PPARγ LBD (Ki = 1.2 μM); PPARγ LBD (EC50 = 680 nM (PPARγ LBD)

吡格列酮（Pio）是一种经美国食品药品监督管理局批准的治疗2型糖尿病的药物，可以结合并激活核受体PPARγ。然而，目前尚不清楚体内Pio代谢物如何影响PPARγ的结构和功能。在这项研究中，研究人员对Pio及其最丰富的体内代谢产物Leriglitazone（1-羟基吡格列酮；PioOH）进行了结构功能比较。PioOH在共调节因子募集试验中显示出较低的结合亲和力和降低的效力。PioOH结合的PPARγ配体结合结构域（LBD）的X射线晶体学和分子对接分析揭示了氢键网络的改变，包括水介导的键的形成，这可能是其改变的生化表型的基础。NMR光谱和氢/氘交换质谱（HDX-MS）分析结合活性测定表明，PioOH更好地稳定了PPARγ激活功能-2（AF-2）共激活子结合表面，更好地增强了共激活子的结合，提供了稍好的转录功效。这些结果表明，皮奥羟基化会影响其作为PPARγ激动剂的效力和功效，这有助于我们理解PPARγ-药物-代谢物相互作用[1]。

在这项研究中，研究人员发现，莱格列酮改善了YG8sR小鼠的运动功能缺陷，这是一种FRDA小鼠模型[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33171227/]。

圆二色性（CD）光谱[1]
在CD缓冲液（10 mM磷酸钾（pH 7.4）和50 mM氟化钾）中进行CD波长扫描和在222 nm处监测的热变性实验，以确定PPARγLBD（10µM）在Jasco J-815分光光度计上在1摩尔当量的Pio或Leriglitazone（1-羟基吡格列酮；PioOH）存在下的折叠和稳定性。沿20°C至80°C的温度梯度以1°C的间隔监测热变性。如前所述，使用GraphPad Prism绘制原始椭圆率，并将其拟合到基于Gibbs-Helmholtz方程的一组方程中。

---

TR-FRET竞争性配体置换和共调节因子相互作用测定[1]
使用含有20mM磷酸钾（pH 7.4）、50mM氯化钾、0.5mM EDTA和5mM TCEP以及0.01%吐温-20的缓冲液，在黑色低体积384孔板中进行时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）测定。对于配体置换试验，每个孔（每孔22.5μL）在TR-FRET缓冲液中含有1 nM 6xHis-PPARγLBD蛋白、1 nM LanthaScreen Elite Tb抗His抗体和5 nM Fluormone Pan-PPAR Green示踪配体。对于TR-FRET共调节因子相互作用测定，每孔含有400 nM FITC标记的TRAP220或NCoR1肽、4 nM 6xHis PPARγLBD蛋白、1 nM LanthaScreen Elite Tb抗His抗体和400 nM肽，在TR-FRETs缓冲液中，每孔总体积为22.5μL。通过在DMSO中连续稀释制备配体储备，一式三份加入孔中，使DMSO的最终浓度为1%，将平板在25°C下孵育约1小时，并使用BioTek Synergy Neo多模式平板读数器读取。Tb供体在340nm处被激发；在495nm处监测其荧光发射并且在520nm处测量受体FITC发射。TR-FRET比率计算为520nm处的信号除以495nm处的信息。使用GraphPad Prism绘制数据并拟合到适当的方程：对于配体置换分析，使用Fluormone™Pan-PPAR Green示踪配体的已知结合亲和力（2.8 nM）将数据拟合到竞争性单位点拟合Ki方程；对于共调节因子相互作用测定，数据符合S型剂量反应方程。对于竞争性结合试验，通过Pio与Leriglitazone（1-羟基吡格列酮；PioOH）的拟合Ki值的F检验分析来确定其显著性。对于TR-FRET共调节因子募集试验，通过n=2个单独实验的EC/I50值的非配对t检验确定其显著性。

---

荧光偏振共调节剂相互作用测定[1]
使用含有20mM磷酸钾（pH 7.4）、50mM氯化钾、0.5mM EDTA、5mM TCEP和0.01%吐温-20的缓冲液，在黑色低体积384孔板（Greiner）中进行荧光偏振分析。每个孔含有100 nM FITC标记的TRAP220辅活化肽，PPARγLBD的连续稀释液（1.5 nM-90µM），含有固定浓度的载体对照（1%DMSO）或等于最高蛋白质浓度的配体（90µM Pio或Leriglitazone（1-羟基吡格列酮；PioOH）），一式三份。将板在4°C下孵育2小时，并使用BioTek Synergy Neo多模式读板器读取。数据绘制在GraphPad Prism中，并符合S形剂量反应方程。通过非配对t检验分析n=2个个体实验的肽亲和力和极化窗口。

