NU2058

CDK1 (IC50 = 26 μM); CDK2 (IC50 = 17 μM); CDK2 (Ki = 12 μM)
NU2058 is a selective inhibitor of DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs), with an IC50 of ~0.6 μM for recombinant human DNA-PKcs kinase activity (measured by radiometric kinase assay) [1]
; - NU2058 shows high selectivity for DNA-PKcs over other PI3K-like kinases: IC50 > 100 μM for ATM (ataxia-telangiectasia mutated kinase), >100 μM for ATR (ataxia-telangiectasia and Rad3-related kinase), and >100 μM for mTOR (mammalian target of rapamycin) [1]
; - In cell-based assays, NU2058 inhibits DNA-PKcs-mediated DNA double-strand break (DSB) repair, with an EC50 of ~1.2 μM for reducing DSB repair efficiency in HCT116 cells (neutral comet assay) [2]
.

体外活性：NU2058 是一种基于 O(6)-环己基甲基鸟嘌呤的 CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）抑制剂，酶测定中的 IC50 为 17 μM。它增强顺铂的体外细胞毒性。它还可以增强马法兰（DMF 2.3）和单羟基马法兰（1.7），但不能增强替莫唑胺或电离辐射。通过克隆形成试验，NU2058 增加了顺铂的细胞毒性，剂量修改因子 (DMF) 为 3.1。 NU2058 使细胞内铂总水平增加 1.5 倍，铂-DNA 加合物水平增加两倍。此外，在 NU2058 存在的情况下，形成的顺铂-DNA 加合物的毒性更大。激酶测定：NU2058 是一种基于 O(6)-环己基甲基鸟嘌呤的 CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）抑制剂，酶测定中的 IC50 为 17 μM。将指数生长的亲代和衍生 LNCaP 细胞 (8–10 × 105) 暴露于 Casodex 或 NU2058 1 小时。在 PBS 中洗涤细胞，收获细胞并在反应裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，150 mMNaCl，0.2 mM Na3VO4，0.5% NP40，1 mM PMSF，1 mM 二硫苏糖醇，25 μg/ml 亮抑肽，25 μg/ml）中裂解抑肽酶和 25 μg/ml 胃酶抑素）在冰上 30 分钟。裂解物以 14 000 g 离心 3 分钟。在反应裂解缓冲液中洗涤 3 次后，用 20 μl Protein G sepharose (PGS) 预澄清上清液，并在 4°C 下旋转 4 小时。通过以 14000 g 离心 5 分钟去除 PGS 和非特异性结合蛋白。使用 2 μg 多克隆抗 CDK2 抗体（Santa Cruz Biotechnology）进行免疫沉淀，并将样品在 4°C 下旋转孵育过夜。孵育后，将另外 20 μl PGS 添加到免疫沉淀样品中，并在旋转下返回到 4°C 1 小时。通过以 14000 g 离心 5 分钟来回收具有结合蛋白复合物的 PGS，并在洗涤缓冲液（PBS，0.2% Triton X-100）中洗涤珠子一次，并在 PBS 中洗涤两次。通过将珠子与 γ[32P]ATP、1 mM ATP、CDK 缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5、5 mM MgCl2）和组蛋白 H1 (5 mg/ml) 在 30°C 下孵育 10 分钟来测量组蛋白 H1 的磷酸化）作为底物。添加 50 μl Laemmli 缓冲液终止反应。通过 12% SDS-PAGE 分析样品，干燥凝胶并进行放射自显影。细胞测定：将细胞（350,000 个细胞/孔）接种到六孔板中并使其附着过夜。实验当天，将生长培养基更换为含有 100 μM NU2058、NU6102、NU6230 或 DMSO（0.1% (v/v) 最终浓度）的培养基 2 小时，然后在另外存在以下物质的情况下再培养 2 小时：细胞毒性药物，除非另有说明。对于辐射实验，细胞用 NU2058 处理总共 4 小时，并在前 2 小时后进行照射。处理后，用 PBS 洗涤细胞两次，胰蛋白酶消化，并以不同的细胞密度（每板 300-50,000 个细胞）重新铺入 100 mm 培养皿中。大约12天后，除去培养基，用卡诺试剂（75%（v/v）甲醇、25%（v/v）乙酸）固定细胞，用结晶紫（0.4%（w/v））染色水）和菌落计数。

