GNE-6640

USP7 (IC50 = 0.75 μM); USP7 (IC50 = 0.43 μM); USP43 (IC50 = 20.3 μM); Ub-MDM2 (IC50 = 0.23 μM)
GNE-6640 encourages the natural ubiquitination of MDM2 through Lys48 (K48)-linked polyubiquitin chains, thereby guiding the process of proteasomal degradation13. GNE-6640 focuses on the p53, MDM2, and USP7 signaling pathways in cells. With an IC50 ≤ 10 μM, GNE-6640 reduces the viability of 108 cell lines. Combining GNE-6640 with DNA-damaging drugs like doxorubicin or cisplatin may trigger the p53 response and improve the effectiveness of USP7 inhibitors. GNE-6640 may cause the death of tumor cells. PIM kinase inhibitors and other targeted substances, such as chemotherapeutic agents, increase the cytotoxicity of GNE-6640[1].

GNE-6640 encourages the natural ubiquitination of MDM2 through Lys48 (K48)-linked polyubiquitin chains, thereby guiding the process of proteasomal degradation13. GNE-6640 focuses on the p53, MDM2, and USP7 signaling pathways in cells. With an IC50 ≤ 10 μM, GNE-6640 reduces the viability of 108 cell lines. Combining GNE-6640 with DNA-damaging drugs like doxorubicin or cisplatin may trigger the p53 response and improve the effectiveness of USP7 inhibitors. GNE-6640 may cause the death of tumor cells. PIM kinase inhibitors and other targeted substances, such as chemotherapeutic agents, increase the cytotoxicity of GNE-6640[1].

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GNE‑6640 选择性抑制USP7，对USP47（IC₅₀ >200 µM）和USP5（IC₅₀ >200 µM）无显著抑制。
在细胞实验中，它能增强内源性MDM2的泛素化（Ub‑MDM2 MSD检测EC₅₀ ≈ 0.23 µM），并促进MDM2的K48连接多聚泛素化。
在野生型细胞中稳定p53并上调p21，但在p53缺失或USP7缺失的细胞中无此效应。
在441个细胞系的3天活力筛选中，108个细胞系对GNE‑6640敏感（IC₅₀ ≤10 µM）；在5天筛选中，54个细胞系IC₅₀ ≤10 µM。
急性髓系白血病（AML）细胞系对GNE‑6640敏感性更高。
与DNA损伤药物（如阿霉素、顺铂）联用可增强其效力。
在Bliss分析中，GNE‑6640与PIM激酶抑制剂（如GDC‑0339、GDC‑0570）显示协同作用。[1]

GNE-6640是USP7的另一种新型选择性非共价抑制剂，其IC50值为0.75μM（全长USP7）、0.43μM（USP7催化结构域）和20.3μM（全长USP43）。泛素特异性蛋白酶-7（USP7）控制p53肿瘤抑制因子和对肿瘤细胞存活至关重要的各种其他蛋白质的稳定性。GNE-6640促进内源性MDM2泛素化，并靶向细胞USP7和p53信号通路，诱导肿瘤细胞死亡，增强细胞毒性，并降低约108个细胞系的存活率，IC50≤10μM，使用PIM激酶抑制剂等化疗药物[2]。

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USP7 enzymatic analysis[1]
使用1 nM USP7和一系列泛素-AMC底物滴定法对全长USP7进行Michaelis-Menten动力学测量。在Tecan Safire2平板读数器上使用Magellan软件确定底物水解的初始速率，并使用GraphPad Prism软件进行非线性回归分析建模动力学参数。标准误差由三个技术重复计算得出。对于使用USP7 D305/E308突变体的研究，样品在由50 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl、2.5 mM二硫苏糖醇和0.1%（w/v）牛丙种球蛋白组成的缓冲液中反应。用于Michaelis-Menten分析的泛素-Rho110的起始底物浓度为100μM，连续稀释至781 nM。反应在室温下进行1小时，最终酶浓度为100 nM（三个独立的实验，见图表中的符号），在黑色100-μl体积96孔半面积板上进行。通过使用初始速度将数据与线性V0值拟合来计算酶活性，该线性V0值是通过使用485nm的激发和535nm的发射分析切割的Rho-110的荧光信号而测量的。

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Deubiquitinase selectivity analysis/去泛素酶选择性分析[1]
重组去泛素酶双泛素质谱裂解试验。如前所述，使用指定浓度的重组去泛素酶、二泛素底物和USP7抑制剂化合物进行MALDI-TOF DUB测定。在泛素的替代底物Ub-Ube2W（Ub-E2）上监测了GNE-6640和GNE-6776对UCH1家族成员的抑制效率。

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使用基于TR‑FRET的酶活实验，以GST‑UbA10‑His为底物。反应缓冲液含HEPES（pH 7.5）、去污剂、DTT和载体蛋白。化合物与重组全长USP7预孵育后加入底物，反应后使用检测抗体（抗His‑铕和抗GST‑d2）测量TR‑FRET信号。抑制率相对于对照计算，IC₅₀通过曲线拟合确定。
使用内部淬灭的K63连接二聚泛素底物进行正交FRET实验，监测切割后的荧光增强。
另采用泛素‑罗丹明110实验，切割释放罗丹明110并检测荧光增强。
二聚泛素切割实验还通过质谱验证，使用MRM监测泛素生成。[1]

