4SC-202, a novel class I HDAC inhibitor (HDACi), potently inhibited survival and proliferation of primary human colon cancer cells and established CRC lines (HT-29, HCT-116, HT-15, and DLD-1). Yet, the same 4SC-202 treatment was non-cytotoxic to colon epithelial cells where HDAC-1/-2 expressions were extremely low. 4SC-202 provoked apoptosis activation in CRC cells, while caspase inhibitors (z-VAD-CHO and z-DVED-CHO) significantly alleviated 4SC-202-exerted cytotoxicity in CRC cells. Meanwhile, 4SC-202 induced dramatic G2-M arrest in CRC cells. Further studies showed that AKT activation might be an important resistance factor of 4SC-202. 4SC-202-induced cytotoxicity was dramatically potentiated with serum starvation, AKT inhibition (by perifosine or MK-2206), or AKT1-shRNA knockdown in CRC cells. On the other hand, exogenous expression of constitutively active AKT1 (CA-AKT1) decreased the sensitivity by 4SC-202 in HT-29 cells. [1]

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We determined dose response curves of 4SC-202 by MTT assay in seven UC cell lines with distinct HDAC1, HDAC2 and HDAC3 expression profiles. Cellular effects were further analyzed in VM-CUB1 and UM-UC-3 cells by colony forming assay, caspase-3/7 assay, flow cytometry, senescence assay, LDH release assay, and immunofluorescence staining. Response markers were followed by quantitative real-time PCR and western blotting. Treatment with the class I HDAC specific inhibitor SAHA (vorinostat) served as a general control.Results,4SC-202 significantly reduced proliferation of all epithelial and mesenchymal UC cell lines (IC50 0.15-0.51 μM), inhibited clonogenic growth and induced caspase activity. Flow cytometry revealed increased G2/M and subG1 fractions in VM-CUB1 and UM-UC-3 cells. Both effects were stronger than with SAHA treatment.[2]

4SC-202 是一种新型 I 类 HDAC 抑制剂 (HDACi)，可有效抑制原发性人类结肠癌细胞和已建立的 CRC 系 (HT-29、HCT-116、HT-15 和 DLD-1) 的存活和增殖。然而，同样的 4SC-202 治疗对结肠上皮细胞无细胞毒性，因为结肠上皮细胞的 HDAC-1/-2 表达极低。4SC-202 可激发 CRC 细胞凋亡，而 caspase 抑制剂 (z-VAD-CHO 和 z-DVED-CHO) 可显著减轻 4SC-202 对 CRC 细胞的细胞毒性。同时，4SC-202 可诱导 CRC 细胞发生显著的 G2-M 停滞。进一步的研究表明，AKT 激活可能是 4SC-202 的重要耐药因素。在 CRC 细胞中，血清饥饿、AKT 抑制（通过哌利福星或 MK-2206）或 AKT1-shRNA 敲低均显著增强 4SC-202 诱导的细胞毒性。另一方面，外源表达组成性活性 AKT1 (CA-AKT1) 降低了 HT-29 细胞对 4SC-202 的敏感性。[1]

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我们通过 MTT 测定法在七种具有不同 HDAC1、HDAC2 和 HDAC3 表达谱的 UC 细胞系中确定了 4SC-202 的剂量反应曲线。通过菌落形成测定、caspase-3/7 测定、流式细胞术、衰老测定、LDH 释放测定和免疫荧光染色进一步分析了 VM-CUB1 和 UM-UC-3 细胞中的细胞效应。通过定量实时 PCR 和蛋白质印迹法跟踪反应标记。使用 I 类 HDAC 特异性抑制剂 SAHA（伏立诺他）治疗作为一般对照。结果显示，4SC-202 显著降低了所有上皮和间质 UC 细胞系的增殖（IC50 0.15-0.51 μM），抑制了克隆生长并诱导了 caspase 活性。流式细胞术显示 VM-CUB1 和 UM-UC-3 细胞中的 G2/M 和 subG1 分数增加。这两种效果都比 SAHA 治疗强。[2]

