| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| 1g |
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| 5g |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
This compound functions strictly as a linker scaffold and does not directly bind any therapeutic target; its role is to connect an E3 ubiquitin ligase ligand to a target protein-binding warhead in PROTAC design. The pent-4-ynoate chain (C4) provides a very short spacer (approximately 5-6 Angstrom extended) with a terminal alkyne for copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The tert-butyl ester can be hydrolyzed under acidic conditions to reveal a free carboxylic acid for amide coupling with amine-containing ligands. The tert-butyl ester is stable under CuAAC conditions (which typically use copper and reducing agents in aqueous mixtures), allowing orthogonal stepwise conjugation: the alkyne can be reacted with an azide-functionalized ligand first, then the tert-butyl ester can be hydrolyzed and coupled to the second ligand. Alternatively, the order can be reversed: hydrolyze the tert-butyl ester to the carboxylic acid, couple to one ligand via amide bond formation, then perform CuAAC with the alkyne to attach the second ligand. The short C4 spacer is among the shortest PROTAC linkers available and is suitable only for target-E3 ligase pairs where the distance between binding pockets is extremely short. For most target-ligase pairs, longer linkers (C6-C12) are required to span the distance for productive ternary complex formation.
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| 体外研究 (In Vitro) |
PROTAC包含两个不同的配体，它们通过一个连接子连接：一个是E1088泛素连接酶的配体，另一个是靶蛋白的配体。PROTAC利用细胞内的泛素-蛋白酶体系统选择性地降解靶蛋白。
体外实验表明，叔丁基戊-4-炔酸酯本身不具有生物活性；其功能只有在整合到完整的PROTAC分子中才能实现。对含有该连接基的PROTAC进行表征的方法是，用PROTAC处理表达靶标的细胞系，并通过Western blot定量分析靶蛋白的降解情况。对于许多PROTAC应用而言，较短的C4链可能并非最佳选择；如果连接基过短，无法跨越靶蛋白和E3连接酶上两个结合口袋之间的距离，则无法形成三元复合物，也不会发生降解。然而，对于某些结合位点紧密相邻的靶标-连接酶对，极短的连接基也可能有效。CuAAC反应生成1,4-二取代的1,2,3-三唑环，该环为连接基增加了一个芳香杂环，并使其长度增加约2-3埃。该三唑环代谢稳定，可以参与π-π堆积相互作用。叔丁酯在碱性和中性条件下稳定，但在酸性条件下（例如，TFA/DCM、4M HCl 的二氧六环溶液）或碱性水解（LiOH 的 THF/MeOH/H2O 溶液）下会发生裂解，如果需要更温和的反应条件。叔丁酯可为炔烃提供正交保护，从而实现逐步共轭，避免保护基的干扰。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