Tumour cell-line panel viability/肿瘤细胞系存活率。[1]
如前所述，在441个细胞系中对GNE-6640和GNE-6641进行了3天的分析，并在185个细胞系的亚群中对GNE-6776、GNE-6640和GNE-641进行了5天的分析26。简而言之，使用三倍稀释法在九点剂量反应中筛选化合物。在加入化合物前24小时将细胞接种到384孔板中。然后将细胞与化合物一起孵育72小时或120小时，然后测定存活率。检测采用生物法，一式三份。在整个试验过程中，细胞在RPMI-1640、2.5%FBS（72小时试验）或5%FBS（120小时试验）和2 mM谷氨酰胺中孵育（37°C，5%CO2）。报告的IC50和平均存活率指标如下：IC50是相对于未处理孔的估计抑制率为50%的剂量（即绝对IC50）。

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Primary combination screen。[1]
在不存在或存在固定剂量的GNE-6776（0 nm、125 nm、250 nm、500 nm、1000 nm和2000 nm）或GNE-6640（400 nm）的情况下，筛选了一个包含589种按九点剂量反应排列的化合物库。简而言之，将5000个EOL-1细胞接种到384孔板中，24小时后加入化合物。在化合物加入后120小时测定细胞存活率（CellTiter Glo）。拟合曲线，计算IC50和平均存活率指标。IC50是相对于未处理的孔抑制50%的剂量。平均存活率是每个测试剂量下拟合存活率的平均值。平均存活率等于对数剂量/存活率曲线下的面积除以测试剂量的总数。平均存活率值用于扩展数据图6g中描述的分析。所有数据均使用Genedata Screener软件进行拟合。

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Primary combination screen analysis。[1]
在EOL-1细胞系中，在DMSO或浓度增加的GNE-6776（100 nM、250 nM、500 nM、1000 nM或2000 nM）或400 nM的GNE-6640存在下，测定了574种具有已知蛋白质或机制靶标的化合物的标准化平均存活率。对于每种化合物，我们评估了USP7抑制剂治疗和DMSO治疗之间的平均存活率差异。对于三种或多种化合物靶向的靶标，我们使用Wilcoxon秩和检验计算了每种浓度USP7抑制剂的高平均存活率差异的富集程度。为了可视化，我们通过取每个目标的−log10（转换后的P值）的平均值来组合所有浓度的结果。

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泛素‑MDM2检测：将HCT116或SJSA‑1细胞接种于96孔板，化合物处理24 h后，加入蛋白酶体制剂MG132处理1 h。裂解细胞，使用多重电化学发光免疫法检测泛素化MDM2和总MDM2。
总MDM2免疫荧光：HCT‑116细胞接种于384孔板，化合物处理24 h后固定、透化，用抗MDM2一抗和AlexaFluor‑555标记二抗染色，高内涵成像仪成像并定量核内MDM2荧光强度。
细胞活力（IncuCyte）：细胞在低血清培养基（含caspase‑3/7试剂）中与化合物共培养，每2 h成像一次，持续68–72 h，分析细胞汇合度与caspase活性。
CellTiter‑Glo实验在化合物处理72 h或120 h后检测细胞活力。
在EOL‑1细胞中与589个化疗/靶向药物进行组合筛选，使用Bliss分析评估协同效应。[1]

GNE-6640 的体外药代动力学参数：分子量 330.38 Da，logD₇.₄ 4.40，总极性表面积 87.0 Ų。
肝微粒体稳定性 (CLₕₑₚ)：人 14 mL/min/kg，大鼠 46 mL/min/kg，小鼠 75 mL/min/kg，犬 24 mL/min/kg，食蟹猴 33 mL/min/kg。
肝细胞稳定性 (CLₕₑₚ)：人 16 mL/min/kg，大鼠 45 mL/min/kg，小鼠 68 mL/min/kg，犬 24 mL/min/kg，食蟹猴 39 mL/min/kg。
血浆蛋白结合率：人 99.6%，大鼠 98.7%，小鼠 99.0%。
MDCK 细胞渗透性：B 至 A 12.17 × 10⁻⁶ cm/s，A 至 B 14.7 × 10⁻⁶ 厘米/秒，比值为 0.83。[1]

[1]. USP7 small-molecule inhibitors interfere with ubiquitin binding. Nature. 2017 Oct 26;550(7677):534-538.

