MS-67

WDR5 (WD40 repeat domain protein 5) - degrader that recruits VHL E3 ligase; DC50 = 3.7 ± 1.4 nM
Binding affinity: Kd (to WDR5) = 63 ± 10 nM; Kd (to VCB) = 140 ± 7.2 nM. Ternary complex Kd = 52 ± 8.3 nM; cooperativity (α = Kd(binary)/Kd(ternary)) = 2.74. [1]

- 在人MLL-r AML细胞MV4;11中，MS67在低至1 nM浓度时即可诱导WDR5降解，DC50为3.7 ± 1.4 nM，在0.5 μM时达到近乎完全的WDR5耗竭，Dmax为94 ± 1%。OICR-9429和阴性对照MS67N不降解WDR5。[1]
- 在MIA PaCa-2 PDAC细胞中，MS67的DC50为45 ± 16 nM，Dmax为85 ± 6%。[1]
- MS67在MV4;11细胞（最早2小时出现降解，约4小时达到最大）和MIA PaCa-2细胞（约24小时达到最大）中均以时间依赖性方式诱导WDR5降解。MS67N和OICR-9429不降解WDR5。[1]
- 在六种MLL-r AML细胞系和四种PDAC细胞系中，MS67有效降解WDR5，无钩状效应，在PDAC细胞中呈浓度依赖性。MS67N和OICR-9429无效。[1]
- 用OICR-9429、carfilzomib、MLN4924或VHL配体Ac-VHL-Me/Ac-VHL预处理MIA PaCa-2细胞可抑制MS67诱导的WDR5降解。Ac-VHL-Me比Ac-VHL更有效。在293FT细胞中敲除VHL可消除MS67介导的WDR5降解。[1]
- 洗脱实验显示，在MV4;11细胞中，MS67处理后WDR5蛋白表达在约48小时反弹，约72小时几乎完全恢复。在MIA PaCa-2细胞中，反弹发生在约24小时，约36小时几乎完全恢复。[1]
- MS67在三种小鼠AML细胞系中也降解WDR5，但效力低于人AML细胞系。[1]
- 在MIA PaCa-2细胞中用1.5 μM MS67处理2.5小时后的质谱全局蛋白质组学分析检测了4000多种蛋白；WDR5是唯一显示显著减少的蛋白（阈值：P < 0.01，倍数变化 > 1.5）。[1]
- MS67对超过100个靶标（包括22种蛋白甲基转移酶、45种激酶和44种GPCR/离子通道/转运蛋白）无有效抑制或结合，除Sigma 2受体外（1 μM时结合率67 ± 10%，Ki = 1.0 ± 0.8 μM）。[1]
- 过表达WDR5 D172A突变体（而非Y191A）可消除MS67介导的降解，表明特定的WDR5-VHL相互作用的重要性。[1]
- MS67（而非OICR-9429或MS67N）降低了MLL复合物组分和c-MYC的染色质结合部分，并降低了H3K4me2/3水平，但不影响H3K9me3、H3K27me3或H3K36me3。[1]
- MS67在MLL-r AML细胞中显示出强效的抗增殖作用：GI50值分别为15 ± 8 nM（MV4;11）、38 ± 1 nM（EOL-1）、200 ± 37 nM（MOLM13）、320 ± 110 nM（KOPN8）、460 ± 58 nM（RS4;11）和530 ± 23 nM（THP-1）。非MLL-r白血病细胞（K562、HL-60）不敏感（GI50 > 30 μM）。[1]
- 在PDAC细胞中，MS67的GI50值分别为2.6 ± 0.2 μM（HPAF-II）、7.0 ± 1.1 μM（BxPC-3）、8.1 ± 2.6 μM（MIA PaCa-2）和10 ± 2.2 μM（Panc 10.05）。MS67在其他癌细胞系中效果较差（GI50 > 30 μM）。[1]
- MS67在敏感的AML和PDAC细胞中诱导细胞周期阻滞和凋亡，而OICR-9429和MS67N效果甚微。[1]
- 在原代AML患者样本中，MS67（0.05-1 μM）以浓度依赖性方式有效降低WDR5蛋白表达并抑制细胞生长，而MS67N无效果。[1]

