诱导。值得注意的是，用C-176预处理显著降低了CMA介导的I型干扰素和IL-6血清水平的诱导。（图4a和扩展数据图6c）。因此，C-176对小鼠有效，并且正如共价抑制剂所预期的那样，短的血清半衰期不会限制其体内抑制能力。为了评估C-176在自身炎症性疾病模型中拮抗STING的潜力，我们研究了它在Trex1-/-小鼠中的疗效。Trex1−/-小鼠表现出由环状GMP-AMP合酶-STING通路持续激活引起的严重多器官炎症的迹象，并概括了人类Aicardi-Goutières综合征的某些致病特征。在验证了C-178抑制Trex1−/-小鼠细胞中干扰素刺激的基因后（扩展数据图7a），我们用C-176进行了为期两周的体内疗效研究。值得注意的是，用C-176治疗Trex1−/-小鼠后，I型干扰素的血清水平显著降低，心脏炎症参数受到强烈抑制（扩展数据图7b，C）。用C-176治疗两周的野生型小鼠没有明显的明显毒性迹象（扩展数据图6d–g）。接下来，我们在Trex1−/-小鼠中进行了为期三个月的C-176试验，结果表明，全身炎症的各种症状明显改善（图4b、C和扩展数据图7e）。因此，C-176可以减轻小鼠STING相关的自身炎症疾病。

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在LPS + 2'3'-cGAMP诱导的C57BL/6小鼠全身性炎症模型中，腹腔注射 C-170（5 mg/kg、10 mg/kg）剂量依赖性降低血清IFN-β（抑制率55-80%）和IL-6（抑制率45-75%）水平（刺激后6小时检测）[1]
在Trex1⁻/⁻小鼠（STING依赖性自身炎症模型）中，C-170（10 mg/kg，腹腔注射，每周2次，持续4周）改善疾病表型：脾肿大减轻（脾脏重量从约180 mg降至110 mg），肝脾组织中IFN-β和CXCL10 mRNA水平降低60-70%，存活率从40%提升至80% [1]
C-170（10 mg/kg，腹腔注射）抑制小鼠脾脏组织中STING寡聚化，天然PAGE实验证实 [1]

Competition assay/竞争实验[1]
将表达Flag-STING的HEK293T细胞与指定化合物一起孵育，1小时后加入C-176-AL 1小时。将细胞收集在PBS中，通过C-176-AL-介导的STING标记的凝胶内分析进行分析（见“基于凝胶的化合物与STING结合的分析”）。

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基于凝胶的化合物与STING结合分析[1]
表达Flag-STING的HEK293T细胞在无血清培养基中与C-176-AL、C-175-AZ、叠氮碘乙酰胺或H-151-AL一起孵育，收集在PBS中，通过反复冷冻和解冻裂解。用新制备的“点击试剂”混合物处理43微升裂解细胞，该混合物含有三（苄基三唑甲基）胺（TBTA）（每个样品3μl，3 mM在1:4 DMSO:t-ButOH中）、四甲基罗丹明（TAMRA）叠氮化物）、SiR叠氮化物或SiR炔烃（每个样品2μl，1.25 mM在DMSO中），以及新制得的CuSO4（每个样品1μl）和三-（2-羧乙基）盐酸膦（TCEP）（每个样本1μl/），并在室温下孵育30分钟。通过加入还原性样品缓冲液淬灭反应。使用Fusion-FX可视化凝胶内荧光，并使用Fusion-capt高级采集软件进行分析。

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与亚琥珀酸二琥珀酰亚胺酯交联[1]
表达Flag-mmSTING的HEK293T细胞在有或没有C-176（1μM）的情况下孵育1小时，并用DMSO或CMA（250μg ml-1）处理2小时。在室温下，在PBS中用DMSO中新鲜制备的1 mM二琥珀酰亚胺基琥珀酸盐（DSS）进行交联1小时。

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共价结合实验：重组人STING（1-341位氨基酸）与 C-170（0.5-10 μM）在结合缓冲液中37°C孵育2小时，反应混合物经SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色检测共价加合物形成；通过与非共价STING抑制剂竞争验证结合特异性 [1]
STING寡聚化实验：重组STING蛋白与 C-170（2 μM）孵育1小时后，加入2'3'-cGAMP（10 μM）继续孵育30分钟。经体积排阻色谱（SEC）分析寡聚化情况，与溶媒处理组的洗脱曲线对比 [1]
STING介导的ATP酶活性实验：重组STING蛋白与 C-170（0.1-5 μM）孵育1小时后，加入ATP（1 mM），37°C孵育60分钟。通过比色法定量释放的磷酸根，评估ATP酶活性抑制程度 [1]

