GNE-317

PI3K; mTOR
1. Phosphatidylinositol 3-Kinase α (PI3Kα, p110α/p85α complex) - IC50 ~4.5 nM (recombinant human PI3Kα, HTRF-based kinase activity assay)^[1]
- Ki ~2.2 nM (recombinant human PI3Kα, ATP-competitive binding assay)^[1]
2. High selectivity over other PI3K subtypes and unrelated kinases: - PI3Kβ (p110β/p85α): IC50 > 800 nM (same HTRF assay as PI3Kα)^[1]
- PI3Kγ (p110γ/p101): IC50 > 1000 nM (same assay)^[1]
- PI3Kδ (p110δ/p85α): IC50 > 600 nM (same assay)^[1]

在转染的 Madin-Darby 犬肾 (MDCK) 细胞中，GNE-317 不是 P-gp 或 BCRP 转运蛋白的底物。在小鼠血浆中，GNE-317 与血浆蛋白的结合显示出 14.9% 的游离分数，而其与脑组织的结合则更高，为 5.4% 的游离分数。 GNE-317 中可见细胞停滞，但 U87 细胞不会死亡。 [1]

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1. PI3Kα驱动肿瘤细胞的抗增殖活性（文献[1]）： - 乳腺癌细胞系： - MCF-7（PI3Kα E545K突变）：72小时SRB实验IC50 ~18 nM；100 nM GNE-317 14天甲基纤维素克隆形成实验抑制克隆形成~85%；50 nM 48小时诱导~55%细胞G1期阻滞（流式细胞术）。 - T47D（PI3Kα H1047R突变）：72小时IC50 ~15 nM；100 nM 72小时流式细胞术显示Annexin V阳性凋亡细胞增加~40%。 - 结直肠癌细胞系（HCT-116，PTEN缺陷）：72小时IC50 ~22 nM；50 nM 24小时降低磷酸化AKT（Ser473）~90%、磷酸化S6（Ser235/236）~85%（Western blot）。 - PI3Kα野生型/PTEN正常细胞活性低：MDA-MB-231（乳腺癌，PI3Kα WT/PTEN WT）72小时IC50 > 500 nM^[1]
2. PI3K-AKT信号通路抑制（文献[1]）： - 血清饥饿的MCF-7细胞与GNE-317（10-500 nM）孵育1小时后，用胰岛素（100 nM）刺激15分钟。50 nM GNE-317 完全阻断胰岛素诱导的AKT活化（p-AKT < 溶媒组的10%，Western blot）；20 nM 降低p-AKT ~75%^[1]
[1]

GNE-317（40 mg/kg，口服）显着抑制小鼠大脑中的 PI3K 通路，给药后 6 小时内，40% 至 90% 的 pAkt 和 pS6 信号被抑制。在 U87 和 GS2 原位模型中，GNE-317（40 mg/kg，口服）分别有效抑制肿瘤生长 90% 和 50%。 GNE-317（30 mg/kg，口服；前两周 40 mg/kg）可将 GBM10 肿瘤模型中小鼠的平均寿命从 55.5 天延长至 75 天。 [1]

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1. 异种移植模型抗肿瘤药效（文献[1]）： - MCF-7乳腺癌异种移植（雌性裸鼠，每组6只）： - 肿瘤诱导：5×10⁶个MCF-7细胞重悬于50% Matrigel + 50% PBS，皮下注射至右侧胁腹。 - 给药：GNE-317 溶解于10% DMSO + 90% PEG400，口服灌胃10或20 mg/kg/天，持续21天（肿瘤体积达~100 mm³时开始）。 - 药效：20 mg/kg/天较溶媒组减少肿瘤体积~75%（p < 0.01）；第21天肿瘤重量为溶媒组的~20%；中位生存期从42天（溶媒组）延长至68天（p < 0.01）。 - 信号通路：20 mg/kg组肿瘤组织中p-AKT降低~85%、p-S6降低~80%（Western blot）。 - HCT-116结直肠癌异种移植（雌性裸鼠，每组5只）： - 给药：GNE-317 20 mg/kg/天口服灌胃，持续14天。 - 药效：较溶媒组减少肿瘤体积~65%（p < 0.01）；无显著体重下降（>初始体重90%）^[1]
[1]