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WDR5 降解由 MS67 (0.001-1 μM) 在 1 nM 剂量下诱导。在所有六种混合谱系白血病 (MLL)-r 急性髓系白血病 (AML) 和四种胰腺导管腺癌 (PDAC) 细胞系中，MS67 显着更有效地诱导 WDR5 耗竭，且没有钩状效应，并且在 PDAC 细胞中以浓度依赖性方式。 1]。在 MV4;11 和 MIA PaCa-2 细胞中，MS67 降低 H3K4me2/3，但对已研究的其他组蛋白甲基化标记没有影响，包括 H3K9me3、H3K27me3 和 H3K36me3。 MS67 可以有效抑制 WDR5/MLL 诱导的染色质 H3K4 甲基化和 WDR5 相关基因表达程序[1]。两个最敏感的 AML 系 MV4;11 和 EOL-1 的 MS67 GI50 值分别为 15 nM 和 38 nM。不携带 MLL-r 的白血病细胞系（例如 K562、HL60 和由 Hoxa9 加 Meis1 转化的鼠 AML 细胞系）对 MS67 不敏感，而 MLL-r 急性白血病细胞系，例如 MV4;11、EOL- 1、MOLM13、KOPN8、RS4;11 和 THP-1 对其敏感[1]...MS67 的 Kd 为 140 nM，可与 VHL-Elongin C-Elongin B 三元复合物 (VCB) 结合[1 ]。

- MV4;11异种移植模型： 接种MV4;11皮下异种移植瘤的NSG小鼠在接种后第26天开始接受MS67治疗（75 mg/kg，腹腔注射，每日两次，每周5天）。与赋形剂相比，MS67显著抑制肿瘤生长（第38天P = 0.028）。未观察到体重下降。MS67治疗组小鼠肿瘤样本中WDR5被显著降解。末次给药后2小时，MS67在血浆和肿瘤样本中的浓度分别约为5 μM和0.6 μM。RT-qPCR分析显示WDR5靶基因下调。[1]
- AML PDX模型： 接种MLL-AF9+ AML PDX肿瘤的NSG-SGM3小鼠在接种后第13天开始接受MS67治疗（150 mg/kg，腹腔注射，周一/三/五每日两次，周二/四每日一次）。与赋形剂相比，MS67显著抑制肿瘤生长（第15天P = 9.69 × 10⁻⁰⁵）并延长生存期（P = 0.0013），而OICR-9429（37.5 mg/kg，相同方案）无显著效果。未观察到体重变化。MS67在肿瘤样本中的浓度为0.47 μM（OICR-9429为20 μM），但MS67有效降解了WDR5，而OICR-9429没有。[1]

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MS67（腹腔注射；每天两次，每周五天；75 mg/kg）可显着抑制体内肿瘤生长，并延长治疗小鼠的生存时间[1]。单次 75 mg/kg 腹腔 (ip) 注射后，Cmax 约为 4.2 μM，MS67 的浓度在 12 小时内保持在 0.5 μM 以上[1]。

- 用于MS67结合的等温滴定量热法： 进行ITC实验以测量结合亲和力。对于MS67与WDR5的结合，将WDR5滴定到MS67中。对于MS67与VCB的结合，将VCB滴定到MS67中。为了评估三元复合物协同性，先将WDR5滴定到MS67中至饱和，然后将VCB滴定到饱和的WDR5-MS67复合物中。MS67与VCB的结合解离常数（Kd）为140 ± 7.2 nM，与WDR5的Kd为63 ± 10 nM。三元复合物Kd为52 ± 8.3 nM，协同性α = 2.74。[1]
- WDR5-MS67-VCB三元复合物的X射线晶体学： 以2.1 Å分辨率解析了WDR5-MS67-VCB复合物的晶体结构（PDB ID: 7JTP）。与MS33三元复合物相比，MS67使VHL和WDR5更靠近，产生了更广泛的蛋白-蛋白相互作用界面。MS67连接子的走向与MS33大致正交。出现了新的氢键，包括WDR5 Asp172与VHL Arg107/Arg108之间的氢键，以及WDR5 Tyr191/Leu234与VHL His110/Pro71之间的非极性接触。观察到交叉蛋白-配体相互作用：WDR5与MS67的VHL结合部分接触，VHL与MS67的WDR5结合部分接触。哌嗪环2位和4位的甲基填充了疏水空腔，苯环上的氟基团与WDR5的Phe133和Tyr191相互作用。[1]