在体内，连接子本身不具有药理活性；所有体内效应均来源于包含该连接子的完整PROTAC。完整的PROTAC在异种移植小鼠模型中用于评估靶点敲低和肿瘤生长抑制效果。如果三元复合物的几何结构不利，极短的C4连接子可能会限制体内疗效。对于使用该连接子的PROTAC，由于其长度较短，可能需要将两个配体彼此非常靠近，而这可能仅适用于少数靶点-连接酶对。CuAAC过程中形成的三唑环高度稳定且不易代谢。叔丁酯在PROTAC合成过程中水解（生成羧酸），然后转化为稳定的酰胺键，因此最终的PROTAC中不存在酯基；因此，无需担心体内酯酶介导的水解。形成的酰胺键在生理条件下不易水解。对于最终的 PROTAC，由于三唑环的存在，短而刚性的连接基与长度相似的纯烷基链相比，其柔性可能降低。如果几何形状正确，则可增强降解效力；如果几何形状不匹配，则可消除降解效力。
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| 酶活实验 |
标准连接基团的表征涉及正交共轭策略。方案 1（先进行 CuAAC 反应，然后进行酯水解和酰胺偶联）：步骤 A（CuAAC）：将叔丁基戊-4-炔酸酯和叠氮官能化配体（1.0-1.2 当量）溶解于叔丁醇/水或 DMF/水的混合溶剂中。加入 CuSO4·5H2O（0.1 当量）、抗坏血酸钠（0.2 当量）和稳定铜配体，例如 TBTA 或 THPTA（0.1-0.2 当量）。在室温或 40℃ 下搅拌 2-12 小时。该反应生成一个 1,4-二取代的 1,2,3-三唑环，该环将炔烃与叠氮基团连接起来。步骤 B（酯水解）：将步骤 A 的产物溶于 THF/MeOH/H2O (3:1:1) 混合溶剂中，加入 5-10 当量的 LiOH 或 NaOH。室温搅拌 2-6 小时。用 1M HCl 酸化至 pH 2-3，用 DCM 或乙酸乙酯萃取，用 Na2SO4 干燥，浓缩得到游离羧酸。步骤 C（酰胺偶联）：将游离羧酸和含胺配体（1.0-1.2 当量）溶于 DMF 中。加入 HATU（1.2-1.5 当量）或 EDCI/HOBt，以及 DIEA（2-3 当量）。室温搅拌 2-12 小时。通过快速柱色谱法（硅胶，DCM/MeOH 梯度洗脱）或制备型反相 HPLC（C18 柱，含 0.1% TFA 的乙腈/水）纯化。方案二（先进行酯水解和酰胺偶联，再进行CuAAC）：步骤A：如上所述水解叔丁酯，得到戊-4-炔酸。步骤B：在室温下，使用HATU/DIEA或EDCI/HOBt作为催化剂，在DMF中将戊-4-炔酸与含胺配体（1.0-1.2当量）进行酰胺偶联反应2-12小时。产物为末端炔烃的酰胺。步骤C：如上所述，将末端炔烃与叠氮官能化的配体进行CuAAC反应。每一步反应后均需纯化。 1H NMR表征：叔丁酯 δ 1.45 ppm（单峰，9H），CH2 基团 δ 2.2-2.5 ppm（多重峰，CH2C≡CH 和 CH2CO），末端炔烃 CH δ 1.95-2.05 ppm（单峰）。CuAAC 反应后，末端炔烃质子消失，三唑质子出现在 δ 7.8-8.0 ppm（单峰）。酯水解后，叔丁基峰消失，羧酸质子出现（宽峰，δ 11-12 ppm）。酰胺偶联后，酰胺 NH 出现（宽峰，δ 7.5-8.5 ppm）。ESI-MS：母体 [M+H]+ m/z 155.2 (C9H14O2，MW 154.21)。水解后（戊-4-炔酸），[MH]- m/z 97.1；CuAAC 后，分子量增加叠氮配体的质量减去 N2 的质量，再加上三唑环的质量。
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| 细胞实验 |
基于叔丁基戊-4-炔酸酯构建的PROTAC的细胞评估遵循标准流程。靶标表达细胞（例如HEK293T、HeLa、HCT116、MCF-7或疾病相关细胞系）在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM或RPMI1640培养基中培养，置于37℃、5% CO2的加湿培养箱中。细胞以每孔2-5 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，并过夜培养使其贴壁。PROTAC的DMSO储备液（10 mM）用培养基进行系列稀释，最终浓度范围为0.01 nM至10 uM，DMSO的最终浓度保持在≤0.1%。将含有 PROTAC 的培养基加入细胞中，根据靶蛋白降解动力学，分别孵育 4、8、16 或 24 小时。收集细胞时，吸出培养基，用冰冷的磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤细胞两次。将细胞裂解于新鲜配制的 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP-40、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS）中，该缓冲液中添加了蛋白酶抑制剂混合物（例如，1 mM PMSF、1 ug/mL 亮抑蛋白酶肽、1 ug/mL 抑蛋白酶）和磷酸酶抑制剂（1 mM 原钒酸钠、10 mM 氟化钠、10 mM β-甘油磷酸钠）。裂解在冰上进行20-30分钟，期间不时涡旋振荡。裂解液在4℃下以14,000 × g离心15分钟进行澄清。使用BCA法测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白（BSA）为标准。对于Western blot分析，将等量的蛋白质（每泳道20-50 ug）与含有β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）的Laemmli上样缓冲液混合，在95℃加热5-10分钟，然后使用4-12%梯度或10%聚丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。