E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14

目录号: V31992 纯度: ≥98%
E3 连接酶配体-接头缀合物 14 是一种合成化合物,其中包含 E3 连接酶配体和 PROTAC 技术中使用的接头。
E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14 CAS号: 1957236-21-3
产品类别: E3 Ligase Ligand-Linker Conjugates
产品仅用于科学研究,不针对患者销售
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产品描述
E3 连接酶配体-接头缀合物 14 是一种合成化合物,其中包含 E3 连接酶配体和 PROTAC 技术中使用的接头。
生物活性&实验参考方法
靶点
1. Von Hippel-Lindau (VHL) E3 ubiquitin ligase (acts as the E3-recruiting moiety of the bifunctional molecule); bromodomain-containing protein 4 (BRD4, EC50 for protein degradation = 3 nM, the targeted protein for degradation) [1]
体外研究 (In Vitro)
1. 蛋白降解活性:在HEK293T细胞中,E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14对BRD4表现出强效且选择性的降解活性;处理24 h后,导致50%目标蛋白降解的浓度(DC50)为3 nM,10 nM浓度下最大降解效率(Dmax)达>90%。在浓度高达100 nM时,对BRD2、BRD3等脱靶溴结构域蛋白无显著降解作用,证实了对BRD4的靶向选择性[1]
2. 细胞抗增殖活性:在依赖BRD4增殖的MV4-11急性髓系白血病细胞中,E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14处理72 h后对细胞活力的抑制IC50为12 nM;通过siRNA敲低VHL表达后,该抗增殖作用完全消失,验证其活性依赖于VHL介导的BRD4降解[1]
3. 体外机制验证:在无细胞泛素化实验体系中,E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14可在纯化的VHL复合物、E1酶、E2酶及泛素存在下,促进BRD4-泛素结合物的形成;10 nM浓度下,泛素化BRD4的生成量较对照组增加85%,证实其可桥接VHL与BRD4并诱导泛素化[1]
酶活实验
1. 体外泛素化实验:构建包含纯化E1酶、E2酶、泛素、VHL E3连接酶复合物、重组BRD4蛋白及梯度浓度E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14(0.1-100 nM)的反应体系,加入ATP启动反应并于37℃孵育2 h,随后加入SDS-PAGE上样缓冲液终止反应。样品经SDS-PAGE电泳、转膜后,用抗BRD4和抗泛素抗体进行蛋白印迹检测,定量泛素化BRD4条带的灰度值,以此评估该偶联物的泛素化促进活性[1]
2. VHL结合实验:采用荧光偏振(FP)实验检测E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14的VHL配体结构域与VHL复合物的结合亲和力。将纯化的VHL复合物进行荧光探针标记,向体系中加入系列浓度的偶联物(终浓度范围0.01-1000 nM),室温孵育1 h后检测荧光偏振信号,通过拟合FP信号曲线计算得结合亲和力Kd=1.2 nM[1]
细胞实验
1. BRD4降解检测实验:将HEK293T细胞以2×10^5个/孔的密度接种于6孔板,孵育24 h贴壁后,用不同浓度E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14(0.1-100 nM)处理24 h,同时设置载体对照组和VHL配体单独对照组。采用含蛋白酶抑制剂的裂解液提取细胞总蛋白,通过蛋白印迹实验检测BRD4、BRD2、BRD3及内参蛋白的表达水平,对BRD4的相对表达量进行灰度定量,计算DC50和Dmax值[1]
2. 细胞活力实验:将MV4-11细胞以5×10^3个/孔的密度接种于96孔板,贴壁12 h后,用系列浓度E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14(0.01-1000 nM)处理72 h;VHL敲低组细胞则在给药前48 h转染VHL靶向siRNA。向各孔加入细胞活力检测试剂并37℃孵育3 h,检测对应波长吸光度,计算相对于载体对照组的细胞活力,拟合量效曲线得到IC50值[1]
3. siRNA敲低验证实验:将HEK293T细胞接种于6孔板,细胞汇合度达50%时,用转染试剂将VHL特异性siRNA或阴性对照siRNA转入细胞。转染48 h后,用E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14(10 nM)处理细胞24 h,通过蛋白印迹实验检测VHL和BRD4的表达水平,证实VHL的缺失会消除该偶联物的BRD4降解作用[1]
动物实验
1. 皮下异种移植瘤模型建立:将5×10^6个MV4-11细胞悬浮于PBS和基质凝胶(1:1,v/v)混合物中,皮下注射至NOD/SCID小鼠(6-8周龄,雌性)右侧腹部。待肿瘤生长至约150 mm³(接种后约10天)后进行分组治疗[1]
2. 给药方案:将小鼠随机分为三组(载体对照组、5 mg/kg E3连接酶配体-连接子偶联物14组、10 mg/kg E3连接酶配体-连接子偶联物14组),每组8只小鼠。将缀合物溶解于DMSO、PEG400和生理盐水(10:40:50,v/v/v)的混合溶剂中,制备给药溶液(DMSO最终浓度<1%)。药物通过腹腔注射给药,剂量为每克小鼠体重10 μL,每隔一天给药一次,共14天(共给药7次)。对照组注射相同体积的混合溶剂,但不含缀合物[1]
3. 样品采集和检测:给药期间,每3天记录小鼠体重和肿瘤体积(用游标卡尺测量,体积=长×宽²/2)。最后一次给药后,处死小鼠,解剖并称重肿瘤组织,取部分肿瘤组织进行蛋白质提取和Western blot分析,以检测BRD4的表达;另一部分组织用福尔马林固定,用于免疫组织化学染色,以评估肿瘤组织中泛素化蛋白的水平[1]
参考文献

