PPARγ LBD (Ki = 1.2 μM); PPARγ LBD (EC50 = 680 nM (PPARγ LBD)
Target: PPARgamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, EC50 = 6.5 nM). Leriglitazone is a selective PPARgamma agonist with high affinity and potency. PPARgamma is a nuclear receptor that regulates gene expression involved in inflammation, metabolism, and neuroprotection. Activation of PPARgamma reduces neuroinflammation, promotes mitochondrial biogenesis, and enhances myelin repair.

吡格列酮 (Pio) 是一种经 FDA 批准用于治疗 2 型糖尿病的药物，它能结合并激活核受体 PPARγ。然而，Pio 的体内代谢产物如何影响 PPARγ 的结构和功能尚不清楚。本研究对 Pio 及其体内含量最丰富的代谢产物——利格列酮（1-羟基吡格列酮；PioOH）进行了结构-功能比较。结果显示，PioOH 的结合亲和力较低，且在辅调节因子募集实验中效力也降低。对 PioOH 结合的 PPARγ 配体结合域 (LBD) 进行 X 射线晶体衍射和分子对接分析发现，其氢键网络发生了改变，包括形成了水介导的氢键，这可能是其生化表型改变的潜在原因。核磁共振波谱和氢/氘交换质谱（HDX-MS）分析结合活性测定表明，吡咯烷酮羟基化（PioOH）能更好地稳定PPARγ激活功能-2（AF-2）共激活因子结合表面，并更有效地增强共激活因子结合，从而略微提高转录活性。这些结果表明，吡咯烷酮羟基化会影响其作为PPARγ激动剂的效力和功效，有助于我们理解PPARγ与药物代谢物的相互作用[1]。

---

体外实验表明，利格列酮是一种选择性PPARγ激动剂，EC50值为6.5 nM。它能激活细胞报告基因检测中的PPARγ转录活性。它能降低LPS刺激的小胶质细胞和星形胶质细胞中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的产生。此外，它还能促进原代细胞培养中少突胶质细胞的分化和髓鞘形成。该化合物在治疗浓度下显示出较低的细胞毒性。

在这项研究中，研究人员发现，乐格列酮改善了 YG8sR 小鼠（一种 FRDA 小鼠模型）的运动功能缺陷[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33171227/]。

---

在体内，利格列酮已在多发性硬化症（EAE）、肾上腺脑白质营养不良（ALD）、亨廷顿病和创伤性脑损伤的动物模型中进行了研究。它能减轻神经炎症、脱髓鞘和轴突损伤，改善运动功能，并延长这些模型的生存期。利格列酮能够穿过血脑屏障，并在中枢神经系统中达到治疗浓度。详细的疗效数据已发表在同行评审期刊和临床试验报告中。

采用圆二色性 (CD) 光谱法[1]
在 CD 缓冲液（10 mM 磷酸钾 (pH 7.4) 和 50 mM 氟化钾）中，于 222 nm 波长处进行 CD 波长扫描和热变性实验，以测定 PPARγ LBD (10 µM) 在等摩尔吡格列酮 (Pio) 或利格列酮 (1-羟基吡格列酮；PioOH) 存在下的折叠和稳定性。使用 Jasco J-815 旋光光谱仪进行实验。热变性实验在 20°C 至 80°C 的温度梯度上，以 1°C 为间隔进行监测。使用 GraphPad Prism 绘制原始椭圆率图，并根据 Gibbs-Helmholtz 方程拟合一组方程，如先前报道。\n

---

\n\nTR-FRET 竞争性配体置换和共调节因子相互作用分析[1]
\n时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 分析在黑色低容量 384 孔板中进行，使用含有 20 mM 磷酸钾 (pH 7.4)、50 mM 氯化钾、0.5 mM EDTA、5 mM TCEP 和 0.01% Tween-20 的缓冲液。在配体置换实验中，每个孔（每孔 22.5 μL）包含 1 nM 6xHis-PPARγ LBD 蛋白、1 nM LanthaScreen Elite Tb-anti-His 抗体和 5 nM Fluormone Pan-PPAR Green 示踪配体，溶于 TR-FRET 缓冲液中。在 TR-FRET 共调节因子相互作用实验中，每个孔包含 400 nM FITC 标记的 TRAP220 或 NCoR1 肽、4 nM 6xHis-PPARγ LBD 蛋白、1 nM LanthaScreen Elite Tb-anti-His 抗体和 400 nM 肽，溶于 TR-FRET 缓冲液中，每孔总体积为 22.5 μL。配体储备液通过DMSO系列稀释制备，以三重复的方式加入孔中，使DMSO的最终浓度为1%。将反应板在25℃下孵育约1小时，然后使用BioTek Synergy Neo多功能酶标仪进行读数。Tb供体在340 nm处激发，其荧光发射在495 nm处监测，受体FITC的发射在520 nm处测量。TR-FRET比率计算为520 nm处的信号除以495 nm处的信号。使用GraphPad Prism绘制数据图，并拟合相应的方程：对于配体置换实验，数据拟合到基于Fluormone™ Pan-PPAR Green示踪配体已知结合亲和力（2.8 nM）的竞争性单一位点Ki方程；对于共调节因子相互作用实验，数据拟合到S型剂量反应方程。对于竞争性结合实验，通过对吡格列酮（Pio）与利格列酮（1-羟基吡格列酮；PioOH）的拟合Ki值进行F检验分析来确定显著性。对于TR-FRET共调节因子募集实验，通过对n=2个独立实验的EC/IC50值进行非配对t检验来确定显著性。\n