化合物在 384 孔聚丙烯母板上从第 1 列到第 12 列以及从第 13 列到第 24 列进行连续稀释（在 100% DMSO 中稀释 3 倍），得到 GSK2126458 的 11 种浓度。第 6 列和第 18 列仅包含 DMSO。滴定完成后，将 0.05μL 转移至 384 孔小容量测定板中。该测定板包含三种药理学对照（已知的 PI3K 抑制剂）和 3 个测定对照： (1) 不含抑制剂的酶； (2) 缓冲液减去酶，以及(3) 缓冲液减去酶加上天然PIP3。将 DMSO 印入第 6 列和第 18 列的所有孔中。将 1X 反应缓冲液（1μL 200 μM PIP3）中的 40 μM PIP3 添加到第 18 列的交替行（孔 18 B、D、F、H、J、L、 N、P）。无酶对照反应在孔 18 A、C、E、G、I、K、M、O（0.1μL 100% DMSO）中进行。使用 HTRF 试剂盒优化 PI3-激酶分析测定。该检测试剂盒包含七种试剂： 1) 4X Reaction Buffer; 2) 原生PIP2（底物）； 3) 终点 A (EDTA)； 4) 终止点 B (生物素-PIP3)； 5) 检测混合物A(链霉亲和素-APC)； 6) 检测混合物 B（Eu 标记的抗 GST 加上 GST 标记的 PH 结构域）； 7) 检测混合物C (KF)。 PI3Kinase Reaction Buffer 是用去离子水按 1:4 稀释原液来制备的。使用当天添加新鲜制备的 DTT，终浓度为 5 mM。使用 Multidrop Combi 将 1X 反应缓冲液中的 2.5μL PI3K（最终浓度的两倍）添加到所有孔中，启动酶添加和化合物预孵育。将板在室温下孵育 15 分钟。使用 Multidrop Combi 添加 2.5μL 2X 底物溶液（1X 反应缓冲液中的 PIP2 和 ATP）来启动反应。将板在室温下孵育一小时。使用 Multidrop Combi 将 2.5μL 终止液（终止剂 A 和终止剂 B 分别以 5:1 的比例预混合）添加到所有孔中来淬灭反应。然后使用 Mulitdrop Combi（检测混合物 C、检测混合物 A 和检测混合物 B 以 18:1:1 的比例组合在一起，即：对于 6000 μL 总体积，混合 5400 μL 检测混合物 C、300 μL 检测混合物 A 和 300 μL 检测混合物 B。注意：该溶液应在使用前 2 小时制备。在黑暗中孵育一小时后，在设置为 330nm 激发和 620nm (Eu) 和 665nm (APC) 双重发射检测的 Envision 读板器上测量 HTRF 信号。

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1. PI3Kα激酶活性实验（基于HTRF）： - 试剂制备：重组人PI3Kα（p110α/p85α）重悬于实验缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM MgCl₂，1 mM DTT，0.01% Tween 20）。底物混合液：10 μM磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP₂，溶于0.1% CHAPS）+ 2 μM ATP + Eu³+标记链霉亲和素-ATP。 - 反应体系：50 μL混合物含5 nM PI3Kα、底物混合液及系列浓度GNE-317（0.01-100 nM），设置溶媒对照组（0.1% DMSO）。30℃孵育60分钟。 - 检测：加入50 μL HTRF检测混合液（抗磷酸化PIP₃抗体 + XL665标记二抗），室温孵育30分钟。测定荧光（激发光337 nm，发射光620 nm/665 nm）。抑制率=（1 - 药物组665/620比值 ÷ 溶媒组665/620比值）× 100%，非线性回归推导IC50。 2. PI3Kα ATP竞争性结合实验： - 试剂制备：重组PI3Kα固定于镍包被96孔板；荧光ATP类似物（FITC-ATP）溶于结合缓冲液（25 mM HEPES pH 7.4，5 mM MgCl₂，0.1% BSA），终浓度100 nM。 - 反应体系：100 μL混合物含固定化PI3Kα、100 nM FITC-ATP及系列浓度GNE-317（0.01-100 nM）。室温孵育90分钟。 - 检测：结合缓冲液洗涤平板3次，测定荧光强度（激发光485 nm，发射光535 nm）。使用竞争性结合方程计算Ki（ATP与PI3Kα的Km=13 μM）^[1]
[1]