---

等温滴定量热法[1]
Lifetein合成了一种源自TRAP220辅激活子的肽（残基638-656；NTKNHPMLMNLLKDNPAQD），并将其在500μM下重新悬浮在含有20 mM磷酸钾（pH 7.4）、50 mM氯化钾、0.5 mM EDTA和5 mM TCEP的缓冲液中。PPARγLBD在50μM的相同缓冲液中制备。将100μM Pio或Leriglitazone（1-羟基吡格列酮；PioOH）加入PPARγLBD和TRAP220中，并在每次实验前30分钟在冰上孵育。TRAP220肽（注射器）滴定到PPARγLBD（样品细胞）中。每次实验共进行20次注射（第一次注射0.4μL，后续注射2.0μL），混合速度为1200 rpm，参考功率为5μcal/秒，细胞温度为25℃。对每种配体结合条件进行两次运行。使用MicroCal iTC200（Malvern）进行实验。在NITPIC 45中处理数据以确定结合化学计量比，并在SEDPHAT 46中通过对每个配体结合条件的两次重复运行进行无偏全局拟合进行进一步分析，然后导出到GUSSI进行发表质量图制备。所使用的SEDPHAT拟合模型为A+B到AB杂缔合，拟合参数为焓（ΔH）和亲和力（Kd）。

---

核磁共振波谱[1]
使用配备QCI冷冻探针的Bruker 700 Mhz NMR仪器在298K下收集二维[1H，15N]-横向弛豫优化光谱（TROSY）-异核单量子相关（HSQC）数据。样品在含有20 mM磷酸钾（pH 7.4）、50 mM氯化钾、0.5 mM EDTA、5 mM TCEP和10%D2O的缓冲液（NMR缓冲液）中含有200µM 15N标记的PPARγLBD，在不存在或存在两摩尔当量的Pio或Leriglitazone（1-羟基吡格列酮；PioOH）的情况下。使用Topspin 3.0（Bruker）和NMRViewJ对数据进行处理和分析。通过最小化学位移程序，使用之前描述的罗格列酮结合NMR化学位移分配（BMRB条目17975）对具有一致NMR峰位置的高分辨率残基进行NMR分析。

基于细胞的转录激活试验[1]
在添加了10%胎牛血清（FBS）和50单位mL-1青霉素、链霉素和谷氨酰胺的DMEM培养基中培养的HEK293T细胞在T-75烧瓶中生长至90%融合，然后在10cm培养皿中每孔接种400万个细胞。使用含有27µL X-treme基因9的转染试剂在无血清Opti-mem还原血清培养基（Gibco）中转染接种的细胞，该培养基含有4.5µg pCMV6-XL4质粒，其中含有全长人PPARγ2和4.5µg 3X多聚PPRE荧光素酶报告子，或4.5µg Gal4-PPARγLBD和4.5µg5X上游激活序列（UAS）荧光素酶报道子。在37°C的5%CO2培养箱中孵育18小时后，将转染细胞以每孔10000个细胞（20µL体积）的密度四次铺在白色384孔板上，孵育4小时，然后用20µL的载体对照（DMEM培养基中的1%DMSO）或每种化合物的1:2系列稀释液（56pM-10µM，1%DMSO终浓度）处理。18小时后，通过加入20µL Britelite Plus测量萤光素酶活性，并使用BioTek Synergy Neo多模式平板阅读器读取发光。数据在GraphPad Prism中绘制为化合物处理的细胞与DMSO处理的对照细胞的发光倍数变化与配体浓度的关系，并符合S形剂量反应方程。通过非配对t检验分析了n=4个全长PPARγ个体实验和n=2个PPARγ-Gal4个体实验的EC50值；通过配对t检验对个体实验的响应窗口进行分析。

