| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
|---|---|---|---|
| 5mg |
|
||
| 10mg |
|
||
| 25mg |
|
||
| 50mg |
|
||
| 100mg |
|
||
| 250mg |
|
||
| Other Sizes |
|
| 靶点 |
A549 activity is inhibited by HQ461 with an IC50 of 1.3 µM[1] hour. In A549 cells, HQ461 (10 μM, 8) lowers the levels of CDK12 protein [1]. In A549 cells, HQ461 (0-10 μM) mediates CDK12/CCNK transfer.
|
|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
A549 活性被 HQ461 抑制，IC50 为 1.3 µM[1] 小时。在 A549 细胞中，HQ461 (10 μM, 8) 降低 CDK12 蛋白的水平 [1]。在 A549 细胞中，HQ461 (0-10 μM) 介导 CDK12/CCNK 转移。
HQ461 能诱导 CDK12 激酶结构域（与 CCNK 的细胞周期蛋白框结构域复合）与 DDB1 之间形成三元复合物，这通过 Pull-down 实验和 AlphaScreen 实验证实，其表观 EC50 为 1.9 µM。CDK12 的 G731E 和 G731R 突变体即使在 20 µM HQ461 存在下也不能形成该复合物。[1] 化学交联质谱 (CXMS) 分析发现，在 HQ461 存在下，CDK12 的赖氨酸 745 与 DDB1 的赖氨酸 867 之间形成了蛋白质间交联，从而确定了相互作用界面。[1] 差示扫描荧光法 (DSF) 显示，HQ461 能稳定 CDK12 激酶结构域/CCNK 复合物（使 Tm 升高 1.4°C），表明其直接结合。通过纳米差示扫描荧光法 (nanoDSF) 也证实了 HQ461 与 G731E/R 突变体的结合。HQ461 不改变 DDB1 的热稳定性。[1] 在使用纯化的重组泛素、E1 (UBA1)、E2 (UBE2G1/UBE2D3) 和 E3 (CUL4-RBX1-DDB1) 组分的体外泛素化实验中，HQ461 触发了与野生型 CDK12 复合的 CCNK 的多聚泛素化，但不能触发与 CDK12 G731E 或 G731R 突变体复合的 CCNK 的多聚泛素化。CDK12 本身未被泛素化。[1] 利用 CCNK-荧光素酶降解报告基因进行的构效关系 (SAR) 研究确定了 5-甲基噻唑-2-胺是关键药效团。类似物 HQ005（用羟甲基取代吡啶环上的甲基）显示出更强的降解效力，其 DC50 为 41 nM，而母体化合物 HQ461 的 DC50 为 132 nM。[1] |
| 酶活实验 |
蛋白质-蛋白质相互作用的 AlphaScreen 检测： 将生物素化的 FLAG-Avi-DDB1 和 6xHis 标记的 CDK12 激酶结构域/CCNK 复合物（野生型或 G731E/R 突变体）在含有 HEPES、NaCl、TCEP、NP-40 和 BSA 的检测缓冲液中混合。加入 HQ461 的系列稀释液。孵育后，加入镍螯合物受体微珠，进一步孵育后再加入链霉亲和素供体微珠。测量 AlphaScreen 信号以量化 HQ461 依赖的复合物形成。对于竞争实验，蛋白质预先与 CDK12 抑制剂 THZ531 孵育。[1]
差示扫描荧光法 (DSF)： 将 CDK12 激酶结构域/CCNK 复合物或 DDB1∆BPB 蛋白在含有 HEPES、NaCl 和 TCEP 的缓冲液中稀释。加入 HQ461、DMSO（溶剂对照）或 HBx 肽对照，同时加入 SYPRO Orange 染料。在温度从 10°C 升至 95°C 的过程中测量荧光强度。从所得曲线确定熔解温度 (Tm)。[1] 无标记纳米差示扫描荧光法 (nanoDSF)： 将 CDK12 激酶结构域/CCNK 复合物（野生型或突变体）在缓冲液中稀释，并与递增浓度的 HQ461 混合。使用纳米差示扫描荧光仪，在温度从 35°C 升至 95°C 的过程中监测 330 nm 和 350 nm 处的色氨酸荧光。