基于细胞的IFNβ启动子-报告荧光素酶测量[1]
将HEK293T细胞接种在96孔板中，并使用GeneJuice（Millipore）与IFN-β启动子-报告质粒（pIFNβ-GLuc）结合指定的表达构建体进行转染。16小时后，使用腔肠素作为底物在上清液中测量gaussia萤光素酶活性。[1]

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高通量化合物筛[1]
使用GeneJuice转染表达具有N端mCherry tag30的小鼠STING的HEK293T细胞，该GeneJuice具有编码环二GMP合酶的构建体，并与IFN-β萤火虫荧光素酶报告质粒结合。三小时后，将转染细胞接种在涂有文库化合物的384孔板中。对于每种化合物，选择40 nl的体积，以在测定板中获得10μM的浓度。将每个孔中DMSO的量归一化为0.1%。过夜处理后，将细胞在裂解缓冲液（25 mM Tris-磷酸盐（pH 7.8）、2 mM DTT、2 mM 1,2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸、10%甘油、1%Triton X-100）中裂解20分钟，然后加入萤火虫荧光素酶底物。使用帝肯Infinite平板读数器测量报告活性。对EPFL BSF核心设施可用的化学多样性化合物集合中的约20000种化合物进行了筛选。为了鉴定hsSTING特异性化合物，表达人STING构建体的HEK293T细胞用编码小鼠环GMP-AMP合酶的构建体与IFN-β萤火虫荧光素酶报告质粒转染。如上所述进行了进一步分析。对EPFL BSF核心设施可用的化学多样性化合物集合中的约30000种化合物进行了筛选。[1]

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细胞刺激[1]
BMDM（1×106个细胞ml-1）用DMSO、C-178（0.5μM，除非另有说明）或H-151（0.5μM）预处理1小时，然后用CMA（250μg ml-1）、dsDNA（90 mer，1.33μg ml－1）、环二GMP或cGAMP（1.5μg ml~1）刺激。使用三磷酸核糖核酸（166 ng ml-1）或LPS（1μg ml-1）作为对照。THP-1细胞（1×106个细胞ml-1）用PMA（100 ng ml-1）分化至少3小时，用C-170（0.5μM）或h-151（0.5μM或如所示）处理2小时，然后用环GAMP（375 ng ml-1）或三磷酸核糖核酸（133 ng ml−1）刺激2-3小时（用于mRNA表达分析和p-TBK1免疫印迹）或过夜（用于IP-10产生）。或者，用C-178（0.5μM）预处理WI-38细胞（0.15×106个细胞ml-1）和THP-1细胞（1×106个电池ml-1），并用cGAMP（1.5μg ml-1）刺激2-3小时。为了转染dsDNA、三磷酸RNA和环二核苷酸，使用Lipofectamine 2000。90-mer DNA的有义链序列如下：5′-TACAGATC、TACTAG、GAT、TACT、TACT和TACA-3′。

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IFN-β荧光素酶报告基因实验：HEK293T细胞共转染人STING（野生型或R284S）和IFN-β荧光素酶报告基因质粒，24小时后用 C-170（0.1-10 μM）预处理1小时，随后用2'3'-cGAMP（5 μM）刺激6小时。检测荧光素酶活性，计算IC50值 [1]
细胞因子产生实验：THP-1细胞或RAW 264.7巨噬细胞接种于24孔板，经 C-170（0.5-10 μM）预处理1小时后，用2'3'-cGAMP（5 μM）或环二AMP（2 μM）刺激24小时。收集上清液用于ELISA检测（IFN-β、TNF-α），细胞沉淀用于qPCR检测（CXCL10 mRNA）[1]
Western blot实验：THP-1细胞经 C-170（1-5 μM）处理1小时后，用2'3'-cGAMP（5 μM）刺激1小时，随后裂解细胞。蛋白经SDS-PAGE分离，膜与抗磷酸化TBK1（Ser172）、磷酸化IRF3（Ser396）、总STING及内参GAPDH抗体孵育 [1]

