11-HETE   中文名称: （+/-）11 hete

Cytochrome P450

（R）和（S）11-HETE均诱导RL-14细胞中的细胞肥大标志物和细胞表面积。两种对映体在mRNA和蛋白质水平上均显著上调CYP1B1、CYP1A1、CYP4F2和CYP4A11，但S-对映体的作用更为明显。此外，11（S）-HETE增加了CYP2J和CYP4F2的mRNA和蛋白质水平，而11（R）-HETE仅增加了CYP4F2。只有11（S）-HETE显著增加了重组人CYP1B1中CYP1B1的催化活性，表明以对映选择性方式进行变构激活。
结论：我们的研究提供了第一个证据，表明11-HETE可以通过增加CYP1B1 mRNA、蛋白质和活性水平诱导RL-14细胞肥大。[1]

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（R）和（S）11-HETE对细胞存活率的影响[1]
MTT法用于评估所用11-HETE浓度的细胞毒性。RL-14细胞用2.5、5、10和20μM的（R）和（S）11-HETE处理24小时。与对照组（数据未显示）相比，所有测试的浓度都没有显著改变细胞存活率（以90%以上的存活率表示）。因此，我们在所有后续实验中都使用了20μM的浓度。

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11-HETE对映体对RL-14细胞肥大标志物的影响[1]
为了评估11-HETE对映体诱导细胞肥大的潜在作用，RL-14细胞用20μM的11（R）-HETE或11（S）-HETE处理24小时。此后，使用RT-PCR测量心脏肥大标志物如心钠素（ANP）、α-肌球蛋白重链（α-MHC）、β-MHC、骨骼α-肌动蛋白（ACTA-1）和脑利钠肽（BNP）的表达。图1显示，11（S）-HETE显著增加了心脏肥大标志物：ANP、β-MHC和β/α-MHC，分别增加了231%、499%和107%。11（R）-HETE显著增加了心肌肥厚标志物；β/α-MHC增加132%。此外，与对照组相比，11（R）-HETE治疗组的ACTA-1基因表达增加了46%，11（S）-HETE治疗组的表达显著增加了282%（图1）。与11（R）HETE治疗组相比，11（S）组的β-MHC和ACTA-1基因表达均显著增加。
已经证实，肥大标志物的增加与细胞表面积的增加有关。如图2所示，我们的结果表明，与对照组相比，用20μM的（R）或（S）-11 HETE处理RL-14细胞，细胞表面积分别显著增加了29%和34%。

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11-HETE对映体对RL-14细胞CYP mRNA基因表达的影响 为了检测11-HETE对映体对CYP酶的影响，RL-14细胞用20μM（R）或（S）11-HETE处理24小时。此后，使用RT-PCR测定CYP1B1、CYP1A1、CYP4A11、CYP4F11、CYP4F2、CYP2J2、CYP2E1和CYP2C8 mRNA。与对照组相比，用11（R）-HETE处理的细胞中CYP1B1、CYP1A1、CYP4A11、CYP4F11和CYP4F2 mRNA分别显著增加了116%、112%、70%、238%和167%。同样，与对照组相比，11（S）-HETE治疗组的相同酶的基因表达分别显著增加了142%、109%、90%、416%和257%（图3）。尽管与对照组相比，（R）和（S）对映体分别显著增加了CYP2E1 mRNA基因表达146%和163%，但只有11（S）-HETE使CYP2J2 mRNA基因表达增加了47%。

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11-HETE对映体对RL-14细胞中CYP酶蛋白水平的影响[1]
评估感兴趣的CYP酶的蛋白质水平至关重要，因为就蛋白质表达而言，mRNA表达可能与这些酶的水平不一致。与对照组相比，用11（S-）HETE处理的细胞中CYP1B1、CYP4F2和CYP4A11的蛋白质水平分别显著增加了186%、153%和152%。虽然11（R）-HETE处理的细胞对蛋白质水平的影响程度不同，但与对照组相比，它显著提高了CYP1B1、CYP4F2和CYP4A11的蛋白质水平，分别提高了156%、126%和141%（图4）。
有趣的是，与对照组相比，用11种（S-HETE）对映体处理的细胞中CYP2J蛋白水平显著增加了135%。关于CYP2C8，两种对映体的蛋白质水平增加并不显著（图4）。两种对映体的CYP4F11基因表达都有所增加，但CYP4F11-蛋白水平低于检测限值。

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11-HETE对映体对重组人CYP1B1酶活性的影响 使用rhCYP1B1介导的EROD评估11-HETE的R和S对映体对rhCYP1B2催化活性的直接影响。图5A、C显示了rhCYP1B1与不同浓度的7-ER与11-HETE的S或R对映异构体共孵育时，间苯二酚形成率（V）。11（S）-HETE导致CYP1B1活性的变构激活，导致Vmax值与对照组相比浓度依赖性增加，分别为0.5、2.5、10和40 nM的11（S”-HETE的1.03、1.1、1.5和1.4倍（表2）；而11（R）-HETE不影响Vmax（表2）。rhCYP1B1的7-ER水解的Km值不受11-HETE的R或S对映体的影响；因此，在Michaelis-Menten模型拟合中假设共享Km值，估计为131.3 nM。双倒数（Lineweaver-Burk）图显示了11-HETE的S和R对映异构体的截断线，就变构相互作用而言，这意味着Vmax的变化对Km没有实质性影响（图5B、D）。