根据 350nm/330nm 的比值计算拐点温度 (Ti)。[1] 体外泛素化实验： 从转染的细胞中免疫纯化出 FLAG-HA 标记的 CDK12 与 V5 标记的 CCNK（野生型或突变体）的复合物。将该复合物与重组泛素、E1 (UBA1)、E2 (UBE2G1 和 UBE2D3)、E3 (CUL4-RBX1 和 DDB1)、ATP 和 MgCl2 在反应缓冲液中孵育，反应体系中加入或不加 HQ461。反应在 30°C 下进行，最后用 SDS 上样缓冲液终止。通过使用抗 HA 和抗 V5 抗体的蛋白质印迹法评估多聚泛素化水平。[1] |
| 细胞实验 |
蛋白质印迹分析 [1]
细胞类型： A549 细胞 测试浓度： 10 μM 孵育时间： 0 -8h 实验结果：8小时诱导CDK12蛋白水平降低50%，CCNK在4小时时将蛋白水平降低>8倍。 细胞活力测定 (IC50 测定)： 将 A549 或 HCT-116 细胞接种于 384 孔板中。过夜贴壁后，使用数字分配器用 HQ461 的系列稀释液处理细胞。72 小时后，使用基于 ATP 发光的检测试剂盒测量细胞活力。记录发光值，并使用非线性回归分析确定 IC50 值。[1] 全基因组混合 CRISPR-Cas9 敲除筛选： 以低感染复数 (MOI) 用全基因组 sgRNA 文库转导 A549 细胞。经过嘌呤霉素筛选后，细胞在亚致死剂量的 HQ461 或 DMSO 对照条件下传代培养 3 周。从存活的细胞中分离基因组 DNA，通过 PCR 扩增 sgRNA 并进行测序。使用 MAGeCK 算法识别富集的（即赋予抗性的）sgRNA。[1] 功能获得性突变筛选： 分离并扩增十株独立的 HCT-116 细胞克隆（该细胞系具有高突变率），然后用高剂量的 HQ461 进行筛选。从五个细胞群体中出现了抗性克隆。将五株抗性克隆的基因组 DNA 混合后进行全外显子组测序，并与它们未经过筛选的对应克隆的混合 DNA 进行比较，以识别反复出现的突变。[1] 免疫共沉淀 (Co-IP)： 将具有内源性 3xFLAG 标签 CDK12 的 A549 细胞在液氮下研磨成粉末。细胞粉末在 IP 缓冲液中溶解，裂解液用 HQ461 或 DMSO 处理。使用抗 FLAG 抗体偶联的磁珠免疫沉淀 3xFLAG-CDK12 及其结合蛋白。洗涤后，用 FLAG 肽洗脱结合蛋白，并通过蛋白质印迹法检测 CDK12、CCNK 和 DDB1。[1] 体内泛素化实验： 共转染编码 8xHis-泛素、HA 标记的 CCNK 和 FLAG 标记的 CDK12（野生型或突变体）的质粒至 HEK293T 细胞。细胞用蛋白酶体抑制剂硼替佐米预处理，然后用 HQ461 处理。细胞在尿素基裂解缓冲液中裂解，使用 Ni-NTA 磁珠纯化 His 标签标记的（即泛素化的）蛋白质。使用抗 HA 和抗 FLAG 抗体的蛋白质印迹法检测 CCNK 和 CDK12 的泛素化。[1] 蛋白质降解的蛋白质印迹分析： 用 HQ461 处理细胞（如 A549）不同时间。细胞在含有 SDS 和苯核酸酶的缓冲液中裂解。定量蛋白质浓度，取等量蛋白质进行 SDS-PAGE 电泳，转膜至硝酸纤维素膜，并用特异性抗体（如抗 CCNK、抗 CDK12、抗 RNA Pol II CTD Ser2 磷酸化、抗总 RNA Pol II CTD 抗体）进行检测。[1] 基因表达的 RT-qPCR 分析： 使用酚基试剂从 HQ461 处理的 A549 细胞中提取总 RNA。将 RNA 反转录成 cDNA。在实时荧光定量 PCR 系统上使用荧光染料法 Master Mix 进行定量 PCR。DNA 损伤反应基因（BRCA1、BRCA2、ATR、ERCC4）的 mRNA 水平以 GAPDH 为内参进行标准化。[1] 集落形成实验： 亲本 A549 细胞或表达 sgRNA 抗性 CCNK cDNA 的 A549 细胞，用表达非靶向对照 sgRNA 或靶向 CCNK 的 sgRNA 的慢病毒感染。感染后一天，每孔接种少量细胞，培养 10 天并定期更换培养基。形成的集落用多聚甲醛固定，结晶紫染色并成像。[1] |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