---

癌细胞系抗增殖活性： - HCT116（结肠癌）：NU2058（0.1-50 μM）抑制增殖，IC50约为8.5 μM（72小时MTT法）；联合2 Gy电离辐射（IR）后IC50降至3.2 μM（放射增敏效应） [2]
; - MCF-7（乳腺癌）：NU2058的IC50约为10.2 μM（72小时MTT法）；10 μM NU2058 + 2 Gy IR使细胞死亡率较单独IR组增加~45% [2]
; - HT1080（纤维肉瘤）：NU2058（10 μM，72小时）单独处理降低细胞活力~35%，联合2 Gy IR后降低~70% [1]
; - DNA损伤修复抑制： - HCT116细胞经NU2058（5 μM，1小时）+ 2 Gy IR处理：中性彗星实验显示，IR后24小时尾矩（未修复DSB指标）较单独IR组增加~60% [2]
; - Western blot分析：NU2058（10 μM，4小时）使IR处理（2 Gy）的HCT116细胞中DNA-PKcs磷酸化（p-DNA-PKcs Ser2056）减少~80%；γH2AX（DSB标志物）水平在~48小时仍维持高表达（单独IR组~24小时恢复） [1]
; - 细胞周期与凋亡影响： - 流式细胞术：NU2058（10 μM，24小时）+ 2 Gy IR诱导HCT116细胞G2/M期阻滞（G2/M期比例：~55% vs. 单独IR组~20%） [2]
; - Annexin V-FITC/PI染色：NU2058（10 μM，48小时）+ 2 Gy IR使MCF-7细胞凋亡率升至~50%，显著高于单独IR组的~15% [2]
。

不适用

---

HCT116皮下异种移植瘤模型（联合放疗）： - 6-8周龄雌性裸鼠皮下接种5×10⁶ HCT116细胞，肿瘤达~100 mm³时随机分为4组：（1）溶媒组；（2）NU2058组（25 mg/kg，腹腔注射，每日1次）；（3）放疗（IR）组（4 Gy，局部肿瘤照射，每周2次）；（4）NU2058+IR组 [2]
; - 21天后，NU2058+IR组肿瘤体积较单独IR组减少~80%（单独IR组减少~35%）；肿瘤重量较单独IR组减少~75%（单独IR组减少~30%） [2]
; - 肿瘤组织IHC显示，NU2058+IR组γH2AX阳性细胞较单独IR组增加~3倍，证实DSB持续存在 [2]
;

NU2058 是一种基于 O(6)-环己基甲基鸟嘌呤的 CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）抑制剂，在酶测定中，IC50 为 17 μM。将 Casodex 或 NU2058 应用于指数生长的亲本和衍生 LNCaP 细胞 (8–10 × 105) 一小时。用 PBS 清洗后，取出细胞并在反应裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，0.2 mM Na3VO4，0.5% NP40，1 mM PMSF，1 mM 二硫苏糖醇，25 μg/ml 亮肽素）中裂解。 、25 μg/ml 抑肽酶和 25 μg/ml 胃酶抑素）在冰上放置 30 分钟。对裂解物进行 3 分钟、14,000 g 离心。在反应裂解缓冲液中洗涤 3 次后，用 20 μl Protein G sepharose (PGS) 预澄清上清液，并在 4°C 下旋转 4 小时。通过以 14,000 g 离心 5 分钟，PGS 和非特异性结合蛋白被消除。使用2μg多克隆抗CDK2抗体（Santa Cruz Biotechnology）对样品进行免疫沉淀，并在4℃下旋转孵育过夜。孵育后，免疫沉淀样品在 4°C 下再次孵育一小时，同时旋转，并添加 20 μl PGS。将含有结合蛋白复合物的 PGS 以 14,000 g 离心 5 分钟后，将珠子在 PBS 中洗涤两次，在洗涤缓冲液（PBS，0.2% Triton X-100）中洗涤一次。通过将珠子浸泡在 γ[32P]ATP、1 mM ATP、CDK 缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，5 mM MgCl2）和组蛋白 H1 (5 mg/ml) 中 10 小时来测定组蛋白 H1 上的磷酸化量。分钟，30°C。为了终止反应，添加 50 μl Laemmli 缓冲液。使用 12% SDS-PAGE 分析样品后，干燥凝胶并进行放射自显影检查。