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11-HETE对映体对人肝微粒体CYP1B1活性的影响 为了进一步证实从rhCYP1B1获得的结果，我们在人肝微粒体中使用EROD测定法测试了11-HETE对映体对CYP1B1催化活性的可能影响。我们使用固定浓度的底物和不同浓度的11（R）或11（S）HETE（0、10、20、40和100 nM）。如图6所示，结果表明，与对照组相比，用浓度增加的11（S）-HETE孵育人肝微粒体与EROD形成率的浓度依赖性增加有关。11（S）-HETE的作用强于11（R）-HETE。与对照组相比，10、20、40和100 nM的11（S）HETE的催化EROD活性分别显著增加到107%、119%、136%和183%。同样，40和100 nM 11（R）-HETE的浓度分别显著增加到87%和145%（图6）。

11-HETE对映体对人重组CYP1B1酶活性的影响 使用乙氧基间苯二酚-O-脱乙基酶（EROD）测定了重组人CYP1B1催化7-乙氧基间间苯二酚O-脱烷基的速率。在（R）或（S）11-HETE存在或不存在的情况下进行测量。使用白色96孔微孔板进行测定。将不同浓度的7-ER（7-乙氧基间苯二酚；终浓度为0、5、10、20、40和100 nM）与含有100 mM磷酸钾（pH 7.4）缓冲液的反应混合物一起孵育，该缓冲液补充了5 mM六水合氯化镁和1 pmol人重组CYP1B1酶。之后，向反应混合物中加入不同浓度（终浓度为0、0.5、2.5、10和40nM）的（R）或（S）11-HETE。然后将100μL该反应混合物加入96孔板的每个孔中，然后加入100μL NADPH（2mM）以开始反应。通过BioTek Synergy H1 Hybrid Reader每分钟测量一次与间苯二酚形成相关的板的荧光读数，持续30分钟。分别用550/585 nm的激发/发射波长记录信号。制备了间苯二酚标准曲线，并用于计算形成的间苯二酚的量。绘制了每种浓度的11-HETE的间苯二酚形成速率与7-ER浓度的关系图。

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11-HETE对映体对人肝微粒体细胞色素P450酶活性的影响 与人肝微粒体一起孵育，以测试（R）或（S）11-HETE对调节CYP1B1酶的酶活性的影响。将来自25个不同个体的人肝微粒体（0.1mg/mL）与不同浓度的（R）或（S）11-HETE（0、10、20、40和100nM）一起孵育。在反应中使用2μM的EROD作为底物，该底物还含有补充有5mM六水合氯化镁的100mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）。将100μL反应混合物加入96孔聚苯乙烯微孔板的孔中。为了开始反应，向每个孔中的反应混合物中加入100μL的1 mM NADPH。使用BioTek Synergy H1混合阅读器分别在37°C、550/585 nm激发/发射波长下每分钟测量一次因间苯二酚形成而产生的荧光信号，持续30分钟。

化学处理[1]
对照组的细胞用载体[含0.5%二甲亚砜（DMSO）的无血清DMEM/F-12]处理。其他组通过向无血清培养基（SFM）中加入20μM（R）或（S）11-HETE处理24小时。（R）和（S）11-HETE均作为DMSO储备溶液供应，并在-20°C下储存直至使用。在所有进行的实验中，治疗组的DMSO浓度不超过0.5%。

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细胞活力的测量[1]
细胞活力测试是通过使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2H-溴化四唑（MTT）测定法来确定的，该测定法测量活细胞将黄色四唑盐还原为其不溶于水的紫色甲酰胺晶体的能力。甲赞晶体的光密度反映了活细胞的数量。在37°C温度和5%CO2加湿条件下，将细胞镀在48孔板中，直至达到足够的融合。然后用2.5、5、10和20μM的（R）或（S）11-HETE处理细胞24小时。丢弃含有处理的培养基，加入溶解在SFM中的100μL MTT试剂（1.2 mM），并在37°C下与细胞一起孵育。孵育2小时后，丢弃培养基，加入200μL DMSO以溶解形成的甲酰胺晶体。Synergy™H1混合多模读取器用于测量570 nm波长下的颜色强度。