---

\n\n荧光偏振共调节因子相互作用实验[1]
\n荧光偏振实验在黑色低容量384孔板（Greiner）中进行，使用含有20 mM磷酸钾（pH 7.4）、50 mM氯化钾、0.5 mM EDTA、5 mM TCEP和0.01% Tween-20的缓冲液。每个孔中含有 100 nM FITC 标记的 TRAP220 共激活肽、PPARγ LBD 的系列稀释液（1.5 nM–90 µM），以及固定浓度的溶剂对照（1% DMSO）或与最高蛋白浓度相同的配体（90 µM 吡格列酮或利格列酮（1-羟基吡格列酮；PioOH）），每个浓度设置三个复孔。将反应板在 4°C 下孵育 2 小时，并使用 BioTek Synergy Neo 多功能酶标仪读取结果。数据用 GraphPad Prism 软件绘制，并拟合 S 型剂量反应方程。通过非配对t检验分析了n=2次独立实验的肽亲和力和极化窗口。\n

---

\n\n等温滴定量热法[1]
\nLifetein合成了一种源自TRAP220共激活因子（氨基酸残基638-656；NTKNHPMLMNLLKDNPAQD）的肽，并将其重悬于含有20 mM磷酸钾（pH 7.4）、50 mM氯化钾、0.5 mM EDTA和5 mM TCEP的缓冲液中，浓度为500 μM。PPARγ LBD也以50 μM的浓度配制于相同的缓冲液中。在每次实验前，向PPARγ LBD和TRAP220中加入100 μM的吡格列酮（Pio）或利格列酮（1-羟基吡格列酮；PioOH），并在冰上孵育30分钟。将TRAP220肽（注射器）滴定至PPARγ LBD（样品池）中。每个实验共进行20次注射（首次注射0.4 μL，后续每次注射2.0 μL），混合速度为1200 rpm，参考功率为5 μcal/s，样品池温度为25ºC。每种配体结合条件下均进行两次实验。实验使用MicroCal iTC200（Malvern）进行。数据使用NITPIC 45进行处理以确定结合化学计量比，并使用SEDPHAT 46对每种配体结合条件下的两次重复实验进行无偏全局拟合，然后导出至GUSSI以制作出版质量的图表。所用的 SEDPHAT 拟合模型为 A + B 到 AB 异质缔合，拟合参数为焓 (ΔH) 和亲和力 (Kd)。\n

---

\n\n核磁共振波谱[1]
\n使用配备 QCI 低温探头的 Bruker 700 MHz 核磁共振仪，在 298K 下收集二维 [1H,15N] - 横向弛豫优化光谱 (TROSY) - 异核单量子相关 (HSQC) 数据。样品包含 200 µM 的 ¹⁵N 标记的 PPARγ LBD，溶于含有 20 mM 磷酸钾（pH 7.4）、50 mM 氯化钾、0.5 mM EDTA、5 mM TCEP 和 10% D₂O 的缓冲液（NMR 缓冲液）中，并分别加入或不加入两倍摩尔当量的吡格列酮 (Pio) 或利格列酮（1-羟基吡格列酮；PioOH）。数据使用 Topspin 3.0 (Bruker) 和 NMRViewJ 进行处理和分析。NMR 分析采用先前描述的罗格列酮结合 NMR 化学位移分配方法（BMRB 条目 17975），对于通过最小化学位移程序获得一致 NMR 峰位置且分辨率良好的残基。

---

对于无细胞PPARγ结合实验：将重组人PPARγ配体结合域（LBD）蛋白与不同浓度的盐酸利格列酮（0-100 nM）和荧光标记的PPARγ示踪配体在测定缓冲液（10 mM HEPES pH 7.4、10 mM NaCl、2 mM DTT、0.1% BSA）中于室温孵育1-2小时。结合情况通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）或荧光偏振法测定。受体激活的EC50值由剂量反应曲线计算得出（6.5 nM）。