分离后的蛋白质使用湿式或半干式转印装置电转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素膜（0.45 um孔径）。将膜用 5% 脱脂奶粉或 3% 牛血清白蛋白 (BSA) 的 TBST（含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐溶液）封闭 1 小时（室温）。将靶蛋白特异性的一抗（用封闭缓冲液稀释 1:500 至 1:2000）与膜在 4℃ 下轻柔摇晃孵育过夜。用 TBST 洗涤膜 3 次（每次 10 分钟），然后与辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗（用封闭缓冲液稀释 1:2000 至 1:5000）在室温下孵育 1 小时。再次用 TBST 洗涤 3 次后，使用增强化学发光 (ECL) 底物显色，并用化学发光成像系统检测蛋白条带。使用 ImageJ 或类似软件进行密度分析，并使用 GraphPad Prism 中的四参数逻辑方程进行非线性回归分析计算 DC50 值。阴性对照包括：溶剂对照（仅含 DMSO）和仅含接头的对照，其中接头仅与一种配体（E3 连接酶配体或靶配体）偶联，而非同时与两者偶联。为验证蛋白酶体依赖性降解，用 10 uM MG132 处理 4-6 小时应能阻断 PROTAC 诱导的降解。
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| 动物实验 |
动物实验采用由叔丁基戊-4-炔酸酯构建的最终PROTAC进行。实验使用携带皮下异种移植瘤（通过将5 × 10^6个细胞悬浮于100 μL PBS/Matrigel 1:1混合液中，注射到小鼠右侧腹部建立）的雌性无胸腺裸鼠或NSG小鼠（6-8周龄，体重18-22 g）。当肿瘤体积达到100-200 mm3时（通常在接种后7-14天），将动物随机分组（每组n=6-10）。PROTAC每日新鲜配制：典型溶剂包括：（1）10% DMSO、40% PEG400、50%生理盐水；（2）5% DMSO、40%羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）、55%水； (3) 10% 乙醇、30% PEG300、60% 水。给药途径：腹腔注射（最常用）、静脉注射（尾静脉，IV）或灌胃。给药方案：每日一次 (QD) 或隔日一次 (Q2D)，持续 14-28 天。典型剂量范围：1-30 mg/kg 体重，根据初步耐受性研究进行调整。赋形剂对照组仅接受不含 PROTAC 的制剂。每 2-3 天使用数字游标卡尺测量肿瘤体积：体积 = (长 × 宽²)/2。每日记录体重；体重较基线下降超过 20% 的动物将被安乐死。在研究终点（对照组肿瘤达到约 1500 mm³ 或完成给药期后），切除肿瘤，称重并分割：一部分用液氮速冻，用于免疫印迹分析；一部分组织用10%中性缓冲福尔马林固定，用于免疫组化（IHC）。血液通过心脏穿刺或眼眶后静脉丛取血，收集到EDTA抗凝管中，在4℃下以1000×g离心10分钟，血浆储存于-80℃，用于PK LC-MS/MS分析。肿瘤裂解液进行靶蛋白免疫印迹分析；福尔马林固定石蜡包埋切片（4-5 μm）的IHC步骤包括脱蜡、抗原修复、封闭、一抗孵育、HRP标记的二抗检测、DAB显色和苏木精复染。
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| 药代性质 (ADME/PK) |
目前尚无叔丁基戊-4-炔酸酯作为分离化合物的药代动力学数据；所有药代动力学性质均由最终的PROTAC确定。对于含有短C4连接基和三唑环（由CuAAC反应生成）的PROTAC，适用以下概括。短烷基部分（三唑环和酰胺键之间仅有三个亚甲基）太短，无法发生显著的CYP介导的ω-羟基化，因为末端甲基未暴露；相反，三唑环和酰胺键是连接基结构的主要组成部分。三唑环高度稳定，不易代谢。酰胺键（酯水解后羧酸与配体结合）在生理条件下不易水解。连接基的总长度（C4加三唑环）非常短，约为7-9埃。对于该连接子能够成功诱导降解的PROTAC，其较短的长度可能迫使两个配体非常接近，而这种接近程度可能仅对少数靶标-连接酶对最为理想。对于最终的PROTAC，小鼠静脉注射1 mg/kg后的典型药代动力学参数为：半衰期(t1/2) 2-6小时，清除率(CL) 10-30 mL/min/kg，分布容积(Vd) 1-2 L/kg。口服10 mg/kg后的药代动力学参数为：Cmax 0.1-0.5 μM，Tmax 1-2小时，口服生物利用度5-25%。高分子量PROTAC的血浆蛋白结合率通常>95%。在人肝微粒体中的代谢稳定性为：t1/2 30-60分钟，CLint 10-50 μL/min/mg蛋白。 CYP 分析表明 CYP3A4 是负责代谢连接配体的主要同工酶，但短连接子本身并不是重要的代谢位点。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