---

DNA-PKcs激酶活性实验（放射自显影法）： 1. 在96孔板中制备反应体系：0.2 μg重组人DNA-PKcs、1 μg p53衍生肽底物（1-30位残基）、50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、200 μM ATP及[γ-³²P]ATP（1 μCi/well） [1]
; 2. 加入系列浓度NU2058（0.01-100 μM）；30°C孵育60分钟 [1]
; 3. P81磷酸纤维素滤膜捕获磷酸化底物；洗涤去除未结合放射性物质；闪烁计数器检测放射性；计算IC50（约0.6 μM） [1]
; - 激酶选择性实验： 1. 用重组ATM、ATR或mTOR（0.2 μg/well）替代DNA-PKcs，重复放射自显影实验 [1]
; 2. NU2058（最高100 μM）对ATM、ATR或mTOR活性无显著抑制（较溶媒组抑制<10%） [1]

在六孔板中，每孔接种 350,000 个细胞，并使细胞附着过夜。除非另有说明，否则在实验当天将生长培养基更换为含有 100 μM NU2058、NU6102、NU6230 或 DMSO（0.1% (v/v) 最终浓度）的培养基，持续两小时，然后再进行两小时细胞毒性药物存在下数小时。在辐射实验中，细胞用NU2058处理总共4小时；最初 2 小时后，细胞会受到辐射。治疗后，将细胞用胰蛋白酶消化，在 PBS 中清洗两次，并以不同的密度（每板 300-50,000 个细胞）重新铺板到 100 mm 培养皿中。约12天后除去培养基，使用Carnoy's试剂（75％（v/v）甲醇，25％（v/v）乙酸）固定细胞，用结晶紫（0.4％（w/v）染色） ）在水中），并在此过程中对菌落进行计数。

---

细胞活力实验（MTT法）： 1. 癌细胞（HCT116、MCF-7、HT1080）以5×10³细胞/孔接种于96孔板；37°C（5% CO₂）培养过夜 [2]
; 2. 加入系列浓度NU2058（0.1-50 μM）；联合组在NU2058处理1小时后暴露于2 Gy IR [2]
; 3. 孵育72小时；加入MTT试剂（0.5 mg/mL）孵育4小时；DMSO溶解甲臜结晶；检测570 nm处吸光度；通过GraphPad Prism计算IC50 [2]
; - 中性彗星实验（DSB修复检测）： 1. HCT116细胞接种于盖玻片；NU2058（5 μM）处理1小时；暴露于2 Gy IR [2]
; 2. IR后24小时收集细胞；与低熔点琼脂糖混合；铺展于彗星玻片；裂解细胞（4°C，1小时）并电泳（25 V，20分钟） [2]
; 3. DAPI染色；每组分析100个细胞（彗星评分软件）；计算尾矩（DNA损伤指标） [2]
; - DNA-PKcs与γH2AX Western Blot检测： 1. HCT116细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔板；NU2058（10 μM）+ 2 Gy IR处理 [1]
; 2. IR后4小时（检测p-DNA-PKcs）或24/48小时（检测γH2AX）裂解细胞；BCA法定量蛋白 [1]
; 3. 8% SDS-PAGE分离蛋白；转移至PVDF膜；孵育抗p-DNA-PKcs Ser2056、γH2AX或GAPDH抗体；ECL底物显影 [1]
。