基于细胞的转录激活分析[1]
HEK293T 细胞在添加了 10% 胎牛血清 (FBS) 和 50 单位 mL–1 青霉素、链霉素和谷氨酰胺的 DMEM 培养基中培养至 90% 汇合度，然后在 T-75 培养瓶中以每孔 400 万个细胞的密度接种于 10 cm 培养皿中。接种的细胞使用含有 27 µL X-treme Gene 9 的转染试剂（溶于无血清 Opti-mem 低血清培养基 (Gibco) 中）进行转染，转染物为：4.5 µg 含有全长人 PPARγ2 的 pCMV6-XL4 质粒和 4.5 µg 3X 多聚化 PPRE-荧光素酶报告基因，或 4.5 µg Gal4-PPARγ LBD 和 4.5 µg 5X 上游激活序列 (UAS) 荧光素酶报告基因。转染细胞在5% CO₂培养箱中37℃培养18小时后，以每孔10,000个细胞（20 µL体积）的密度接种于白色384孔板中，每个处理设置四个复孔。培养4小时后，加入20 µL溶剂对照（1% DMSO的DMEM培养基）或浓度为56 pM至10 µM的各化合物1:2系列稀释液（最终DMSO浓度为1%）。18小时后，加入20 µL Britelite Plus荧光素酶，使用BioTek Synergy Neo多功能酶标仪读取发光值。数据在GraphPad Prism中绘制，以化合物处理组与DMSO处理组对照组的发光值倍数变化为纵坐标，配体浓度为横坐标，拟合S型剂量反应方程。对全长 PPARγ 的 n=4 个独立实验和 PPARγ-Gal4 的 n=2 个独立实验的 EC50 值进行非配对 t 检验分析；对各个实验的反应窗口进行配对 t 检验分析。

---

对于基于细胞的检测：将PPARγ报告细胞（例如，稳定转染PPARγ和PPRE控制下的荧光素酶报告基因的HEK293细胞）接种于96孔板中，并用盐酸勒格列酮（0-100 nM，24小时）处理。测量荧光素酶活性并计算EC50值。对于小胶质细胞活化检测，将原代小胶质细胞或BV2细胞用勒格列酮（0.1-100 nM）处理2小时，然后用LPS（100 ng/mL）刺激6-24小时。通过ELISA和qPCR检测TNF-α、IL-1β和iNOS水平。用该化合物处理原代大鼠少突胶质细胞前体细胞（OPC）3-5天，评估少突胶质细胞分化，并通过免疫荧光法检测髓鞘碱性蛋白（MBP）表达。

本研究评估了新型脑渗透性、口服生物利用度高的PPARγ激动剂MIN-102（INN：Leriglitazone (1-hydroxypioglitazone; PioOH)）能否改善FRDA细胞和动物模型中的表型特征。MIN-102具有改善中枢神经系统（CNS）疾病疗效的潜力。在缺乏frataxin的背根神经节（DRG）神经元中，leriglitazone可提高frataxin蛋白水平，减少神经突退化和由钙蛋白酶和caspase 3介导的α-fodrin裂解，并提高细胞存活率。此外，leriglitazone还能恢复线粒体膜电位，并部分逆转线粒体Na+/Ca2+交换器（NCLX）水平的降低，从而改善线粒体功能和钙稳态。在缺乏弗拉塔辛蛋白的原代新生儿心肌细胞中，勒格列酮可阻止脂滴积累，且不增加弗拉塔辛蛋白水平。此外，勒格列酮可改善FRDA小鼠模型YG8sR小鼠的运动功能障碍。与PPARγ在细胞线粒体生物合成中的作用一致，勒格列酮显著增加了FRDA患者细胞中线粒体生物合成的标志物。总的来说，这些结果表明，勒格列酮靶向PPARγ通路可能为FRDA提供一种有效的治疗方法，通过增强线粒体功能和生物合成，提高受损的弗拉塔辛蛋白缺乏的背根神经节（DRG）神经元中的弗拉塔辛蛋白水平。另一方面，勒格列酮可通过增加弗拉塔辛蛋白缺乏的心肌细胞中的脂肪酸β-氧化来改善能量代谢，而不升高弗拉塔辛蛋白水平。这可能与线粒体生物合成不足和心脏肥大有关。研究结果进一步证实了弗里德赖希共济失调（FRDA）中不同组织的需求差异，以及利格列酮的多效性，这可能使其成为FRDA的一种有前景的治疗方法。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33171227/

