SIRT-IN-6   中文名称: 4-chloro-Thieno[3,2-d]pyrimidine-6-carboxamide

SIRT1 (IC50 >50 μM); SIRT2 (IC50 >50 μM); SIRT3 (IC50 >50 μM)

去乙酰化酶SIRT1、SIRT2和SIRT3是NAD（+）依赖性脱乙酰酶，被认为是代谢、炎症、肿瘤和神经退行性疾病的潜在靶点。编码文库技术（ELT）用于亲和筛选120万个富含DNA编码小分子杂环的文库，该文库鉴定出具有纳摩尔效力的SIRT1/2/3泛抑制剂（例如，11c:SIRT1、SIRT2和SIRT3的IC50分别为3.6、2.7和4.0 nM）。随后的SAR研究改善了理化性质，确定了强效的类药物类似物28和31。结合在SIRT3活性位点的11c、28和31的晶体学研究表明，常见的羧酰胺结合在烟酰胺C袋中，抑制剂的脂肪族部分延伸穿过底物通道，解释了可观察到的SAR。这些泛SIRT1/2/3抑制剂代表了一种新的化学型，比目前可用的抑制剂更有效，这使它们成为去乙酰化酶研究的宝贵工具[1]。

ELT亲和力选择[1]
在（1）无β-NAD/无肽底物、（2）100μMβ-NAD（Sigma）或（3）20μM TRSGK硫代乙酰基VMRRLLR存在下，通过在链霉抗生物素蛋白基质尖端捕获2μg Flag-hSIRT3（118-399）-SBP进行三轮选择。在没有SIRT3蛋白的情况下，同时进行缓冲液的无靶标对照选择。 在选择缓冲液中预洗链霉抗生物素蛋白尖端：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1%吐温-20、0.1 mg/mL剪切的鲑鱼精子DNA（sssDNA，Ambion）、0.1 mg/mL BSA和5 mMβ-巯基乙醇。在第一轮选择中，在（1）无β-NAD/无肽底物、（2）100μMβ-NAD或（3）20μM硫代乙酰化肽的存在下，将2μg Flag-hSIRT3（118-399）-SBP蛋白固定在预洗的尖端上。必要时，用含有相应辅因子和底物的缓冲液洗涤尖端两次。在室温下，在相应的辅因子和底物存在下，将合并的ELT文库（5 nmol）通过固定的SIRT3 1小时。用含有相应辅因子和底物的选择缓冲液洗涤尖端八次，用含有相应辅助因子和底物不含BSA的选择缓冲溶液洗涤尖端两次。通过在72°C下将不含辅因子和底物的BSA自由选择缓冲液通过尖端10分钟，对结合的分子进行热洗脱。通过将洗脱液通过链霉抗生物素蛋白尖端15分钟，对冷却的热洗脱进行两次后清除，以去除任何变性的SIRT3和基质粘合剂。将新鲜BSA和sssDNA添加到所有样品中，并根据需要将相应的辅因子和底物添加到洗脱液中。第2轮按照第1轮的描述进行，在相应的辅因子和底物存在下，使用链霉抗生物素蛋白尖端上新固定的SIRT3和后清除的第1轮输出。第3轮按照第1轮的描述进行，在相应的辅因子和底物存在的情况下，使用链霉抗生物素蛋白尖端上新固定的SIRT3和后清除的第2轮输出，但最后两次洗涤和洗脱是用不含BSA和sssDNA的选择缓冲液进行的，第3轮输出没有后清除。定量PCR用于量化每一轮选择的输出。使用Illumina测序平台对第3轮输出进行测序。

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蛋白质克隆、表达和纯化[1]
将人SIRT3-（118-399）克隆到专有的修饰pET21b载体中。该蛋白在大肠杆菌BL21-Gold（DE3）细胞中表达为N端融合物，与具有整合TEV蛋白酶位点的六组氨酸亲和标签融合。在37°C下将单个菌落接种在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，并以250 rpm的速度旋转，直到A600达到0.3。然后将培养物冷却至18°C，以250 rpm的速度旋转，直到A600达到0.6-0.8。加入1-（2-异丙硫基）-β-d-吡喃半乳糖苷（IPGT）至终浓度为0.3 mM，在18°C下继续表达，并以160 rpm的速度旋转过夜。通过离心收集细胞，将沉淀物重新悬浮在裂解缓冲液（200 mM NaCl、5%甘油、5 mM 2-巯基乙醇和25 mM HEPES NaOH，pH 7.5）中，并超声处理以破碎细胞。通过在4°C下以10000g离心40分钟，将上清液与细胞碎片分离，并装载到Ni-NTA柱上，该柱用含有200 mM NaCl、5%甘油、5 mM 2-巯基乙醇、20 mM咪唑和25 mM HEPES NaOH的缓冲液平衡，pH 7.5。用5倍柱体积的缓冲液洗涤该柱，该缓冲液含有200 mM NaCl、5%甘油、5 mM 2-巯基乙醇、50 mM咪唑和25 mM HEPES NaOH，pH 7.5，然后用含有200 mM氯化钠、5%丙三醇、5 mM-2-巯基乙醇、250 mM咪唑和25mM HEPES NaOH的缓冲液洗脱，pH 7.5。洗脱的蛋白质在裂解缓冲液中透析，并在4°C下用TEV蛋白酶消化过夜，以去除N端His标签。将蛋白质装载在用裂解缓冲液平衡的第二个Ni-NTA柱上。用含有200 mM NaCl、5%甘油、5 mM 2-巯基乙醇、5 mM咪唑和25 mM HEPES NaOH（pH 7.5）的缓冲液洗脱未标记的蛋白质。纯化的蛋白质用含有200 mM NaCl、5 mM 2-巯基乙醇和20 mM Tris-HCl（pH 8.0）的缓冲液透析并浓缩。通过在S200柱上用透析缓冲液洗脱将蛋白质进一步纯化至95%的纯度，通过考马斯亮蓝R-250染色的SDS-PAGE分析进行评估，并在透析缓冲液中浓缩至10-15mg/mL。