[1]. METHODS TO INDUCE TARGETED PROTEIN DEGRADATION THROUGH BIFUNCTIONAL MOLECULES. WO2017024317A2.

其他信息
1. E3连接酶配体-连接子缀合物14 (E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14) 是一种双功能蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 分子,由三个部分组成:VHL E3泛素连接酶结合配体、聚乙二醇 (PEG) 基连接子和BRD4结合配体 [1]
2. E3连接酶配体-连接子缀合物14 (E3 ligase Ligand-Linker Conjugates 14) 的作用机制是通过同时结合BRD4(靶蛋白)和VHL E3连接酶形成三元复合物,从而募集泛素化机制至BRD4,促进泛素链与BRD4的共价连接,最终导致BRD4通过26S蛋白酶体途径降解 [1]
3. E3连接酶配体-连接子缀合物14 是为治疗由 BRD4 信号异常驱动的血液系统恶性肿瘤(例如急性髓系白血病)而设计的,其连接子的长度和结构经过优化,以增强三元复合物的形成并提高靶标降解效率[1]
*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C25H31F3N4O11
分子量
620.529057741165
精确质量
620.194
CAS号
1957236-21-3
PubChem CID
121439766
外观&性状
White to off-white solid powder
tPSA
213
氢键供体(HBD)数目
4
氢键受体(HBA)数目
15
可旋转键数目(RBC)
15
重原子数目
43
分子复杂度/Complexity
892
定义原子立体中心数目
0
SMILES
FC(C(=O)O)(F)F.O=C1C(CCC(N1)=O)N1C(C2C=CC=C(C=2C1=O)OCC(NCCOCCOCCOCCN)=O)=O
InChi Key
BLYRZYHKZRITLJ-UHFFFAOYSA-N
InChi Code
InChI=1S/C23H30N4O9.C2HF3O2/c24-6-8-33-10-12-35-13-11-34-9-7-25-19(29)14-36-17-3-1-2-15-20(17)23(32)27(22(15)31)16-4-5-18(28)26-21(16)30;3-2(4,5)1(6)7/h1-3,16H,4-14,24H2,(H,25,29)(H,26,28,30);(H,6,7)
化学名
N-[2-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethoxy]ethyl]-2-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-4-yl]oxyacetamide;2,2,2-trifluoroacetic acid
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意: 请将本产品存放在密封且受保护的环境中,避免吸湿/受潮。
运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
DMSO : ~50 mg/mL (~80.58 mM)
溶解度 (体内实验)
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方,主要用于溶解难溶或不溶于水的产品(水溶度<1 mg/mL)。 建议您先取少量样品进行尝试,如该配方可行,再根据实验需求增加样品量。