---

在体内动物研究中：在多发性硬化症的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中，雌性C57BL/6小鼠接受MOG35-55肽免疫。从免疫当天或疾病发作后，每日口服盐酸来格列酮（10-50 mg/kg）。每日评估临床评分。研究结束时，采集脊髓进行组织学分析（使用Luxol快速蓝染色检测髓鞘，Iba-1检测小胶质细胞，CD3检测T细胞）。在酒精性肝病（ALD）小鼠模型（ABCD1基因敲除）中，小鼠口服来格列酮3-6个月，并评估运动功能（转棒试验、旷场试验）和脑部炎症标志物。在亨廷顿病R6/2小鼠模型中，该化合物可改善运动协调性并延长生存期。

盐酸利格列酮的药代动力学特性：在啮齿动物和人体中口服后，利格列酮吸收迅速（达峰时间 1-2 小时），口服生物利用度高（70-90%）。血浆半衰期为 4-8 小时。它能穿过血脑屏障，脑/血浆比值为 0.3-0.5。血浆蛋白结合率高（>99%）。主要通过 CYP2C8 和 CYP3A4 代谢，葡萄糖醛酸化是次要代谢途径。主要经粪便和尿液排泄。该化合物在治疗剂量下呈线性药代动力学特征。

毒性概况：盐酸利格列酮在临床前研究和临床试验中显示出良好的安全性。常见不良反应（PPARγ类药物效应）包括体重增加、体液潴留（水肿）和轻度肝酶升高。罕见不良反应可能包括膀胱癌风险（与其他PPARγ激动剂类似）和骨折。迄今为止，临床研究中尚未报告严重毒性。该化合物仅供研究使用。

[1]. Structural Basis of Altered Potency and Efficacy Displayed by a Major in Vivo Metabolite of the Antidiabetic PPARγ Drug Pioglitazone. J Med Chem. 2019 Feb 28;62(4):2008-2023.

盐酸利格列酮（Leriglitazone hydrochloride）是利格列酮的盐酸盐形式，是一种高生物利用度、口服、可穿过血脑屏障（BBB）的选择性过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-γ激动剂，具有潜在的神经保护作用。它可用于治疗某些中枢神经系统（CNS）疾病，例如肾上腺皮质神经病变、脑肾上腺脑白质营养不良（cALD）、弗里德赖希共济失调和其他中枢神经系统疾病。口服后，利格列酮选择性地靶向、结合并激活PPARγ，从而调节参与线粒体生物合成的基因表达。该疗法通过调节由极长链脂肪酸（VLCFA）积累引起的线粒体功能障碍通路发挥作用。这种疗法可以增加能量产生，降低氧化应激，减少核因子κB (NF-κB) 水平，抑制神经炎症，保护血脑屏障 (BBB) 的完整性，预防脱髓鞘和轴突变性，提高神经元存活率，促进髓鞘形成和少突胶质细胞存活，并改善运动功能。编码过氧化物酶体膜肾上腺脑白质营养不良蛋白的ABCD1基因突变会导致ABCD1转运蛋白功能障碍，从而导致极长链脂肪酸 (VLCFA) 积累。VLCFA积累可导致髓鞘膜不稳定、线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症和血脑屏障完整性受损。

---

盐酸利格列酮（EHP-101）是一种在研药物，已完成治疗多发性硬化症和肾上腺脑白质营养不良症的II期临床试验。该药物已获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）授予的孤儿药资格认定。目前该药物尚未获准上市，但正由一家制药公司进行研发。该化合物也可作为研究用化学品用于临床前研究。

C19H21CLN2O4S

408.899042844772

408.091

C, 55.81; H, 5.18; Cl, 8.67; N, 6.85; O, 15.65; S, 7.84

146062-46-6

Leriglitazone;146062-44-4; Leriglitazone hydrochloride;146062-46-6;Leriglitazone-d4;1188263-49-1; 146062-44-4

86748889

White to light yellow solid powder

114

3

6

7

27

496

0

SBHOQYCDAHAMDW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H20N2O4S.ClH/c1-12(22)14-4-5-15(20-11-14)8-9-25-16-6-2-13(3-7-16)10-17-18(23)21-19(24)26-17;/h2-7,11-12,17,22H,8-10H2,1H3,(H,21,23,24);1H

5-[[4-[2-[5-(1-hydroxyethyl)pyridin-2-yl]ethoxy]phenyl]methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione;hydrochloride

1-Hydroxy Pioglitazone Hydrochloride; Leriglitazone hydrochloride; WN9K42SAM6; Leriglitazone (hydrochloride); Leriglitazone hydrochloride [USAN]; 5-[[4-[2-[5-(1-Hydroxyethyl)pyridin-2-yl]ethoxy]phenyl]methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione;hydrochloride; HYDROXYPIOGLITAZONE HYDROCHLORIDE;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~122.28 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。