SIRT-IN-6   中文名称: 4-chloro-Thieno[3,2-d]pyrimidine-6-carboxamide

SIRT1 (IC50 >50 μM); SIRT2 (IC50 >50 μM); SIRT3 (IC50 >50 μM)

去乙酰化酶SIRT1、SIRT2和SIRT3是NAD（+）依赖性脱乙酰酶，被认为是代谢、炎症、肿瘤和神经退行性疾病的潜在靶点。编码文库技术（ELT）用于亲和筛选120万个富含DNA编码小分子杂环的文库，该文库鉴定出具有纳摩尔效力的SIRT1/2/3泛抑制剂（例如，11c:SIRT1、SIRT2和SIRT3的IC50分别为3.6、2.7和4.0 nM）。随后的SAR研究改善了理化性质，确定了强效的类药物类似物28和31。结合在SIRT3活性位点的11c、28和31的晶体学研究表明，常见的羧酰胺结合在烟酰胺C袋中，抑制剂的脂肪族部分延伸穿过底物通道，解释了可观察到的SAR。这些泛SIRT1/2/3抑制剂代表了一种新的化学型，比目前可用的抑制剂更有效，这使它们成为去乙酰化酶研究的宝贵工具[1]。

ELT亲和力选择[1]
在（1）无β-NAD/无肽底物、（2）100μMβ-NAD（Sigma）或（3）20μM TRSGK硫代乙酰基VMRRLLR存在下，通过在链霉抗生物素蛋白基质尖端捕获2μg Flag-hSIRT3（118-399）-SBP进行三轮选择。在没有SIRT3蛋白的情况下，同时进行缓冲液的无靶标对照选择。 在选择缓冲液中预洗链霉抗生物素蛋白尖端：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1%吐温-20、0.1 mg/mL剪切的鲑鱼精子DNA（sssDNA，Ambion）、0.1 mg/mL BSA和5 mMβ-巯基乙醇。在第一轮选择中，在（1）无β-NAD/无肽底物、（2）100μMβ-NAD或（3）20μM硫代乙酰化肽的存在下，将2μg Flag-hSIRT3（118-399）-SBP蛋白固定在预洗的尖端上。必要时，用含有相应辅因子和底物的缓冲液洗涤尖端两次。在室温下，在相应的辅因子和底物存在下，将合并的ELT文库（5 nmol）通过固定的SIRT3 1小时。用含有相应辅因子和底物的选择缓冲液洗涤尖端八次，用含有相应辅助因子和底物不含BSA的选择缓冲溶液洗涤尖端两次。通过在72°C下将不含辅因子和底物的BSA自由选择缓冲液通过尖端10分钟，对结合的分子进行热洗脱。通过将洗脱液通过链霉抗生物素蛋白尖端15分钟，对冷却的热洗脱进行两次后清除，以去除任何变性的SIRT3和基质粘合剂。将新鲜BSA和sssDNA添加到所有样品中，并根据需要将相应的辅因子和底物添加到洗脱液中。第2轮按照第1轮的描述进行，在相应的辅因子和底物存在下，使用链霉抗生物素蛋白尖端上新固定的SIRT3和后清除的第1轮输出。第3轮按照第1轮的描述进行，在相应的辅因子和底物存在的情况下，使用链霉抗生物素蛋白尖端上新固定的SIRT3和后清除的第2轮输出，但最后两次洗涤和洗脱是用不含BSA和sssDNA的选择缓冲液进行的，第3轮输出没有后清除。定量PCR用于量化每一轮选择的输出。使用Illumina测序平台对第3轮输出进行测序。

---

蛋白质克隆、表达和纯化[1]
将人SIRT3-（118-399）克隆到专有的修饰pET21b载体中。该蛋白在大肠杆菌BL21-Gold（DE3）细胞中表达为N端融合物，与具有整合TEV蛋白酶位点的六组氨酸亲和标签融合。在37°C下将单个菌落接种在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，并以250 rpm的速度旋转，直到A600达到0.3。然后将培养物冷却至18°C，以250 rpm的速度旋转，直到A600达到0.6-0.8。加入1-（2-异丙硫基）-β-d-吡喃半乳糖苷（IPGT）至终浓度为0.3 mM，在18°C下继续表达，并以160 rpm的速度旋转过夜。通过离心收集细胞，将沉淀物重新悬浮在裂解缓冲液（200 mM NaCl、5%甘油、5 mM 2-巯基乙醇和25 mM HEPES NaOH，pH 7.5）中，并超声处理以破碎细胞。通过在4°C下以10000g离心40分钟，将上清液与细胞碎片分离，并装载到Ni-NTA柱上，该柱用含有200 mM NaCl、5%甘油、5 mM 2-巯基乙醇、20 mM咪唑和25 mM HEPES NaOH的缓冲液平衡，pH 7.5。用5倍柱体积的缓冲液洗涤该柱，该缓冲液含有200 mM NaCl、5%甘油、5 mM 2-巯基乙醇、50 mM咪唑和25 mM HEPES NaOH，pH 7.5，然后用含有200 mM氯化钠、5%丙三醇、5 mM-2-巯基乙醇、250 mM咪唑和25mM HEPES NaOH的缓冲液洗脱，pH 7.5。洗脱的蛋白质在裂解缓冲液中透析，并在4°C下用TEV蛋白酶消化过夜，以去除N端His标签。将蛋白质装载在用裂解缓冲液平衡的第二个Ni-NTA柱上。用含有200 mM NaCl、5%甘油、5 mM 2-巯基乙醇、5 mM咪唑和25 mM HEPES NaOH（pH 7.5）的缓冲液洗脱未标记的蛋白质。纯化的蛋白质用含有200 mM NaCl、5 mM 2-巯基乙醇和20 mM Tris-HCl（pH 8.0）的缓冲液透析并浓缩。通过在S200柱上用透析缓冲液洗脱将蛋白质进一步纯化至95%的纯度，通过考马斯亮蓝R-250染色的SDS-PAGE分析进行评估，并在透析缓冲液中浓缩至10-15mg/mL。