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4SC-202（查询中称为Domatinostat）能显著降低七种具有不同表型和HDAC表达谱的尿路上皮癌（UC）细胞系的增殖能力，经MTT法测定，处理72小时后的IC50值范围在0.15 µM至0.51 µM之间。[1]
在克隆形成实验中，用0.5 µM和2.5 µM的4SC-202处理VM-CUB1和UM-UC-3 UC细胞24或48小时，能强烈且持久地抑制其克隆形成生长，其效果比泛HDAC抑制剂SAHA（伏立诺他）更持久。[1]
4SC-202 (0.5 和 2.5 µM) 在UC细胞系（VM-CUB1, UM-UC-3）和对照细胞系（HBLAK, HEK-293）中处理24和48小时后，能诱导显著的caspase-3/7活性，表明其诱导细胞凋亡。该效果比SAHA处理更为显著。[1]
Western blot分析显示，经4SC-202处理的VM-CUB1和UM-UC-3细胞中，切割的PARP水平增加，进一步证实了凋亡诱导。[1]
用4SC-202 (2.5 µM, 48小时) 处理UM-UC-3细胞能诱导显著的乳酸脱氢酶（LDH）释放，表明存在坏死性细胞死亡。VM-CUB1和UM-UC-3细胞的Annexin V/PI染色显示凋亡和坏死细胞死亡的混合模式，早期凋亡、晚期凋亡/坏死以及坏死细胞群均有所增加，尤其是在2.5 µM浓度下。[1]
流式细胞术细胞周期分析显示，4SC-202 (2.5 µM) 在24小时后诱导VM-CUB1、UM-UC-3和HEK-293细胞大量积聚在G2/M期。48小时后，细胞周期分布图变得高度不规则，具有subG1和异常DNA含量的细胞增加。[1]
4SC-202处理 (0.5 和 2.5 µM) 提高了VM-CUB1和UM-UC-3细胞中组蛋白H3的乙酰化水平。组蛋白H4的乙酰化变化较弱且发生较晚。该化合物不影响α-微管蛋白的乙酰化，证实了其对I类HDAC（而非HDAC6）的特异性。[1]
DAPI染色和核形态分析显示，4SC-202处理在24和48小时后，诱导VM-CUB1和UM-UC-3细胞中出现高比例的不规则有丝分裂、严重碎片化的细胞核以及微核。[1]
VM-CUB1细胞的免疫荧光染色显示，4SC-202 (2.5 µM, 24小时) 强烈增加了全核γH2A.X染色，部分病灶性诱导与53-BP1共定位，表明DNA损伤应答被激活。[1]
将4SC-202与单独使用I类HDAC抑制剂（罗米地辛）和LSD1抑制剂（SP2509）进行比较的组合实验表明，4SC-202的双重抑制活性对其影响细胞活力和克隆形成能力有贡献，但其独特的细胞周期和形态学影响可能无法完全由该组合模拟。[1]

低浓度的 4SC-202 增强了奥沙利铂诱导的体外抗 CRC 活性。在体内，我们发现口服灌胃 4SC-202 可抑制裸鼠中 HT-29 异种移植瘤的生长，而当与奥沙利铂联合使用时，其活性进一步增强。总之，这些临床前结果表明，4SC-202 可作为有价值的抗 CRC 药物/化学佐剂进一步研究。

对于细胞活力/增殖实验（MTT法），将尿路上皮癌细胞系和对照细胞系接种于96孔板中。用一系列浓度的4SC-202或DMSO对照处理细胞72小时。孵育后，加入MTT试剂（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）。代谢活跃细胞产生的甲臜晶体被溶解，测量特定波长下的吸光度以确定细胞活力。使用非线性回归分析计算IC50值。[1]
对于克隆形成实验，将细胞以低密度（每皿500-1500个细胞）接种于培养皿中。用4SC-202、SAHA或DMSO处理24或48小时后，更换为不含药物的新鲜培养基。细胞被允许生长两周以形成集落。然后洗涤集落，用甲醇固定，吉姆萨染色，并进行计数。[1]
对于细胞凋亡评估（Caspase-Glo 3/7法），在多孔板中用4SC-202或对照处理细胞24或48小时。将一部分细胞悬液转移到96孔板中。加入Caspase-Glo 3/7试剂，孵育后测量化学发光强度。结果通过与CellTiter-Glo法并行测定的细胞活力进行标准化。[1]
对于坏死评估（LDH释放法），用4SC-202或对照处理细胞。孵育期结束后，收集培养上清液。使用商业细胞毒性检测试剂盒按照说明书测量上清液中的LDH活性，该测定涉及产生比色产物的偶联酶反应，并测量吸光度。[1]
对于流式细胞术细胞周期分析，收集处理后的细胞（贴壁和悬浮细胞），洗涤，并用含有Triton X-100和柠檬酸钠的碘化丙啶（PI）缓冲液染色。分析染色细胞的DNA含量和细胞周期分布。[1]
对于流式细胞术Annexin V/PI凋亡/坏死分析，收集处理后的细胞，洗涤，并重悬于Annexin V结合缓冲液中。然后用Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，并通过流式细胞术分析以区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡/坏死细胞和坏死细胞。[1]
对于免疫荧光染色（例如γH2A.X、53-BP1），将生长在盖玻片上的细胞进行处理，用甲醛固定，透化，并封闭。然后在4°C下与一抗孵育过夜，随后与荧光标记的二抗孵育。用DAPI复染细胞核。封片后使用荧光显微镜获取图像。[1]

[1]. Tumour Biol . 2016 Aug;37(8):10257-67.

[2]. Target Oncol . 2016 Dec;11(6):783-798.

4SC-202 is a novel, oral, benzamide-type, isotype-specific histone deacetylase (HDAC) inhibitor. It selectively inhibits class I HDACs (HDAC1, 2, 3) and the histone demethylase LSD1 (KDM1A). [1]
The antineoplastic effect of 4SC-202 on urothelial carcinoma cells is characterized by a combined induction of apoptotic and necrotic cell death, likely as a consequence of severe cell cycle disruption, particularly mitotic disturbances and DNA damage, leading to mitotic catastrophe. [1]
4SC-202 was more efficacious in inhibiting clonogenic growth of UC cells compared to the pan-HDAC inhibitor SAHA (vorinostat). [1]
This preclinical study suggests that combined inhibition of HDAC1, HDAC2, and HDAC3 (and potentially LSD1) by 4SC-202 represents a promising treatment strategy for urothelial carcinoma. [1]
4SC-202 has been tested in a phase I trial (TOPAS) for advanced hematological malignancies. [1]

1186222-89-8; 910462-43-0 (free)

Typically exists as solid at room temperature

Domatinostat HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。