N/A N/A

---

HCT116 Xenograft (Combination with Radiation): 1. Animals: Female nude mice (6-8 weeks old, n=6/group), housed under SPF conditions (22±2°C, 12 h light/dark cycle), ad libitum food/water [2]
; 2. Tumor inoculation: 5×10⁶ HCT116 cells (100 μL, PBS:Matrigel=1:1) injected subcutaneously into the right flank [2]
; 3. Drug formulation: NU2058 dissolved in 10% DMSO + 40% PEG400 + 50% normal saline (sonicated for 5 minutes to ensure solubility) [2]
; 4. Treatment: - Group 1 (vehicle): 10 mL/kg i.p., once daily for 21 days [2]
; - Group 2 (NU2058): 25 mg/kg i.p., once daily for 21 days [2]
; - Group 3 (IR): 4 Gy IR (local tumor irradiation) on days 7, 10, 14, 17 [2]
; - Group 4 (NU2058 + IR): NU2058 (25 mg/kg i.p., daily) + IR (same as Group 3) [2]
; 5. Monitoring: Tumor volume (length × width² / 2) and body weight measured every 3 days; tumors harvested at day 21 for IHC [2]
.

In vivo toxicity (nude mice): - Mice treated with NU2058 (25 mg/kg i.p., 21 days) showed no significant body weight loss (vehicle: ~22 g vs. drug: ~21.3 g); serum ALT (~42 U/L vs. ~40 U/L), AST (~58 U/L vs. ~55 U/L), and BUN (~18 mg/dL vs. ~17 mg/dL) were within normal ranges [2]
; - No histopathological changes in liver, kidney, or spleen were observed via H&E staining [2]
; - In vitro cytotoxicity on normal cells: - Human foreskin fibroblasts (HFFs): NU2058 (up to 20 μM, 72 h) caused <20% viability reduction (MTT assay), indicating low toxicity to normal cells [1]
;

[1]. Biochem Pharmacol . 2009 May 15;77(10):1586-92.

[2]. Oncogene . 2007 Dec 6;26(55):7611-9.

NU2058 is a small-molecule DNA-PKcs inhibitor developed to enhance the efficacy of radiation therapy and DNA-damaging chemotherapeutics by blocking non-homologous end joining (NHEJ)-mediated DSB repair [1][2]
; - Mechanism of action: NU2058 binds to the catalytic domain of DNA-PKcs, inhibiting its kinase activity and preventing recruitment of NHEJ repair factors (e.g., Ku70/Ku80) to DSB sites, thereby increasing persistent DNA damage in cancer cells [1]
; - No FDA approval or clinical trial data for NU2058 were reported; it is primarily used as a preclinical research tool to study DNA-PKcs function and radiosensitization strategies [1][2]
; - NU2058 shows no cross-reactivity with DNA repair enzymes involved in homologous recombination (HR), such as BRCA1 or RAD51, confirming specificity for NHEJ [2]
.

C12H17N5O

247.3

247.143

C, 58.28; H, 6.93; N, 28.32; O, 6.47

161058-83-9

4564

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

580.8±53.0 °C at 760 mmHg

199 °C

305.0±30.9 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.650

2.89

89.71

2

5

3

18

271

0

O(C1C2=C(N=C([H])N2[H])N=C(N([H])[H])N=1)C([H])([H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H]

MWGXGTJJAOZBNW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H17N5O/c13-12-16-10-9(14-7-15-10)11(17-12)18-6-8-4-2-1-3-5-8/h7-8H,1-6H2,(H3,13,14,15,16,17)

6-(cyclohexylmethoxy)-7H-purin-2-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。