NU2058

CDK1 (IC50 = 26 μM); CDK2 (IC50 = 17 μM); CDK2 (Ki = 12 μM)

体外活性：NU2058 是一种基于 O(6)-环己基甲基鸟嘌呤的 CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）抑制剂，酶测定中的 IC50 为 17 μM。它增强顺铂的体外细胞毒性。它还可以增强马法兰（DMF 2.3）和单羟基马法兰（1.7），但不能增强替莫唑胺或电离辐射。通过克隆形成试验，NU2058 增加了顺铂的细胞毒性，剂量修改因子 (DMF) 为 3.1。 NU2058 使细胞内铂总水平增加 1.5 倍，铂-DNA 加合物水平增加两倍。此外，在 NU2058 存在的情况下，形成的顺铂-DNA 加合物的毒性更大。激酶测定：NU2058 是一种基于 O(6)-环己基甲基鸟嘌呤的 CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）抑制剂，酶测定中的 IC50 为 17 μM。将指数生长的亲代和衍生 LNCaP 细胞 (8–10 × 105) 暴露于 Casodex 或 NU2058 1 小时。在 PBS 中洗涤细胞，收获细胞并在反应裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，150 mMNaCl，0.2 mM Na3VO4，0.5% NP40，1 mM PMSF，1 mM 二硫苏糖醇，25 μg/ml 亮抑肽，25 μg/ml）中裂解抑肽酶和 25 μg/ml 胃酶抑素）在冰上 30 分钟。裂解物以 14 000 g 离心 3 分钟。在反应裂解缓冲液中洗涤 3 次后，用 20 μl Protein G sepharose (PGS) 预澄清上清液，并在 4°C 下旋转 4 小时。通过以 14000 g 离心 5 分钟去除 PGS 和非特异性结合蛋白。使用 2 μg 多克隆抗 CDK2 抗体（Santa Cruz Biotechnology）进行免疫沉淀，并将样品在 4°C 下旋转孵育过夜。孵育后，将另外 20 μl PGS 添加到免疫沉淀样品中，并在旋转下返回到 4°C 1 小时。通过以 14000 g 离心 5 分钟来回收具有结合蛋白复合物的 PGS，并在洗涤缓冲液（PBS，0.2% Triton X-100）中洗涤珠子一次，并在 PBS 中洗涤两次。通过将珠子与 γ[32P]ATP、1 mM ATP、CDK 缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5、5 mM MgCl2）和组蛋白 H1 (5 mg/ml) 在 30°C 下孵育 10 分钟来测量组蛋白 H1 的磷酸化）作为底物。添加 50 μl Laemmli 缓冲液终止反应。通过 12% SDS-PAGE 分析样品，干燥凝胶并进行放射自显影。细胞测定：将细胞（350,000 个细胞/孔）接种到六孔板中并使其附着过夜。实验当天，将生长培养基更换为含有 100 μM NU2058、NU6102、NU6230 或 DMSO（0.1% (v/v) 最终浓度）的培养基 2 小时，然后在另外存在以下物质的情况下再培养 2 小时：细胞毒性药物，除非另有说明。对于辐射实验，细胞用 NU2058 处理总共 4 小时，并在前 2 小时后进行照射。处理后，用 PBS 洗涤细胞两次，胰蛋白酶消化，并以不同的细胞密度（每板 300-50,000 个细胞）重新铺入 100 mm 培养皿中。大约12天后，除去培养基，用卡诺试剂（75%（v/v）甲醇、25%（v/v）乙酸）固定细胞，用结晶紫（0.4%（w/v））染色水）和菌落计数。

不适用

NU2058 是一种基于 O(6)-环己基甲基鸟嘌呤的 CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）抑制剂，在酶测定中，IC50 为 17 μM。将 Casodex 或 NU2058 应用于指数生长的亲本和衍生 LNCaP 细胞 (8–10 × 105) 一小时。用 PBS 清洗后，取出细胞并在反应裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，0.2 mM Na3VO4，0.5% NP40，1 mM PMSF，1 mM 二硫苏糖醇，25 μg/ml 亮肽素）中裂解。 、25 μg/ml 抑肽酶和 25 μg/ml 胃酶抑素）在冰上放置 30 分钟。对裂解物进行 3 分钟、14,000 g 离心。在反应裂解缓冲液中洗涤 3 次后，用 20 μl Protein G sepharose (PGS) 预澄清上清液，并在 4°C 下旋转 4 小时。通过以 14,000 g 离心 5 分钟，PGS 和非特异性结合蛋白被消除。使用2μg多克隆抗CDK2抗体（Santa Cruz Biotechnology）对样品进行免疫沉淀，并在4℃下旋转孵育过夜。孵育后，免疫沉淀样品在 4°C 下再次孵育一小时，同时旋转，并添加 20 μl PGS。将含有结合蛋白复合物的 PGS 以 14,000 g 离心 5 分钟后，将珠子在 PBS 中洗涤两次，在洗涤缓冲液（PBS，0.2% Triton X-100）中洗涤一次。通过将珠子浸泡在 γ[32P]ATP、1 mM ATP、CDK 缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，5 mM MgCl2）和组蛋白 H1 (5 mg/ml) 中 10 小时来测定组蛋白 H1 上的磷酸化量。分钟，30°C。为了终止反应，添加 50 μl Laemmli 缓冲液。使用 12% SDS-PAGE 分析样品后，干燥凝胶并进行放射自显影检查。

