CCG 50014

RGS4 ( IC50 = 30 nM ); RGS8 ( IC50 = 11 μM ); RGS16 ( IC50 = 3.5 μM ); RGS19 ( IC50 = 0.12 μM )

CCG-50014 对 RGS7 没有任何影响，但它在抑制 RGS4 方面非常有效，并完全抑制 RGS8、-16 和 -19 等 RGS 蛋白。此外，CCG-50014 对 RGS4Cys−（RGS4 同源域中缺乏半胱氨酸残基的 RGS4 突变变体）没有影响。通过 CCG-50014 与 RGS 的共价结合，在变构调节位点的两个半胱氨酸残基上形成加合物。在活细胞中，CCG-50014 可以阻断 RGS4-Gαo 蛋白质-蛋白质相互作用。 CCG-50014 是具有细胞活性的新型小分子 RGS 抑制剂的第一个成员。 [1] [2]

CCG50014（10、30 或 100 nM）以剂量依赖性方式减弱后期的伤害性反应[2]。接受福尔马林注射的小鼠表现出典型的双相伤害性行为。RGS4敲除小鼠的伤害性反应在晚期显著降低，但在早期没有。类似地，鞘内给药CCG50014（10、30或100 nmol）在晚期以剂量依赖性方式减弱了伤害性反应。纳洛酮（5mg/kg）完全阻断RGS4抑制剂的镇痛作用。相反，鞘内注射DAMGO在早期和晚期实现了伤害性反应的剂量依赖性减少。RGS4的基因缺失或CCG50014（10nmol）的联合给药显著增强了DAMGO的这种镇痛作用。

在这里，我们描述了迄今为止最有效的小分子RGS抑制剂CCG-50014的药理学特性和作用机制。它对RGS4具有30nM的IC（50），并且对RGS4的选择性是其他RGS蛋白的>20倍。CCG-50014与RGS共价结合，在位于变构调控位点的两个半胱氨酸残基上形成加合物。它不是一般的半胱氨酸烷基化物，因为它在比抑制RGS4功能所需的浓度高3000倍以上的浓度下不会抑制半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶的活性。作为RGS4抑制剂，它的效力也是半胱氨酸烷基化剂N-乙基马来酰亚胺和碘代乙酰胺的1000倍以上。对该化合物的半胱氨酸反应性的分析表明，与RGS8中的Cys（107）结合的化合物以可通过切割化合物RGS二硫键逆转的方式抑制Gα结合。如果化合物与RGS8中的Cys（160）反应，加合物诱导RGS变性，并且不能通过去除化合物来恢复活性。CCG-50014的高效能和良好的选择性使其成为研究RGS4功能作用的有用工具[2]。

化合物对卡巴胆碱模拟Ca++反应的影响[2]
用人M3毒蕈碱受体稳定转染的HEK-293细胞在黑色、透明底的96孔板中过夜。根据制造商的说明，他们装载了Fluo4 NW。在37°C下加载30分钟后，加入浓度为10μM（含1%DMSO）的指示化合物。30–45分钟后，在Flex-3平板读取器（Molecular Devices）中测量基线荧光。然后，将卡巴胆碱（最终10nM）注射到孔中，并测量细胞内Ca++的增加，并表示为基线Ca++水平的百分比。数值为三次测定（化合物）和16次测定（DMSO）的平均值±SD。

Intrathecal Drug Treatment[3]
Each drug was administered by intrathecal injection based on the technique developed by Hylden and Wilcox.20 Drugs were dissolved in 5 µL of vehicle. We injected a 5-µL volume intrathecally because data suggest that this is likely to be the upper limit that can be reliably injected into a mouse without appreciable redistribution of the drug through the cerebrospinal fluid to the basal cisterns of the brain. In brief, for mouse intrathecal injections, a 30-gauge needle (length: 0.5 inch) connected to a 50-µL Hamilton syringe was inserted into the subarachnoid space between the lumbar vertebrae L5 and L6. A flick of the mouse’s tail provided a reliable indicator that the needle had penetrated the dura mater. The syringe was held in position for a few seconds after the injection of 5 µL/mouse.[3]

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Formalin-Induced Pain Behaviors[3]
Mice were first acclimatized for 30 minutes in an acrylic observation chamber (size ranges 12 × 12× 12 cm); 20 µL of 1% formalin was then injected subcutaneously into the plantar surface of the right hindpaw with a 30-gauge needle, as previously described.21 After injection of formalin, mice were immediately placed in a test chamber; nociceptive responses were digitally videotaped from underneath a glass floor for 40 minutes. The summation of time (in seconds) spent licking and biting the formalin-injected hindpaw during each 5-minute block was measured as an indicator of nociception. The duration of the responses during the first 10-minute period represented the early phase, whereas the duration of responses during the subsequent 30-minute period (from 10 to 40 minutes after injection) represented the late phase of the formalin test. In this experiment, CCG50014 (10, 30, or 100 nmol) or DAMGO (0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, or 100 pmol) was intrathecally injected 5 minutes before the formalin injection. Naloxone (5 mg/kg) was administered intraperitoneally 30 minutes before intrathecal administration of CCG50014 (100 nmol). The dose of naloxone was selected based on previously published work.

[1]. Biochemistry. 2011 Apr 19;50(15):3181-92.

[2]. ACS Med Chem Lett. 2012 Feb 9;3(2):146-150.

[3]. Anesth Analg. 2015 Mar;120(3):671-677.

4-(4-Fluorobenzyl)-2-p-tolyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione has been reported in Curculigo orchioides with data available.

C16H13FN2O2S

316.35

316.068

C, 60.75; H, 4.14; F, 6.01; N, 8.86; O, 10.11; S, 10.13

883050-24-6

2733079

White to light yellow solid powder

2.556

72.24

0

4

3

22

432

0

O=C1N(CC2C=CC(F)=CC=2)C(=O)N(C2C=CC(C)=CC=2)S1

QUIIIYITNGOFEI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H13FN2O2S/c1-11-2-8-14(9-3-11)19-15(20)18(16(21)22-19)10-12-4-6-13(17)7-5-12/h2-9H,10H2,1H3

4-[(4-fluorophenyl)methyl]-2-(4-methylphenyl)-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。