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细胞表面积的测量[1]
将RL-14细胞铺在6孔板中，用20μM的（R）或（S）11-HETE处理24小时。之后，用1x PBS（pH 7.4）洗涤细胞3次，并在4°C下用4%多聚甲醛固定15分钟。然后加入10μg/ml的麦胚凝集素Alexa Fluor 488偶联物，在暗处孵育2小时。使用振荡器再次用1x PBS（pH 7.4）洗涤板3次，每次5分钟。此后，将带有染色细胞的盖玻片放在带有DAPI的ProLong抗真菌试剂的载玻片上。然后，如前所述（Alammari等人，2023），使用×20物镜通过倒置显微镜对载玻片进行成像，并使用蔡司AxioVision软件测量表面积。每组65个单独的细胞被纳入分析。

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RNA提取和cDNA合成[1]
根据之前描述的方法（Shoieb和El Kadi，2020），对（R）和（S）11-HETE处理的RL-14细胞进行RNA提取和cDNA合成。简而言之，将细胞铺在12孔板上，用20μM（R）和（S）11-HETE处理24小时。此后，用TRIzol试剂分离总RNA，并通过测量260nm处的吸光度来确定浓度。通过测量260/280比值（>1.8）来确定RNA纯度。根据制造商的说明，通过将1.25µg从每个样品中分离的总RNA与高容量cDNA逆转录试剂（Applied Biosystems）混合，进行第一条cDNA链。最后，将反应混合物插入热循环器中，并经历以下条件：25°C 10分钟，37°C 120分钟，85°C 5分钟，最后冷却至4°C。

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RL-14细胞的蛋白质提取和蛋白质印迹分析[1]
如Shoieb和El Kadi（2020）先前所述，从细胞中提取蛋白质并进行蛋白质印迹分析。简而言之，Rl-14细胞在6孔板中生长，并与20μM（R）或（S）11-HETE一起孵育24小时。此后，使用100μL从含有50 mM HEPES、1.5 mM氯化镁、0.5 M氯化钠、10%（v/v）甘油、1 mM EDTA、1%Triton X-100和5μL/ml蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中收集细胞裂解物。随后，使用牛血清白蛋白作为参考标准进行Lowry测定以确定蛋白质的浓度（Lowry等人，1951）。
通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离100μg总细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并在4°C下与所需蛋白质的特异性一抗一起孵育过夜。然后在室温下，将膜与二抗（抗兔IgG-HRP连接的二抗或抗小鼠IgG-HRP链接的二抗）在封闭溶液中孵育45分钟。

[1]. 11-Hydroxyeicosatetraenoics induces cellular hypertrophy in an enantioselective manner. Front Pharmacol. 2024 Aug 12;15:1438567.

Background: R/S enantiomers of 11-hydroxyeicosatertraenoic acid (11-HETE) are formed from arachidonic acid by enzymatic and non-enzymatic pathways. 11-HETE is predominately formed by the cytochrome P450 1B1 (CYP1B1). The role of CYP1B1 in the development of cardiovascular diseases is well established.
Objectives: This study aimed to assess the cellular hypertrophic effect of 11-HETE enantiomers in human RL-14 cardiomyocyte cell line and to examine their association with CYP1B1 levels.
Methods: Human fetal ventricular cardiomyocyte, RL-14 cells, were treated with 20 µM (R) or (S) 11-HETE for 24 h. Thereafter, cellular hypertrophic markers and cell size were then determined using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) and phase-contrast imaging, respectively. The mRNA and protein levels of selected CYPs were determined using RT-PCR and Western blot, respectively. In addition, we examined the effect of (R) and (S) 11-HETE on CYP1B1 catalytic activity using human recombinant CYP1B1 and human liver microsomes. [1]

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To our knowledge this is the first study to investigate the cellular hypertrophic effect of 11-HETE enantiomers in RL-14 cells and the mechanisms involved. Both R and S enantiomers of the midchain 11-HETE could induce cellular hypertrophy in RL-14 cells. They significantly increased several hypertrophic markers as well as the protein level and the gene expression of various CYP enzymes. The S- enantiomer allosterically activates human recombinant CYP1B1 and both enantiomers significantly increased the EROD activity in human liver microsomes. The investigation of the role of high 11-HETE concentration in various cardiovascular diseases should be expanded, and strategies to inhibit its effect could be tested as potential therapeutic strategies. [1]

C20H32O3

320.47

320.235

C, 74.96; H, 10.07; O, 14.98

73804-65-6

14123410

Typically exists as solids at room temperature

1.0±0.1 g/cm3

487.7±33.0 °C at 760 mmHg

262.8±21.9 °C

0.0±2.8 mmHg at 25°C

1.514

5.45

57.53

2

3

14

23

392

0

CCCCCC=CC=CC(CC=CCC=CCCCC(=O)O)O

11-Hydroxy-5,8,12,14-eicosatetraenoic acid; 11-hydroxyicosa-5,8,12,14-tetraenoic acid; 73804-65-6; (?)11-HETE; 54886-50-9; ( inverted exclamation markA)11-HETE; 11(R)-hydroxy-5(Z),8(Z),12(E),14(Z)-eicosatetraenoic acid; SCHEMBL1479341; DTXSID40868247;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。