目前尚无叔丁基戊-4-炔酸酯作为分离化合物的正式毒性数据。供应商提供的标准化学品安全信息显示，该化合物为无色至淡黄色液体，纯度通常为95-98%。GHS危险说明：H302（吞咽有害），H315（造成皮肤刺激），H319（造成严重眼刺激），H335（可能造成呼吸道刺激）。预防措施说明：P261（避免吸入粉尘/烟雾/气体/喷雾），P280（佩戴防护手套/防护服/护目镜/面罩），P301+P310（如吞咽：立即致电中毒控制中心或就医），P305+P351+P338（如进入眼睛：用水小心冲洗几分钟；如有佩戴隐形眼镜且易于取出，请取出；继续冲洗）。注意事项：佩戴防护手套、防护服和眼/面部防护用品；避免吸入粉尘/烟雾/气体/雾/蒸汽/喷雾；仅在室外或通风良好的区域使用；操作后彻底洗手；储存于阴凉干燥处，置于密封容器中，避光防潮。如接触皮肤，请用大量肥皂和清水清洗；如接触眼睛，请用清水小心冲洗几分钟，如有佩戴隐形眼镜，请取出；如吞咽，请漱口并就医；如吸入，请将患者移至空气新鲜处。对于含有该连接子的最终PROTAC分子，动物模型毒性评估包括每日监测临床症状（嗜睡、弓背、竖毛、腹泻、呼吸困难）和体重变化。血清化学分析：检测丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 和天冬氨酸氨基转移酶 (AST) 以评估肝毒性；检测血尿素氮 (BUN) 和肌酐以评估肾毒性。肌酸磷酸激酶 (CPK) 用于评估肌肉损伤。血液学检查：全血细胞计数 (CBC)，包括白细胞分类计数、血小板计数、血红蛋白和血细胞比容。组织病理学检查：对主要器官（包括肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏和肠道）进行苏木精-伊红 (H&E) 染色。最大耐受剂量 (MTD) 通过剂量递增研究确定。脱靶降解必需蛋白是 PROTAC 类药物特有的毒性风险；通过基于质谱的蛋白质组学方法评估，以识别非预期降解靶点。该化合物尚未进入临床试验，也未获得任何治疗适应症的监管批准；所有用途均严格限于 PROTAC 开发和药物发现的研究目的。
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| 分子式 |
C9H14O2
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|---|---|
| 分子量 |
154.21
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| 精确质量 |
154.099
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| CAS号 |
185986-76-9
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| PubChem CID |
10877341
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| 外观&性状 |
Colorless to light yellow liquid
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| tPSA |
26.3
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| 氢键供体(HBD)数目 |
0
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| 可旋转键数目(RBC) |
4
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| 重原子数目 |
11
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| 分子复杂度/Complexity |
177
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
CC(C)(C)OC(=O)CCC#C
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| InChi Key |
GRWJMJVACAWLAO-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C9H14O2/c1-5-6-7-8(10)11-9(2,3)4/h1H,6-7H2,2-4H3
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| 化学名 |
tert-butyl pent-4-ynoate
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 6.4847 mL | 32.4233 mL | 64.8466 mL | |
| 5 mM | 1.2969 mL | 6.4847 mL | 12.9693 mL | |
| 10 mM | 0.6485 mL | 3.2423 mL | 6.4847 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
1-(Azetidin-3-yl)piperidine
1-(Piperidin-4-ylmethyl)piperidine
Adamantan-C-amide-PEG2-C2-amine
4-(4-Boc-piperazinemethyl)phenylboronic acid pinacol ester
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