[2]. The role of deubiquitinating enzymes in cancer drug resistance. Cancer Chemother Pharmacol. 2020 Apr;85(4):627-639

泛素系统调控真核生物中重要的细胞过程。泛素以单体或链的形式与底物蛋白连接，泛素修饰的拓扑结构调控底物与特定蛋白的相互作用。因此，泛素化决定了多种底物命运，包括蛋白酶体降解。去泛素化酶从底物上切割泛素，并与多种疾病相关；例如，泛素特异性蛋白酶-7 (USP7) 调控p53肿瘤抑制蛋白和其他对肿瘤细胞存活至关重要的蛋白的稳定性。然而，开发选择性去泛素化酶抑制剂一直极具挑战性，目前尚未解析出小分子抑制剂与去泛素化酶的共晶体结构。本文中，我们利用基于核磁共振的筛选和基于结构的药物设计，描述了选择性USP7抑制剂GNE-6640和GNE-6776的开发。这些化合物可诱导肿瘤细胞死亡，并增强化疗药物和靶向化合物（包括PIM激酶抑制剂）的细胞毒性。结构研究表明，GNE-6640和GNE-6776以非共价方式靶向USP7，其作用位点距离催化半胱氨酸残基12 Å。这些化合物可减弱泛素结合，从而抑制USP7的去泛素化酶活性。GNE-6640和GNE-6776与介导与泛素Lys48侧链氢键相互作用的酸性残基相互作用，提示USP7优先与具有游离Lys48侧链的泛素分子相互作用并切割这些分子。我们通过构建含有不同近端和远端同位素标记的双泛素链，并利用核磁共振技术测量USP7的结合情况，验证了这一假设。这种优先结合延长了 Lys48 连接的泛素链相对于 Lys63 连接的泛素链的解聚动力学。总之，通过减弱泛素结合来抑制 USP7 活性的化合物设计，为开发其他去泛素化酶抑制剂提供了机会，并且可能是一种更广泛适用于抑制需要泛素结合才能发挥完全功能活性的蛋白质的策略。[1]

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本文描述了 GNE-6640 和 GNE-6776，它们是具有结构明确的抑制机制的选择性 USP7 抑制剂。建立严格的筛选流程对于选择和优化靶向抑制剂至关重要。联合研究揭示了 USP7 去泛素化酶活性和 PIM 激酶在调节细胞活力方面此前未被描述的相互作用。 GNE-6640 或 GNE-6776 的共晶结构表明 USP7-D305/E308 与泛素-K48 侧链之间互补的带电相互作用至关重要，我们通过突变分析证实了这一点。值得注意的是，D305G 已被鉴定为急性淋巴细胞白血病患者的体细胞功能缺失突变体²¹。对 USP7 与天然单泛素和差异标记的双泛素结合的 NMR 分析表明，USP7 优先与具有游离 K48 侧链的泛素部分相互作用。有研究提出，某些去泛素化酶无法有效解聚较长的底物结合的 K48 连接链，从而为蛋白酶体靶向多聚泛素化设定了阈值²²；我们的研究证实了这一观点，并提供了一种生物物理机制。许多蛋白质，包括其他去泛素化酶、泛素连接酶、DNA修复和内吞机制以及表观遗传调控因子，其功能依赖于泛素结合²³。开发能够减弱泛素结合的选择性抑制剂是抑制USP7的有效策略。我们的研究证明了该方法的可行性，并且该方法可能在抑制其他类型的泛素结合蛋白方面具有更广泛的应用前景。[1]

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耐药性是一种众所周知的现象，会导致药物治疗效果降低。对化疗药物的耐药性可能涉及多种内在的细胞过程，包括药物外排、细胞凋亡抵抗增强、对铂类或其他DNA损伤药物的DNA损伤修复能力增强、药物失活、药物靶点改变、上皮-间质转化（EMT）、固有的细胞异质性、表观遗传效应或这些机制的任意组合。去泛素化酶（DUBs）逆转靶蛋白的泛素化修饰，维持蛋白质泛素化和去泛素化之间的平衡，从而维持细胞稳态。越来越多的证据表明，DUB活性改变与多种癌症的发生发展密切相关。因此，DUBs是靶向药物研发的潜在候选靶点。本文综述了DUBs，特别是泛素特异性蛋白酶，在不同类型癌症的耐药性中所起的作用。我们还回顾了可用于癌症治疗的潜在小分子DUB抑制剂。[2]

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GNE-6640是一种选择性非共价USP7抑制剂，其结合位点距离催化半胱氨酸约12 Å，可减弱泛素结合。
它优先抑制USP7对具有游离Lys48侧链的泛素部分的活性，导致K48连接的多聚泛素链的解聚过程延长。
该化合物是通过基于核磁共振的片段筛选和基于结构的药物设计开发的。
它与PIM激酶抑制剂和DNA损伤化疗药物具有协同作用。
在急性淋巴细胞白血病患者中发现了USP7的体细胞功能缺失突变D305G，这凸显了靶向该位点的临床意义。[1]

C20H18N4O

330.383123874664

330.15

C, 72.71; H, 5.49; N, 16.96; O, 4.84

2009273-67-8

122531786

White to off-white solid powder

3.8

87.8Ų

3

4

3

25

439

0

ZHYXJQQBKROZDX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H18N4O/c1-2-16-17(13-5-8-18-14(9-13)10-23-24-18)11-22-20(21)19(16)12-3-6-15(25)7-4-12/h3-11,25H,2H2,1H3,(H2,21,22)(H,23,24)

4-[2-amino-4-ethyl-5-(1H-indazol-5-yl)pyridin-3-yl]phenol

2934.99.03.00

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。