Tamoxifen-PEG-Clozapine

ERα/estrogen receptor α

我们设计了另一种基于氯氮平的PROTAC，靶向核受体蛋白ERα作为内源性治疗靶点。我们使用4-OHT作为ERα配体，PEG3作为接头，氯氮平作为E3配体来合成PROTAC他莫昔芬-PEG-氯氮平（10）（图4A）。合成的化合物10/三苯氧胺-PEG-氯氮平显示出与抑制剂4-OHT相当的ERα结合活性（图S8）。用10处理MCF-7乳腺癌症细胞24小时，评估ERα蛋白水平。结果表明，ERα水平从30μM开始显著降低（图4B）。为了验证ERα蛋白水平的降低是由于PROTAC引起的，我们进行了4-OHT和氯氮平的联合治疗实验。结果表明，与单独使用4-OHT、单独使用氯氮平或4-OHT和氯氮平联合治疗相比，10显著降低了ERα水平（图4C）。为了分析PROTAC诱导ERα蛋白水平降低的机制，我们研究了UPS抑制剂的作用。与蛋白酶体抑制剂MG132或泛素激活酶抑制剂MLN7243共处理后，化合物10介导的ERα减少被消除（图4D），表明10诱导了UPS介导的ERα蛋白降解。与已知会增加ERα水平的抗雌激素药物如他莫昔芬类似，（23,26,27）含有4-OHT作为配体的化合物10似乎也会诱导ERα的上调，特别是在低浓度范围内（0.03-10μM）和与MG132联合治疗时（图4B和4D）。[1]

氯氮平已被认为能与参与N-德隆途径的UBR家族蛋白的UBR盒结合，但其与同源UBR盒的结合特异性尚不清楚。因此，为了鉴定他莫昔芬-PEG-氯氮平/10招募的UBR蛋白，我们研究了siRNA敲除每种UBR蛋白对化合物10诱导的ERα降解的影响。敲除UBR1、UBR2和UBR4并不能消除10诱导的ERα的降低。相比之下，当UBR5被敲除时，观察到ERα蛋白减少受到轻微但显著的抑制（图5）。（在30μM时，ERα水平从16%增加到45%，在100μM时从41%增加到51%。）考虑到UBR5 siRNA不能完全抑制UBR5的表达，只有不到50%的UBR5残留，这一结果表明，UBR5部分但重要地促进了化合物10介导的ERα降解。在细胞活力测定中，化合物10对ERα阳性乳腺癌症MCF-7细胞的活力表现出浓度依赖性抑制作用（图S9），这与通过蛋白质印迹分析的ERα降解结果一致（图4B）。[1]

之前的一份报告表明，氯氮平可以用作PROTACs中的新E3配体。我们的研究表明，他莫昔芬-PEG-氯氮平（10）通过UPS途径诱导ERα降解，UBR5参与了这一降解途径。氯氮平通过增加E3配体的库来扩展PROTAC的可能应用。尽管需要进一步的研究来调查基于氯氮平的PROTAC的靶特异性和结合稳定性，但这项研究首次报道了一种利用氯氮平作为E3配体的PROTACs设计，这可能会扩大可用于PROTAC开发的E3配体库，并为靶向疾病相关蛋白的新治疗策略铺平道路[1]。

[1]. Clozapine as an E3 Ligand for PROTAC TechnologyJ. ACS Medicinal Chemistry Letters, 2025 Jan 8;16(2):258-262.