本研究评估了新型脑渗透性、口服生物利用度高的PPARγ激动剂MIN-102（INN：Leriglitazone (1-hydroxypioglitazone; PioOH)）能否改善FRDA细胞和动物模型中的表型特征。MIN-102具有改善中枢神经系统（CNS）疾病疗效的潜力。在缺乏frataxin的背根神经节（DRG）神经元中，leriglitazone可提高frataxin蛋白水平，减少神经突退化和由钙蛋白酶和caspase 3介导的α-fodrin裂解，并提高细胞存活率。此外，leriglitazone还能恢复线粒体膜电位，并部分逆转线粒体Na+/Ca2+交换器（NCLX）水平的降低，从而改善线粒体功能和钙稳态。在缺乏弗拉塔辛蛋白的原代新生儿心肌细胞中，勒格列酮可阻止脂滴积累，且不增加弗拉塔辛蛋白水平。此外，勒格列酮可改善FRDA小鼠模型YG8sR小鼠的运动功能障碍。与PPARγ在细胞线粒体生物合成中的作用一致，勒格列酮显著增加了FRDA患者细胞中线粒体生物合成的标志物。总的来说，这些结果表明，勒格列酮靶向PPARγ通路可能为FRDA提供一种有效的治疗方法，通过增强线粒体功能和生物合成，提高受损的弗拉塔辛蛋白缺乏的背根神经节（DRG）神经元中的弗拉塔辛蛋白水平。另一方面，勒格列酮可通过增加弗拉塔辛蛋白缺乏的心肌细胞中的脂肪酸β-氧化来改善能量代谢，而不升高弗拉塔辛蛋白水平。这可能与线粒体生物合成不足和心脏肥大有关。研究结果进一步证实了弗里德赖希共济失调（FRDA）中不同组织的需求差异，以及利格列酮的多效性，这可能使其成为FRDA的一种有前景的治疗方法。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33171227/

代谢/代谢物
5-[(4-{2-[5-(1-羟乙基)吡啶-2-基]乙氧基}苯基)甲基]-1,3-噻唑烷-2,4-二酮是吡格列酮的已知人体代谢物。

[1]. Structural Basis of Altered Potency and Efficacy Displayed by a Major in Vivo Metabolite of the Antidiabetic PPARγ Drug Pioglitazone. J Med Chem. 2019 Feb 28;62(4):2008-2023.

羟基吡格列酮是噻唑烷二酮类药物，是吡格列酮的羟基衍生物。它是一种人体外源性代谢物。它属于噻唑烷二酮类、吡啶类和芳香醚类化合物。它在功能上与吡格列酮相关。
Leriglitazone 正在临床试验 NCT03917225（一项评估 MIN-102 对男性和女性弗里德赖希共济失调患者病情进展影响的临床研究）中进行研究。
Leriglitazone 是一种口服生物利用度高、可穿透血脑屏障 (BBB) 的选择性过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) γ 亚型激动剂，具有潜在的神经保护活性，可用于治疗某些中枢神经系统 (CNS) 疾病，例如肾上腺脊髓神经病、脑性肾上腺脑白质营养不良 (cALD)、弗里德赖希共济失调以及其他一些 CNS 疾病。口服后，leriglitazone 可选择性地靶向、结合并激活 PPARγ，从而调节参与线粒体生物合成的基因表达。该药物可调节导致线粒体功能恢复的通路（线粒体功能障碍是由极长链脂肪酸 (VLCFA) 的积累引起的），并可增加能量产生、降低氧化应激、降低核因子κB (NF-κB) 水平、抑制神经炎症、保护血脑屏障 (BBB) 完整性、预防脱髓鞘和轴突变性、提高神经元存活率、促进髓鞘形成和少突胶质细胞存活，并改善运动功能。编码过氧化物酶体膜肾上腺脑白质营养不良蛋白的ABCD1基因突变会导致ABCD1转运蛋白功能缺陷，进而导致VLCFA积累。VLCFA积累会导致髓鞘膜不稳定、线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症和血脑屏障完整性受损。

---

药物适应症
治疗肾上腺脑白质营养不良

C19H20N2O4S

372.439

372.114

C, 61.27; H, 5.41; N, 7.52; O, 17.18; S, 8.61

146062-44-4

Leriglitazone hydrochloride;146062-46-6;Leriglitazone-d4;1188263-49-1; 146062-44-4

4147757

White to light yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

627.6±55.0 °C at 760 mmHg

157-158ºC

333.4±31.5 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.628

1.11

113.82

2

6

7

26

496

0

OXVFDZYQLGRLCD-RGUGMKFQSA-N

InChI=1S/C19H20N2O4S/c1-12(22)14-4-5-15(20-11-14)8-9-25-16-6-2-13(3-7-16)10-17-18(23)21-19(24)26-17/h2-7,11-12,17,22H,8-10H2,1H3,(H,21,23,24)/t12?,17-/m1/s1

rac-(5R)-5-{[4-(2-{5-[(1RS)-1-hydroxyethyl]pyridin-2- yl}ethoxy)phenyl]methyl}-1,3-thiazolidine-2,4-dione

Leriglitazonum; Leriglitazona; MIN-102; MIN102; Hydroxypioglitazone; 146062-44-4; Leriglitazone; Hydroxy Pioglitazone (M-IV); MIN-102; Leriglitazone [USAN]; K824X25AYA; 2,4-Thiazolidinedione, 5-[[4-[2-[5-(1-hydroxyethyl)-2-pyridinyl]ethoxy]phenyl]methyl]-; Leriglitazone1-Hydroxypioglitazone; MIN 102

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。