- 用于WDR5降解的Western blot分析： 将细胞用指定浓度的MS67处理指定时间。裂解细胞，将蛋白裂解液通过SDS-PAGE分离，转移到膜上，用抗WDR5和抗微管蛋白抗体探测。使用ImageJ软件定量条带强度以计算DC50和Dmax值。[1]
- 细胞增殖测定（GI50确定）： 将细胞接种在96孔板中，用系列稀释的MS67、MS67N或OICR-9429处理6天（AML细胞）或8天（PDAC细胞）。使用CellTiter-Glo或类似活力测定法测量相对细胞数。使用非线性回归计算GI50值。[1]
- 细胞周期分析： 将细胞用DMSO或化合物处理48-96小时，用乙醇固定，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术分析。使用FlowJo软件确定细胞周期分布。[1]
- 凋亡分析： 将细胞用DMSO或化合物处理96小时，用Annexin V和碘化丙啶染色，并通过流式细胞术分析。[1]
- 染色质分级分离： 将细胞用化合物处理，裂解，分级分离为细胞质、核可溶性和染色质结合部分。通过免疫印迹分析染色质结合蛋白。[1]
- RNA-seq和数据分析： 从用DMSO、OICR-9429、MS67N或MS67处理的细胞中提取总RNA。制备RNA-seq文库并测序。差异表达基因的鉴定阈值为|log2FC| > 0.58且FDR < 0.05。进行了基因集富集分析。[1]
- H3K4me2的ChIP-seq： 将细胞用DMSO、OICR-9429、MS67N或MS67处理，交联，用抗H3K4me2抗体进行染色质免疫沉淀。制备文库并测序。使用Spike-in归一化评估全基因组变化。[1]
- 原代AML细胞培养和生长抑制： 从去识别患者获得原代AML细胞，用DMSO、MS67或MS67N以指定浓度处理24-96小时。通过免疫印迹评估WDR5降解，使用活力测定法测量细胞生长。[1]

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Western Blot 分析[1]
细胞类型： MV4；11 个细胞
测试浓度： 0.001 μM、0.005 μM、0.01 μM、0.05 μM、0.1 μM ，0.5 μM，1 μM
孵育时间：18 小时
实验结果：使用 DC50 在低至 1 nM 的浓度下诱导 WDR5 降解3.7纳米。

- 小鼠PK研究： 雌性Balb/c小鼠单次腹腔注射MS67 75 mg/kg。在多个时间点收集血液，通过LC/MS测量MS67的血浆浓度。[1]
- MV4;11异种移植药效研究： NOD/SCID/gamma(c)(null)小鼠皮下接种MV4;11细胞。当肿瘤达到约200-300 mm³时（第26天），将小鼠随机分组，分别用赋形剂或MS67治疗（75 mg/kg，腹腔注射，每日两次，每周5天）。每2-3天用卡尺测量肿瘤体积。监测体重。研究结束时，收集肿瘤和血浆样本用于WDR5免疫印迹、药物浓度测量和RT-qPCR分析。[1]
- AML PDX药效研究： NSG-SGM3小鼠皮下接种MLL-AF9+ AML PDX肿瘤碎片。当肿瘤达到约100-200 mm³时（第13天），将小鼠随机分组，分别用赋形剂、MS67（150 mg/kg，腹腔注射，周一/三/五每日两次，周二/四每日一次）或OICR-9429（37.5 mg/kg，相同方案）治疗。测量肿瘤体积，监测体重，记录生存期。研究结束时，收集肿瘤和血浆样本用于药物浓度测量和WDR5免疫印迹。[1]

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动物/疾病模型： MV4;11 MLL-r AML 异种移植小鼠[1]
剂量： 75 mg /kg
给药途径： 腹腔注射；每日两次；每周 5 天；持续 20 天
实验结果： 抑制体内肿瘤生长。

- 小鼠单次腹腔注射MS67 75 mg/kg后，最大血浆浓度（Cmax）达到约4.2 μM，浓度在12小时内保持在0.5 μM以上。[1]
- 在MV4;11异种移植荷瘤小鼠中，MS67治疗（75 mg/kg，腹腔注射，每日两次，共5天）后，末次给药后2小时，MS67在血浆中的平均浓度约为5 μM，在肿瘤样本中的平均浓度约为0.6 μM。[1]
- 在AML PDX模型中，MS67在肿瘤样本中的浓度为0.47 μM，在相似给药条件下显著低于OICR-9429（20 μM），但MS67有效降解了WDR5，而OICR-9429没有。[1]

- 在MV4;11异种移植小鼠中，MS67治疗（75 mg/kg，腹腔注射，每日两次，每周5天）长达20天，与赋形剂处理的对照组相比，未观察到体重下降。[1]
- 在AML PDX模型中，MS67治疗组小鼠（150 mg/kg，腹腔注射，间歇给药）与赋形剂对照组相比未显示体重下降。[1]
- MS67对超过100个脱靶靶标（包括45种激酶和44种GPCR/离子通道/转运蛋白）无有效抑制或结合，Sigma 2受体除外（Ki = 1.0 ± 0.8 μM）。[1]

[1]. A selective WDR5 degrader inhibits acute myeloid leukemia in patient-derived mouse models. Sci Transl Med. 2021 Sep 29;13(613):eabj1578.