在六孔板中，每孔接种 350,000 个细胞，并使细胞附着过夜。除非另有说明，否则在实验当天将生长培养基更换为含有 100 μM NU2058、NU6102、NU6230 或 DMSO（0.1% (v/v) 最终浓度）的培养基，持续两小时，然后再进行两小时细胞毒性药物存在下数小时。在辐射实验中，细胞用NU2058处理总共4小时；最初 2 小时后，细胞会受到辐射。治疗后，将细胞用胰蛋白酶消化，在 PBS 中清洗两次，并以不同的密度（每板 300-50,000 个细胞）重新铺板到 100 mm 培养皿中。约12天后除去培养基，使用Carnoy's试剂（75％（v/v）甲醇，25％（v/v）乙酸）固定细胞，用结晶紫（0.4％（w/v）染色） ）在水中），并在此过程中对菌落进行计数。

[1]. Biochem Pharmacol . 2009 May 15;77(10):1586-92.

[2]. Oncogene . 2007 Dec 6;26(55):7611-9.

C12H17N5O

247.3

247.14

C, 58.28; H, 6.93; N, 28.32; O, 6.47

161058-83-9

Solid powder

C1CCC(CC1)COC2=NC(=NC3=C2NC=N3)N

MWGXGTJJAOZBNW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H17N5O/c13-12-16-10-9(14-7-15-10)11(17-12)18-6-8-4-2-1-3-5-8/h7-8H,1-6H2,(H3,13,14,15,16,17)

6-(cyclohexylmethoxy)-7H-purin-2-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Note: Listed below are some common formulations that may be used to formulate products with low water solubility (e.g. < 1 mg/mL), you may test these formulations using a minute amount of products to avoid loss of samples.

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Injection Formulation 1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (i.e. 100 μL DMSO stock solution → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH ₂ O to obtain a clear solution.
Injection Formulation 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (i.e. 100 μL DMSO → 400 μLPEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
Injection Formulation 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (i.e. 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
Example: Take the Injection Formulation 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) as an example, if 1 mL of 2.5 mg/mL working solution is to be prepared, you can take 100 μL 25 mg/mL DMSO stock solution and add to 900 μL corn oil, mix well to obtain a clear or suspension solution (2.5 mg/mL, ready for use in animals).

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Injection Formulation 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in saline = 10 : 90 [i.e. 100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in saline)]
*Preparation of 20% SBE-β-CD in Saline (4°C，1 week): Dissolve 2 g SBE-β-CD in 10 mL saline to obtain a clear solution.
Injection Formulation 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (i.e. 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin → 500 μL Saline)
Injection Formulation 6: DMSO : PEG300 : castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (i.e. 50 μL DMSO → 100 μLPEG300 → 200 μL castor oil → 650 μL Saline)
Injection Formulation 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (i.e. 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
Injection Formulation 8: Dissolve in Cremophor/Ethanol (50 : 50), then diluted by Saline
Injection Formulation 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (i.e. 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
Injection Formulation 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (i.e. 100 μL EtOH → 400 μLPEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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Oral Formulation 1: Suspend in 0.5% CMC Na (carboxymethylcellulose sodium)
Oral Formulation 2: Suspend in 0.5% Carboxymethyl cellulose
Example: Take the Oral Formulation 1 (Suspend in 0.5% CMC Na) as an example, if 100 mL of 2.5 mg/mL working solution is to be prepared, you can first prepare 0.5% CMC Na solution by measuring 0.5 g CMC Na and dissolve it in 100 mL ddH2O to obtain a clear solution; then add 250 mg of the product to 100 mL 0.5% CMC Na solution, to make the suspension solution (2.5 mg/mL, ready for use in animals).

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Oral Formulation 3: Dissolved in PEG400
Oral Formulation 4: Suspend in 0.2% Carboxymethyl cellulose
Oral Formulation 5: Dissolve in 0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose
Oral Formulation 6: Mixing with food powders

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Note: Please be aware that the above formulations are for reference only. InvivoChem strongly recommends customers to read literature methods/protocols carefully before determining which formulation you should use for in vivo studies, as different compounds have different solubility properties and have to be formulated differently.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。