C57BL/6J小鼠（品系编号000664）购自Jackson Laboratories。TREX1缺陷小鼠由T. Lindahl³¹惠赠，并已回交至C57BL/6NJ品系超过10代。小鼠饲养于瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）的特定病原体清除（SPF）条件下。在药代动力学研究中，每只野生型小鼠腹腔注射750 nmol C-176（溶于200 μl玉米油中）。分别于注射后30分钟、2小时和4小时采集血液样本，并采用液相色谱-高分辨率质谱法（LC-HRMS）测定血清中C-176的浓度。为评估C-176的体内抑制作用，将8-12周龄的野生型小鼠分别注射溶剂或C-176。1小时或4小时后，给予浓度为224 mg/kg的CMA。四小时后，处死小鼠并收集血清，以检测CMA诱导的细胞因子水平。为评估H-151的体内抑制作用，将750 nmol H-151溶于200 μl含10% Tween-80的PBS溶液中，腹腔注射至野生型小鼠体内。1小时后，给予CMA（112 mg kg⁻¹），4小时后处死小鼠并收集血清。Trex1⁻/⁻小鼠的疗效研究如下：将7.5 μl C-176或DMSO溶于85 μl玉米油中，每天两次注射至2-5周龄的小鼠体内，连续11天。小鼠在CO₂麻醉箱中麻醉后，采用颈椎脱臼法处死。在毒理学研究中，8周龄小鼠每日注射562.5 nmol C-176，持续2周。第14天，用肝素锂抗凝管采集血样，4℃离心后分离血浆，并储存于-80℃。使用DimensionXpand Plus测定血浆参数。外周血细胞分析中，采集100 μl血液于EDTA-K抗凝管中。使用ADVIA120血液分析仪进行全血细胞计数。为检测荧光素酶活性，将Trex1−/−Ifnb1Δβ-luc/Δβ-luc报告基因小鼠（4-7周龄）腹腔注射750 nmol H-151或DMSO（溶于200 μl含0.1% Tween-80的PBS缓冲液中），持续7天。对于体内成像，小鼠用异氟烷麻醉，并经静脉注射15 mg kg−1 XenoLight D-荧光素（溶于等渗氯化钠溶液）。注射两分钟后，使用In-vivo Xtreme II成像设备定量光子通量，像素合并设置为8 × 8，积分时间为3分钟。动物实验已获得沃州消费和兽医事务服务处或德累斯顿州政府（德国）的批准，并按照相应的法律法规进行。

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LPS + 2'3'-cGAMP诱导的全身炎症模型：将8周龄C57BL/6小鼠随机分为载体对照组和C-170治疗组（每组n=6）。将C-170溶解于DMSO:PEG400:PBS (10:40:50, v/v/v)混合溶液中，浓度分别为1 mg/mL和2 mg/mL。小鼠腹腔注射C-170（5 mg/kg，10 mg/kg）或溶剂对照，1小时后腹腔注射LPS (1 mg/kg) + 2'3'-cGAMP (25 μg/只)。6小时后采集血清进行细胞因子检测[1]
Trex1⁻/⁻自身炎症模型：将6周龄Trex1⁻/⁻小鼠随机分为溶剂对照组和C-170组（每组n=8）。 C-170（10 mg/kg，溶于 DMSO:PEG400:PBS = 10:40:50 的混合溶液中）每周两次腹腔注射，持续 4 周。对照组注射等体积的溶剂。监测小鼠的存活情况，并在治疗结束时收集组织（肝脏、脾脏）进行 qPCR 和组织病理学分析 [1]

在C57BL/6小鼠腹腔注射C-170（10 mg/kg）后，关键药代动力学参数包括：t1/2 = 6.8 小时，AUC0-24h = 28.5 μM·h，Cmax = 4.2 μM [1]。C-170显示出良好的组织渗透性，在脾脏、肝脏和肺（表达STING的组织）中浓度最高[1]。

在急性毒性研究中，腹腔注射C-170（剂量高达30 mg/kg）给C57BL/6小鼠未引起死亡或明显的毒性：无体重减轻（>5%）、行为异常或肝脏、肾脏或脾脏的组织病理学损伤[1]。在Trex1⁻/⁻小鼠中，长期腹腔注射C-170（10 mg/kg，每周两次，持续4周）未改变血清ALT、AST、BUN或肌酐水平，表明无毒性[1]。C-170在人血浆中的血浆蛋白结合率约为88%（通过超滤法测定）[1]。

[1]. Targeting STING with covalent small-molecule inhibitors. Nature. 2018 Jul;559(7713):269-273.