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SIRT1、SIRT2和SIRT3生化检测[1]
His-SIRT1（1-747）、His-SIRT2（1-389）和His-SIRT3（102-399）对Trp 5-mer肽（Ac-RHKKAcW-NH2）的脱乙酰化是通过非连续OAADPr质谱测定来测量的，该测定测量了OAADPr（2′-O-乙酰基-ADP-核糖）的产生。所有测定均在室温下在反应缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM DTT，0.05%BSA）中进行。将受试化合物（1μL的DMSO溶液）与SIRT1（5 nM）、SIRT2（10 nM）或SIRT3（5 nM）在反应缓冲液（50μL）中预孵育20分钟。为了测定IC50，在KM条件下（SIRT1为2μM，SIRT2为10μM，或SIRT3为2.2μM）加入Trp 5-mer肽，在KM下加入NAD（SIRT1、SIRT2和SIRT3分别为80μM、50μM和130μM），最终体积为100μL。30分钟后，用10μL终止缓冲液（50 mM烟酰胺在10%甲酸中）淬灭反应，得到最终浓度为0.9%甲酸和4.5 mM烟酰胺。为了准备分析的测定，将20μL反应体积混合在80μL 50:50乙腈/甲醇混合物中。在Agilent RapidFire 200高通量质谱系统（Agilent，Wakefield）上分析板，该系统耦合到装有负MRM模式的电喷雾电离源的AB Sciex API 4000质谱仪，监测低分辨率条件下母体/子离子的转变600.1/345.9。使用RapidFire Integrator软件集成峰值数据。

[1]. Discovery of thieno3,2-dpyrimidine-6-carboxamides as potent inhibitors of SIRT1, SIRT2, and SIRT3. J Med Chem. 2013 May 9;56(9):3666-79.

A novel class of potent SIRT1/2/3 pan-inhibitors was identified by utilizing Encoded Library Technology to enrich for molecules that interact with SIRT3. On the basis of the analysis of the ELT sequencing data, the selected cycle 3 building block (thieno[3,2-d]pyrimidine-6-carboxamide) was a preferred core scaffold which was critical for the chemotype inhibitory function. The initially prepared off-DNA library confirmed that compounds 11a–d were very potent pan SIRT1/2/3 inhibitors. Reduction of molecular weight, to improve physiochemical properties of 11c, resulted in the identification of the acetamide 20 as a good compromise of potency and reduced molecular weight. Further SAR showed that the thioacetyl 25, tert-butyl-amide 28, and sulfonamide 31 were particularly potent pan-inhibitors. To better understand binding interactions, three pan-inhibitors (11c, 28, and 31) were crystallized with SIRT3. The thieno[3,2-d]pyrimidine-6-carboxamide inhibitors bind in the active site cleft, in between the large Rossmann fold and the small zinc binding domain occupying the nicotinamide C-pocket in addition to the substrate channel. Comparisons with previously described SIRT3 structures revealed similar protein folding, except for the flexible loop region where Phe157 makes a π-stacking interaction with the thienopyrimidine core. The carboxamide on the inhibitors, which is essential for activity, makes key hydrogen bonding interactions with residues in the nicotinamide binding pocket, similar to carba-NAD+ and the recently described ternary complex of SIRT1/NAD+/43. The pan-inhibitor 11c and the truncated analogues 28 and 31 represent a significant advance over currently available sirtuin inhibitors. Their binding mode, corroborated by X-ray crystallographic data, is in good agreement with the observed SAR. The potency of this class of inhibitors makes them valuable tools for understanding the biological effects of modulating the deacetylase activity of SIRT1, SIRT2, and SIRT3. [1]

C7H4CLN3OS

213.64

1431411-18-5

Typically exists as solids at room temperature

ClC1C2=C(C=C(C(N)=O)S2)N=CN=1

4-chlorothieno[3,2-d]pyrimidine-6-carboxamide; 1431411-18-5; MFCD28098923; 4-chloro-Thieno[3,2-d]pyrimidine-6-carboxamide; CHEMBL2332049; SIRT-IN-6; SCHEMBL16011549; UGHXFHLQVJRWID-UHFFFAOYSA-N;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。