注射用配方
(IP/IV/IM/SC等)
注射用配方1: DMSO : Tween 80: Saline = 10 : 5 : 85 (如: 100 μL DMSO 50 μL Tween 80 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备:将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中,得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL DMSO 400 μL PEG300 50 μL Tween 80 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL DMSO 900 μL Corn oil)
示例: 注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液,加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。
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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如:100 μL DMSO 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备(4°C,储存1周):将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中,得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如: 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精) 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如: 50 μL DMSO 100 μL PEG300 200 μL Castor oil 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10: 10 : 80 (如: 100 μL Ethanol 100 μL Cremophor 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如: 100 μL EtOH 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如: 100 μL EtOH 400 μL PEG300 50 μL Tween 80 450 μL Saline)


口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中,得到0.5%CMC-Na澄清溶液;然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中,得到悬浮液。
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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合


注意: 以上为较为常见方法,仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型,对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物,需通过前期实验来确定(建议先取少量样品进行尝试),包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案:
1、请先配制澄清的储备液(如:用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液,按从左到右的顺序依次添加助溶剂,澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明,并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中,混合均匀/澄清;向上述体系中加入50 μL Tween-80,混合均匀/澄清;然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL;

3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出,可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果,工作液请现配现用!
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液,请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 1.6115 mL 8.0576 mL 16.1153 mL
5 mM 0.3223 mL 1.6115 mL 3.2231 mL
10 mM 0.1612 mL 0.8058 mL 1.6115 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液):对于大多数产品,InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如:5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度),个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息,或者很难将产品溶解在溶液中,请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算(摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等);

4、母液配好之后,将其分装到常规用量,并储存在-20°C或-80°C,尽量减少反复冻融循环。

计算器

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度,具体如下:

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示:
假如化合物的分子量为350.26 g/mol,在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少?
  • 在分子量(MW)框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在“体积”框中输入5,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式,您可以计算体积和浓度。

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如,可以输入C1、C2和V2来计算V1,具体如下:

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液?
使用方程式C1V1=C2V2,其中C1=10mM,C2=25μM,V2=25 ml,V1未知:
  • 在C1框中输入10,然后选择正确的单位(mM)
  • 在C2框中输入25,然后选择正确的单位(μM)
  • 在V2框中输入25,然后选择正确的单位(mL)
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL(0.1 ml)出现在V1框中
g/mol

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成,具体如下:

注:化学分子式大小写敏感:C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量(分子量)的说明:
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量),请输入化学/分子式,然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义:
  • 分子质量(或分子量)是一种物质的一个分子的质量,用统一的原子质量单位(u)表示。(1u等于碳-12中一个原子质量的1/12)
  • 摩尔质量(摩尔重量)是一摩尔物质的质量,以g/mol表示。
/

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器(澄清溶液)
第一步:请输入基本实验信息(考虑到实验过程中的损耗,建议多配一只动物的药量)
第二步:请输入动物体内配方组成(配方适用于不溶/难溶于水的化合物),不同的产品和批次配方组成不同,如对配方有疑问,可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外,请注意这只是一个配方计算器,而不是特定产品的确切配方。
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计算结果:

工作液浓度 mg/mL;

DMSO母液配制方法 mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度,请首先与我们联系。

体内配方配制方法μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL ddH2O,混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后,再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶;
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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