- MS67是一种PROTAC，可同时结合WDR5和VHL E3连接酶，导致WDR5泛素化和蛋白酶体降解。它是通过从初始降解剂MS33进行基于结构的优化而开发的，关键改进包括更短的连接子、哌嗪环2位和4位的甲基取代、苯环上的氟基团，以及用甲基化VHL-1替换VHL-1以增强VHL结合。[1]
- WDR5-MS67-VCB三元复合物的晶体结构（PDB: 7JTP）显示，与MS33相比，具有更广泛的VHL-WDR5界面和交叉蛋白-配体相互作用，解释了增强的协同性和降解效率。[1]
- MS67抑制WDR5调节的基因转录，包括核糖体组分和肿瘤发生相关转录本，并降低癌症相关基因座上的H3K4me2水平。[1]
- 尽管在肿瘤中达到的浓度较低，但MS67在抑制体内肿瘤生长和延长MLL-r AML PDX模型生存期方面比WDR5 PPI抑制剂OICR-9429更有效，展示了PROTAC的催化优势。[1]
- MLL-r AML细胞系对MS67的敏感性存在差异，MV4;11和EOL-1最为敏感，而RS4;11和THP-1较不敏感。这种差异的原因值得进一步研究。[1]

C52H59F4N9O7S

1030.14

1029.419

C, 60.63; H, 5.77; F, 7.38; N, 12.24; O, 10.87; S, 3.11

2407452-77-9

153379992

White to off-white solid powder

5.5

234

6

15

14

73

2090

6

N(C1C=C(C2C(=CC=C(C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)(C)C)C(N3C[C@H](O)C[C@H]3C(=O)N[C@H](C3C=CC(C4SC=NC=4C)=CC=3)C)=O)C=2)F)C=CC=1N1C[C@H](C)N(C)[C@H](C)C1)C(C1=CNC(=O)C=C1C(F)(F)F)=O

HBHSDSLZXDASLT-FLKKWHKHSA-N

InChI=1S/C52H59F4N9O7S/c1-27-23-64(24-28(2)63(27)8)41-16-14-33(18-40(41)61-48(70)37-21-57-43(67)20-38(37)52(54,55)56)36-17-34(13-15-39(36)53)47(69)58-22-44(68)62-46(51(5,6)7)50(72)65-25-35(66)19-42(65)49(71)60-29(3)31-9-11-32(12-10-31)45-30(4)59-26-73-45/h9-18,20-21,26-29,35,42,46,66H,19,22-25H2,1-8H3,(H,57,67)(H,58,69)(H,60,71)(H,61,70)(H,62,68)/t27-,28+,29-,35+,42-,46+/m0/s1

N-[5-[2-fluoro-5-[[2-[[(2S)-1-[(2S,4R)-4-hydroxy-2-[[(1S)-1-[4-(4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)phenyl]ethyl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-3,3-dimethyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]carbamoyl]phenyl]-2-[(3R,5S)-3,4,5-trimethylpiperazin-1-yl]phenyl]-6-oxo-4-(trifluoromethyl)-1H-pyridine-3-carboxamide

MS67; MS-67; 2407452-77-9; MS 67; CHEMBL5415680; N-{2'-fluoro-5'-[({[(2S)-1-[(2S,4R)-4-hydroxy-2-{[(1S)-1-[4-(4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)phenyl]ethyl]carbamoyl}pyrrolidin-1-yl]-3,3-dimethyl-1-oxobutan-2-yl]carbamoyl}methyl)carbamoyl]-4-[(3R,5S)-3,4,5-trimethylpiperazin-1-yl]-[1,1'-biphenyl]-3-yl}-6-oxo-4-(trifluoromethyl)-1,6-dihydropyridine-3-carboxamide; N-(2'-fluoro-5'-((2-(((S)-1-((2S,4R)-4-hydroxy-2-(((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)carbamoyl)pyrrolidin-1-yl)-3,3-dimethyl-1-oxobutan-2-yl)amino)-2-oxoethyl)carbamoyl)-4-((3R,5S)-3,4,5-trimethylpiperazin-1-yl)-[1,1'-biphenyl]-3-yl)-6-oxo-4-(trifluoromethyl)-1,6-dihydropyridine-3-carboxamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~97.07 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。