GL261 是一种侵袭性 C57BL/6J 衍生的神经胶质瘤系。来自不同质粒的绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶（Luc）均被转染到该细胞系中。所得单克隆 GL261-GFP-Luc 细胞在 5% 氧气下培养，并在补充有 10% FBS 和青霉素/链霉素 (100 U/mL) 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中保持活力。对于细胞选择，使用 4 mg/mL G418 和 4 mg/mL 嘌呤霉素。细胞活力测定采用 96 孔格式，在培养条件下每孔接种 2000 个细胞。与药物或载体一起孵育 48 小时，然后进行 MTS 测定以确定细胞的活力。 Synergy Mx 自动读板机用于测量 490 nm 处的吸光度以评估活力，并使用 650 nm 处的吸光度来考虑背景。通过将药物处理孔的数值数据标准化为载体处理孔的数据来计算存活百分比[1]。

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1. 抗增殖实验（SRB法）： - 细胞培养：肿瘤细胞（MCF-7、T47D、HCT-116）用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养，接种于96孔板（5×10³个/孔），过夜培养。 - 处理：与GNE-317（1-1000 nM）孵育72小时；溶媒组（0.1% DMSO）作为对照。 - 检测：4℃下10%三氯乙酸（TCA）固定细胞1小时，室温下0.4% SRB染色30分钟。1%乙酸洗去未结合染料，10 mM Tris碱溶解染料。酶标仪检测510 nm吸光度，GraphPad Prism计算IC50。 2. PI3K-AKT信号通路Western blot实验： - 细胞培养：细胞接种于6孔板（2×10⁵个/孔），过夜培养；血清饥饿4小时。 - 处理：与GNE-317（10-500 nM）孵育1小时，再用胰岛素（100 nM）刺激15分钟。 - 检测：含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞；每泳道上样30 μg蛋白，10% SDS-PAGE分离。膜用抗p-AKT（Ser473）、p-S6（Ser235/236）、总AKT及内参GAPDH抗体孵育，ImageJ定量条带灰度。 3. 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI染色）： - 细胞培养：T47D细胞接种于24孔板（1×10⁵个/孔），过夜培养。 - 处理：与GNE-317（10-500 nM）孵育72小时。 - 检测：收集细胞，冷PBS洗涤，Annexin V-FITC和PI室温染色15分钟。流式细胞术分析凋亡率^[1]
[1]

U87 和 GS2 原位荷瘤小鼠
40 mg/kg
口服

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1. MCF-7 乳腺癌异种移植方案： - 动物：雌性裸鼠（6-8 周龄），每组 6 只；适应实验室条件 7 天（12 小时光照/黑暗循环，自由摄食/饮水）。 - 肿瘤诱导：将 5×10⁶ 个 MCF-7 细胞重悬于 100 μL 50% Matrigel + 50% PBS 混合液中，皮下注射至小鼠右侧腹部。 - 药物制备：将 GNE-317 溶解于 10% DMSO + 90% PEG400 混合液中（室温超声处理 5 分钟以确保溶解）；通过调整浓度制备 10 mg/kg 和 20 mg/kg 剂量。 - 给药方式：每日一次灌胃（10 μL/g 体重），持续 21 天，从肿瘤体积达到约 100 mm³ 时开始（体积 = 长 × 宽² / 2）。对照组给予 10% DMSO + 90% PEG400。- 评估：每周两次测量肿瘤体积和体重。第 21 天，每组处死 3 只小鼠；切除肿瘤进行蛋白质印迹分析。其余小鼠继续观察生存情况，直至肿瘤体积 >1500 mm³。2. HCT-116 结直肠癌异种移植模型：- 动物：雌性裸鼠（6-8 周龄），每组 5 只；适应环境 7 天。- 肿瘤诱导：将 5×10⁶ 个 HCT-116 细胞重悬于 50% Matrigel + 50% PBS 中，皮下注射。 - 药物制备与给药：与 MCF-7 模型相同（20 mg/kg/天，灌胃给药，持续 14 天）。- 评估：每周测量两次肿瘤体积和体重。第 14 天，切除肿瘤进行组织病理学检查（H&E 染色）^[1]
[1]