选择合适的E3连接酶对于PROTACs实现有效的靶向蛋白降解至关重要。尽管人类基因组编码超过600种E3连接酶，但目前PROTACs的开发主要使用少数几种E3连接酶，例如von Hippel-Lindau连接酶、cereblon连接酶、凋亡抑制蛋白连接酶和鼠双微体蛋白2连接酶。因此，拓展可用于PROTACs的E3连接酶种类对于该技术的发展至关重要。多个研究团队一直在寻找新的E3配体，其中芳烃受体（ArHCR）于2019年被报道为PROTACs的新型E3连接酶，FEM1B和DCAF1分别于2022年和2024年被报道。[1] 降解子（degron）是E3连接酶识别的独特氨基酸序列，已在多种生物体中发现，目前在出芽酵母和哺乳动物中寻找降解子的研究仍在进行中。降解子的氨基酸结构被用于开发PROTACs中的E3配体。例如，N-降解子结构主要被泛素蛋白连接酶E3组分N-识别蛋白（UBR）亚家族（UBR1、UBR2、UBR4和UBR5）识别，从而导致其底物蛋白的降解。基于N端降解子的PROTACs已被开发出来，它们利用UBR蛋白作为E3连接酶来降解靶蛋白。开发具有药物活性的PROTACs需要小分子E3配体。靶向BCR-ABL和雌激素受体α (ERα) 的两个PROTACs实例采用了一种小分子E3配体，该配体由N端降解子上的单个精氨酸残基组成，可被UBR蛋白识别。其他潜在的小分子配体也被提出，包括靶向UBR1的氨基酸模拟物异价配体和可能与UBR4结合的吡啶甲酸配体。计算机模拟显示，FDA批准的小分子抗精神病药物氯氮平应能与UBR蛋白结合并抑制其生理功能，这表明氯氮平可用作UBR E3配体。 [1]
在本研究中，我们探讨了氯氮平作为新型E3配体用于PROTAC的潜力。首先，我们设计并合成了一种基于氯氮平的PROTAC，该PROTAC靶向HaloTag蛋白，作为概念验证模型，并验证了其有效性。我们还设计并合成了另一种基于氯氮平的PROTAC，该PROTAC靶向ERα（乳腺癌的治疗靶点），并评估了其ERα降解活性，分析了其降解机制。[1]
最初，我们合成了一种基于氯氮平的PROTAC，即氯己烷-PEG-氯氮平（5），其靶向与翡翠荧光素酶（Elerald luciferase，简称ELuc）融合的HaloTag蛋白。ELuc是一种来自巴西叩甲的荧光素酶，它催化D-荧光素氧化生成电子激发态的氧荧光素，从而产生生物发光。该PROTAC由氯己烷、共价结合HaloTag蛋白的PEG2连接子以及E3配体氯氮平组成（图2A）。化合物5用于处理稳定表达Halo-ELuc的HEK293细胞24小时。荧光素酶活性检测显示，化合物5处理后Halo-ELuc的发光强度呈浓度依赖性下降（图2A）。Western blotting检测Halo-ELuc蛋白水平也呈浓度依赖性下降，与发光强度的变化一致（图2B）。[1]

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新型泛素连接酶（E3）配体对于开发蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）以诱导靶蛋白降解至关重要。在本研究中，我们以抗精神病药物氯氮平为新型E3配体开发了一种PROTAC。首先，我们合成了一种靶向模型靶蛋白HaloTag的氯氮平PROTAC（Halo-PEG-氯氮平），该PROTAC在细胞培养系统中诱导了HaloTag融合蛋白的降解。随后，我们合成了另一种靶向癌症治疗靶点雌激素受体α（ERα）的氯氮平PROTAC（他莫昔芬-PEG-氯氮平），该PROTAC在MCF-7乳腺癌细胞中诱导了ERα蛋白的降解。抑制剂和siRNA实验表明，他莫昔芬-PEG-氯氮平通过泛素-蛋白酶体系统降解ERα，该系统利用泛素蛋白连接酶E3组分N-识别蛋白5。这些结果表明，氯氮平是一种有前景的E3配体，可能拓展PROTAC的分子设计，并通过促进疾病相关蛋白的降解，为药物研发做出贡献。[1]

C54H63CLN6O7

943.57

942.444676

172676875

Typically exists as solids at room temperature

7.8

137 Ų

3

10

24

68

1560

0

CC/C(=C(/C1=CC=C(C=C1)O)\C2=CC=C(C=C2)OCCN(C)C(=O)CCC(=O)NCCOCCOCCOCCN3CCN(CC3)C4=NC5=C(C=CC(=C5)Cl)NC6=CC=CC=C64)/C7=CC=CC=C7

CSMUZRSXZXLELT-YVUJEYQCSA-N

InChI=1S/C54H63ClN6O7/c1-3-46(40-9-5-4-6-10-40)53(41-13-18-44(62)19-14-41)42-15-20-45(21-16-42)68-34-30-59(2)52(64)24-23-51(63)56-25-32-65-35-37-67-38-36-66-33-31-60-26-28-61(29-27-60)54-47-11-7-8-12-48(47)57-49-22-17-43(55)39-50(49)58-54/h4-22,39,57,62H,3,23-38H2,1-2H3,(H,56,63)/b53-46+

N-[2-[2-[2-[2-[4-(3-chloro-11H-benzo[b][1,4]benzodiazepin-6-yl)piperazin-1-yl]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethyl]-N'-[2-[4-[(E)-1-(4-hydroxyphenyl)-2-phenylbut-1-enyl]phenoxy]ethyl]-N'-methylbutanediamide

Tamoxifen-PEG-Clozapine; compound 10

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。