---

SIRT1、SIRT2和SIRT3生化检测[1]
His-SIRT1（1-747）、His-SIRT2（1-389）和His-SIRT3（102-399）对Trp 5-mer肽（Ac-RHKKAcW-NH2）的脱乙酰化是通过非连续OAADPr质谱测定来测量的，该测定测量了OAADPr（2′-O-乙酰基-ADP-核糖）的产生。所有测定均在室温下在反应缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM DTT，0.05%BSA）中进行。将受试化合物（1μL的DMSO溶液）与SIRT1（5 nM）、SIRT2（10 nM）或SIRT3（5 nM）在反应缓冲液（50μL）中预孵育20分钟。为了测定IC50，在KM条件下（SIRT1为2μM，SIRT2为10μM，或SIRT3为2.2μM）加入Trp 5-mer肽，在KM下加入NAD（SIRT1、SIRT2和SIRT3分别为80μM、50μM和130μM），最终体积为100μL。30分钟后，用10μL终止缓冲液（50 mM烟酰胺在10%甲酸中）淬灭反应，得到最终浓度为0.9%甲酸和4.5 mM烟酰胺。为了准备分析的测定，将20μL反应体积混合在80μL 50:50乙腈/甲醇混合物中。在Agilent RapidFire 200高通量质谱系统（Agilent，Wakefield）上分析板，该系统耦合到装有负MRM模式的电喷雾电离源的AB Sciex API 4000质谱仪，监测低分辨率条件下母体/子离子的转变600.1/345.9。使用RapidFire Integrator软件集成峰值数据。

[1]. Discovery of thieno3,2-dpyrimidine-6-carboxamides as potent inhibitors of SIRT1, SIRT2, and SIRT3. J Med Chem. 2013 May 9;56(9):3666-79.

利用编码文库技术富集与SIRT3相互作用的分子，鉴定出一类新型高效的SIRT1/2/3泛抑制剂。基于ELT测序数据的分析，选定的环3结构单元（噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺）是该化学型抑制功能的关键核心骨架。初步构建的非DNA文库证实化合物11a-d是高效的SIRT1/2/3泛抑制剂。为了改善化合物11c的理化性质，降低了其分子量，最终筛选出乙酰胺20，该化合物在抑制活性和降低分子量方面取得了良好的平衡。进一步的构效关系研究表明，硫代乙酰基化合物25、叔丁基酰胺28和磺酰胺31是特别高效的泛抑制剂。为了更好地理解结合相互作用，我们结晶了三种泛抑制剂（11c、28 和 31）与 SIRT3 的复合物。噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-甲酰胺类抑制剂结合在活性位点裂隙中，位于大的 Rossmann 折叠和占据烟酰胺 C 口袋以及底物通道的小型锌结合域之间。与先前报道的 SIRT3 结构进行比较，发现其蛋白质折叠方式相似，但柔性环区除外，在该区域 Phe157 与噻吩并嘧啶核心形成 π-π 堆积相互作用。抑制剂上的甲酰胺基团对活性至关重要，它与烟酰胺结合口袋中的残基形成关键的氢键相互作用，类似于 carba-NAD+ 和最近报道的 SIRT1/NAD+/43 三元复合物。泛抑制剂 11c 及其截短类似物 28 和 31 代表了目前可用的 sirtuin 抑制剂的显著进步。X 射线晶体学数据证实了它们的结合模式，这与观察到的构效关系 (SAR) 非常吻合。这类抑制剂的高效性使其成为理解调节 SIRT1、SIRT2 和 SIRT3 脱乙酰酶活性所产生的生物学效应的宝贵工具。[1]

C7H4CLN3OS

213.64

1431411-18-5

Typically exists as solids at room temperature

1.6±0.1 g/cm3

479.6±40.0 °C at 760 mmHg

243.9±27.3 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.74

1.06

ClC1C2=C(C=C(C(N)=O)S2)N=CN=1

4-chlorothieno[3,2-d]pyrimidine-6-carboxamide; 1431411-18-5; MFCD28098923; 4-chloro-Thieno[3,2-d]pyrimidine-6-carboxamide; CHEMBL2332049; SIRT-IN-6; SCHEMBL16011549; UGHXFHLQVJRWID-UHFFFAOYSA-N;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。