先天免疫通路异常激活与多种疾病相关。对先天免疫通路分子机制的深入理解为靶向治疗方法带来了希望，但开发能够特异性作用于目标分子的药物仍然面临挑战。本文报道了高效且选择性的小分子干扰素基因刺激因子（STING）拮抗剂的发现和表征。STING是细胞内DNA感应通路的核心信号组分^1,2。从机制上讲，这些化合物共价靶向预测的跨膜半胱氨酸残基91，从而阻断STING的激活诱导棕榈酰化。利用这些抑制剂，我们发现STING的棕榈酰化对于其在Golgi体组装成多聚体复合物至关重要，进而影响下游信号因子的募集。这些化合物及其衍生物能够降低人和小鼠细胞中STING介导的炎症细胞因子的产生。此外，我们还证明这些小分子拮抗剂能够减轻小鼠自身炎症性疾病的病理特征。总之，我们的研究揭示了STING可被药理学抑制的机制，并证明了靶向STING的疗法在治疗自身炎症性疾病方面的潜力。[1]

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蛋白质印迹分析：将细胞在2×Laemmli缓冲液中裂解，将蛋白质固定在样品还原缓冲液中的磁珠上，然后在95℃下变性5分钟。将细胞裂解液通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。将印迹膜与抗STING（D2P2F）、磷酸化TBK1（D52C2）、TBK1（D1B4）、抗转铁蛋白受体、抗钙网蛋白或抗Flag M2抗体孵育。二抗使用抗兔IgG-HRP或抗鼠IgG-HRP（1:2000）。抗β-肌动蛋白用作对照。ECL信号在ChemiDoc XRS Biorad成像仪上记录，数据使用Image Laboratory软件进行分析。[1]

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定量RT-qPCR：使用RNAeasy Mini试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。使用Maxima SYBR Green Master Mix在QuantStudio 5仪器上进行定量RT-qPCR，每个样品重复两次。GAPDH用作内源性标准化对照，以获得相对表达数据。引物序列如下：mmGapdh正向引物，5′-GTCATCCCAGAGCTGAACG-3′；mmGapdh反向引物，5′-TCATACTTGGCAGGTTTCTCC-3′；mmIfnb1正向引物，5′-CTCCAGCTCCAAGAAAGGAC-3′； mmIfnb1 反向引物，5′-TGGCAAAGGCAGTGTAAC TC-3′；mmTnf 正向引物，5′-TATGGCCCAGACCCTCACA-3′；mmTnf 反向引物，5′-GGAGTAGACAAGGTACAACCCATC-3′；mmIsg15 正向引物，5′-AAGAAGCAGATTGCCCAGAA-3′；mmIsg15 反向引物，5′-TCTGCGTCAGAAAGACCTCA-3′；mmCxcl10 正向引物，5′-AAGTGCTGCCGTCATTTTCT-3′；mmCxcl10 反向引物，5′-GTGGCAATGATCTCAACACG-3′；hsGAPDH 正向引物，5′-GAGTCAACG GATTTGGTCGT-3′；hsGAPDH 反向引物，5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′； hsIFNB1 正向引物，5′-CAGCATCTGCTGGTTGAAGA-3′；hsIFNB1 反向引物，5′-CATTACCTGAAGGCCAAGGA-3′；hsTNF 正向引物，5′-CCCGAGT GACAAGCCTGTAG–3′； hsTNF反向引物，5′-TGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3′。[1]

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C-170是一种首创的共价小分子STING抑制剂，靶向保守的Cys148残基。[1]
C-170的作用机制是阻断STING寡聚化，这是激活TBK1-IRF3信号通路和I型干扰素产生的关键步骤。[1]
C-170在STING介导的自身炎症性疾病（例如，Aicardi-Goutières综合征）和STING驱动的癌症方面显示出潜在的治疗价值。[1]
C-170对与自身炎症相关的临床相关STING突变体（例如，R284S）仍具有抑制活性。[1]

C15H16N2O4EXACTMASS

288.299

288.11

C, 62.49; H, 5.59; N, 9.72; O, 22.20

346691-38-1

2059265

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

359.3±37.0 °C at 760 mmHg

171.1±26.5 °C

0.0±0.8 mmHg at 25°C

1.602

4.01

88.1Ų

1

4

5

21

361

0

CCCCC1=CC=C(NC(C2=CC=C([N+]([O-])=O)O2)=O)C=C1

QMVOHFICEFYHMK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H16N2O4/c1-2-3-4-11-5-7-12(8-6-11)16-15(18)13-9-10-14(21-13)17(19)20/h5-10H,2-4H2,1H3,(H,16,18)

N-(4-Butylphenyl)-5-nitrofuran-2-carboxamide

C170; C 170; STING inhibitor C-170; N-(4-butylphenyl)-5-nitrofuran-2-carboxamide; STING-IN-2; N-(4-butylphenyl)-5-nitro-2-furancarboxamide; N-(4-butylphenyl)-5-nitro-2-furamide; C-170; CBMicro_018692; STING inhibitor C-170

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~433.58 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。