HQ461是通过基于表型的NRF2抑制剂高通量筛选发现的。它代表了一类新型分子胶降解剂，能够直接将靶蛋白（CDK12/CCNK）募集到CRL4 E3连接酶的衔接蛋白DDB1上，从而绕过了经典底物受体（DCAF）的依赖。[1]
从机制上讲，HQ461与CDK12激酶结构域的ATP结合口袋结合，诱导构象变化或形成新的蛋白表面，该表面与DDB1的BPC结构域相互作用。这导致CDK12的结合伴侣CCNK发生多聚泛素化和降解，但不会导致CDK12自身降解。 [1] CCNK 的降解会损害 CDK12 和 CDK13 的激酶活性，导致 RNA 聚合酶 II C 端结构域丝氨酸 2 位点的磷酸化水平降低，并下调关键的 DNA 损伤反应 (DDR) 基因（例如 BRCA1、BRCA2），从而诱导“BRCA 样”表型。[1] 该研究包括对 HQ461 的构效关系 (SAR) 分析，确定 5-甲基噻唑-2-胺部分是关键的药效团，并获得了降解能力增强的类似物 (HQ005)。[1] |
| 分子式 |
C15H15N5OS2
|
|---|---|
| 分子量 |
345.442499399185
|
| 精确质量 |
345.07
|
| 元素分析 |
C, 52.16; H, 4.38; N, 20.27; O, 4.63; S, 18.56
|
| CAS号 |
1226443-41-9
|
| 相关CAS号 |
2755241-76-8 (HBr);1226443-41-9;
|
| PubChem CID |
49677967
|
| 外观&性状 |
Gray to light brown solid powder
|
| LogP |
3.1
|
| tPSA |
136
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
2
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
7
|
| 可旋转键数目(RBC) |
5
|
| 重原子数目 |
23
|
| 分子复杂度/Complexity |
413
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| InChi Key |
QMRBCNQCRMTXBE-UHFFFAOYSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C15H15N5OS2/c1-9-4-3-5-12(17-9)19-15-18-11(8-22-15)6-13(21)20-14-16-7-10(2)23-14/h3-5,7-8H,6H2,1-2H3,(H,16,20,21)(H,17,18,19)
|
| 化学名 |
2-[2-[(6-methylpyridin-2-yl)amino]-1,3-thiazol-4-yl]-N-(5-methyl-1,3-thiazol-2-yl)acetamide
|
| 别名 |
HQ-461; HQ461; HQ 461
|
| HS Tariff Code |
2934.99.9001
|
| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
|
| 溶解度 (体外实验) |
DMSO: ~62.5 mg/mL (~180.9 mM)
|
|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.8949 mL | 14.4743 mL | 28.9486 mL | |
| 5 mM | 0.5790 mL | 2.8949 mL | 5.7897 mL | |
| 10 mM | 0.2895 mL | 1.4474 mL | 2.8949 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
|
|
|
|
M1-20
CDK12-Cyclin K Ligand-Linker Conjugates 1
CGP-74514 dihydrochloride
(S)-CDK2 degrader 6
InvivoChem的所有产品仅用于作科学研究，不面向患者销售
Copyright 2020 InvivoChem LLC | All Rights Reserved 粤ICP备20063088号-1
粤公网安备 44011102003439号
463611831