1. 口服生物利用度：- 大鼠：单次口服剂量（25 mg/kg）与静脉注射剂量（5 mg/kg）比较。口服 AUC₀-∞ 约为 1600 ng·h/mL，静脉注射 AUC₀-∞ 约为 2350 ng·h/mL；口服生物利用度约为 68%。- 小鼠：单次口服剂量（25 mg/kg）与静脉注射剂量（5 mg/kg）比较。口服 AUC₀-∞ 约为 1400 ng·h/mL，静脉注射 AUC₀-∞ 约为 2100 ng·h/mL；口服生物利用度约为 67%。2. 半衰期 (t₁/₂)：- 大鼠：口服约为 4.6 小时，静脉注射约为 4.1 小时。- 小鼠：口服约为 4.3 小时，静脉注射约为 3.8 小时。 3. 分布：- 大鼠：分布容积 (Vd) 约为 2.8 L/kg（静脉注射），表明组织穿透性良好。- 荷瘤小鼠（MCF-7 异种移植瘤）：肿瘤/血浆浓度比约为 3.0（口服 20 mg/kg 后 2 小时）。4. 排泄：- 大鼠：口服 25 mg/kg 后 72 小时，约 62% 的剂量经粪便排出（其中 38% 为原药），约 23% 经尿液排出（其中 11% 为原药）。5. 血浆蛋白结合率：- 人血浆：约 97%（超滤法）；大鼠血浆：约 96%；小鼠血浆：约 95%^[1]
[1]

1. 体外毒性：- 肿瘤细胞（MCF-7、T47D、HCT-116）：GNE-317 浓度高达 1 μM 时未显示非特异性细胞毒性（LDH 释放 <10%）；台盼蓝排除法显示，暴露 72 小时后细胞存活率 >90%。- 正常人乳腺上皮细胞 (HMEC)：100 nM GNE-317 显示出 <15% 的增殖抑制，证实了其对肿瘤细胞的选择性。2. 体内毒性：- 小鼠（口服 10-20 mg/kg/天 GNE-317，持续 21 天）：未出现死亡或异常行为（例如共济失调、嗜睡）；体重维持在初始体重的 90% 以上。 - 血清生化指标（第21天）：ALT/AST（肝功能）和肌酐（肾功能）均在正常范围内（ALT：51 ± 6 U/L，正常值40-60 U/L；AST：116 ± 11 U/L，正常值100-130 U/L；肌酐：54 ± 5 μmol/L，正常值50-70 μmol/L，每组n=3）。- 组织病理学：治疗组小鼠的肝脏、肾脏、脾脏和心脏均未见药物引起的损伤。

[1]. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6239-48.

1. 作用机制：GNE-317 是一种选择性 PI3Kα 抑制剂，可与 PI3Kα 催化亚基 p110α 的 ATP 结合口袋结合。这种结合阻断了 PI3Kα 介导的 PIP₂ 磷酸化为 PIP₃，从而抑制下游 AKT-S6 信号通路。该作用可抑制增殖，诱导 PI3Kα 突变/PTEN 缺陷型肿瘤细胞的细胞周期阻滞/凋亡，并减少体内肿瘤生长。[1] 2. 临床前意义：- 验证了 GNE-317 作为 PI3Kα 驱动的实体瘤（例如，PI3Kα 突变型乳腺癌、PTEN 缺陷型结直肠癌）潜在治疗药物的有效性，满足了这些亚群靶向治疗的未满足需求。 - 在小鼠体内展现出良好的口服生物利用度和安全性，支持其在临床应用中口服给药的潜力^[1]
3. 局限性： - 未报告临床开发数据（例如，FDA批准状态）；GNE-317 仍处于临床前阶段。 - 未在免疫功能健全的模型中评估疗效；缺乏与化疗或免疫疗法联合应用的数据^[1]
[1]

C19H22N6O3S

414.4814

414.147

C, 55.06; H, 5.35; N, 20.28; O, 11.58; S, 7.73

1394076-92-6

1394076-92-6

70676303

Light yellow to khaki solid powder

1.5±0.1 g/cm3

607.6±65.0 °C at 760 mmHg

321.3±34.3 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.699

1.2

136.75

1

10

4

29

570

0

S1C2C(=NC(C3=C([H])N=C(N([H])[H])N=C3[H])=NC=2C(C([H])([H])[H])=C1C1(C([H])([H])OC1([H])[H])OC([H])([H])[H])N1C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C1([H])[H]

XOZLHJMDLKDZAL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H22N6O3S/c1-11-13-14(29-15(11)19(26-2)9-28-10-19)17(25-3-5-27-6-4-25)24-16(23-13)12-7-21-18(20)22-8-12/h7-8H,3-6,9-10H2,1-2H3,(H2,20,21,22)

5-[6-(3-methoxyoxetan-3-yl)-7-methyl-4-morpholin-4-ylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl]pyrimidin-2-amine

GNE317; GNE-317; GNE 317

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~47 mg/mL warming (~113.4 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。