Cyclophilin A (CypA) - binding affinity (KD): 108 ± 12 nM (measured by SPR). [1]
N-truncated Cyclophilin B (CypB) - binding affinity (KD): 320 ± 40 nM (measured by SPR). [1]
The primary target is cyclophilin A (CypA), a peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase (PPIase) involved in protein folding, inflammation, and viral replication. CypA is also a host factor required for HIV‑1 and HCV replication. RJS308 TFA targets CypA for ubiquitination by recruiting the VHL E3 ligase complex, leading to proteasomal degradation. The compound itself does not inhibit CypA's enzymatic activity but rather eliminates the protein. Secondary, it engages the VHL protein (substrate recognition subunit of the E3 ligase), but this is a mechanism‑based interaction. Therefore, the degradation target is CypA, and the E3 ligase is the recruitment target. No off‑target degradation has been reported for the active enantiomer, but the TFA salt form does not alter target specificity.

环孢亲和素A (CypA) - 结合亲和力 (KD)：108 ± 12 nM（通过表面等离子共振法测定）。[1]
N端截短的环孢亲和素B (CypB) - 结合亲和力 (KD)：320 ± 40 nM（通过表面等离子共振法测定）。[1]

---

体外实验表明，RJS308 TFA 能在无细胞体系中高效且选择性地降解 CypA。由于降解需要完整的泛素-蛋白酶体系统（仅存在于活细胞中），因此无细胞降解实验并不常见。然而，在无细胞结合实验中，已证实 CypA、RJS308 TFA 和 VHL 之间能形成三元复合物。利用表面等离子共振 (SPR) 技术，该化合物能促进 CypA 与 VCB（VHL-Elongin B-Elongin C 复合物）的结合，其亲和力 (KD) 约为 120 nM。通过蛋白质印迹法测得，该化合物在细胞内对 CypA 降解的 DC₅0 为 284 nM。浓度高达 10 uM 时，该化合物对其他亲环蛋白（例如 CypB）没有显著影响，表明其具有选择性。在 HIV-1 感染细胞中，RJS308 TFA 抑制病毒复制，EC₅0 为 0.5 uM。

RJS308 TFA 的体内活性已在多发性骨髓瘤（MM.1S 细胞）小鼠异种移植模型中进行了评估。以 30 mg/kg 的剂量（腹腔注射，每日一次）连续给药 21 天，与对照组相比，肿瘤生长抑制率达 70%。药效学分析显示，单次给药 6 小时后，肿瘤中 CypA 蛋白含量降低超过 80%。在 HIV-1 感染小鼠模型（人源化小鼠）中，RJS308 TFA（20 mg/kg，腹腔注射，每日一次）在 14 天后使血浆病毒载量降低了 1.5 log。未观察到急性毒性。该化合物还能降低脾脏和淋巴结中的 CypA 水平。这些数据证实，CypA 降解可在体内实现，并具有抗病毒和抗肿瘤作用。

表面等离子共振 (SPR) 检测 CypA 和 CypB：使用 Biacore T200 系统评估了 RJS308 对环孢亲和素 A (CypA) 和 B (CypB) 的亲和力。将重组全长人 CypA 或市售 N 端截短的 CypB (D34-A212) 通过胺基偶联连接到 CM5 传感器芯片上。以 30 µL/min 的流速将 PROTAC 注入芯片表面 120 秒，然后静置解离 600 秒或 500 秒。绘制平衡响应与浓度的关系图，并通过非线性回归分析获得结合亲和力 (KD)。RJS308 对 CypA 的 KD 为 108 ± 12 nM，对 N 端截短的 CypB 的 KD 为 320 ± 40 nM。 [1]
- 针对 VCB 的表面等离子共振 (SPR) 实验：SPR 实验在 Biacore 8K 仪器上进行。生物素标记的 Avi 标签 VCB（VHL/elongin C/elongin B）固定在预先包被链霉亲和素的 SPR 传感器芯片上。将 RJS308（浓度范围 3.33-1000 nM）注入到固定化的靶标上。对于三元复合物的测量，在注入阶段加入饱和浓度的 CypA 或 CypB (1 µM) 进行实验。使用 1:1 相互作用模型分析传感器图。在 CypA 存在下，RJS308 的 Rmax 值显著增加，表明 PROTAC 诱导了三元复合物的形成。 [1]
- 尺寸排阻色谱 (SEC)：使用配备 Superdex S75 10/300 GL 色谱柱的 AKTA Pure 系统，并用 HEPES、NaCl 和 TCEP 缓冲液平衡，评估 RJS308 诱导三元复合物形成的能力。将重组 VCB、RJS308 和 CypA 按 1:1:1.4 的比例混合，并在柱运行前于冰上孵育 1 小时。观察到峰位移，表明 RJS308 形成了三元复合物。[1]
- 荧光偏振 (FP)：通过 FP 置换实验评估 RJS308 与 VHL 的结合能力。将 FAM 标记的 HIF-1α 肽（JC9，10 nM）、VCB 蛋白（15 nM）和浓度递减的 RJS308 在 384 孔板中孵育。在 485 nm 激发/发射波长和 520 nm 处测量荧光强度。利用测得的 IC50 值反算抑制常数 (KD)，结果表明 VCB 和 RJS308 之间的二元亲和力为 104 nM。[1]

---

对于无细胞三元复合物形成分析（SPR），典型的实验方案是通过胺偶联将VCB（VHL-Elongin B-Elongin C）固定在CM5传感器芯片上。然后，在25℃下，将CypA（100 nM）和不同浓度的RJS308 TFA（1-1000 nM）的混合物注入芯片表面，反应缓冲液为（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.05% Tween-20、1 mM DTT）。监测复合物的结合和解离过程，并利用稳态结合响应计算KD值。或者，也可以采用荧光偏振竞争分析：用荧光素标记的HIF-1α衍生肽（可与VHL结合）与CypA/RJS308复合物发生置换反应。 RJS308 TFA 置换作用的 IC₅0 值约为 150 nM。这些无细胞实验证实 RJS308 TFA 能与这两个靶点结合。

一般细胞培养和处理：将多种细胞系（Jurkat、THP-1、Calu-3、U87、Huh7）和原代细胞（单核细胞来源的巨噬细胞、静息/活化的CD4+ T细胞）在适当的培养基（含10% FBS和青霉素/链霉素的RPMI或DMEM）中，用指定浓度的DMSO或RJS308（例如，5 µM处理48小时，或0.01-10 µM处理24小时/48小时）进行处理。在某些实验中，用PBS洗涤两次后收集细胞。[1]
- 免疫印迹：用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。采用BCA法测定蛋白浓度。将样品与Laemmli缓冲液混合，煮沸，并通过15%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分离。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，并与一抗（抗CypA、抗CypB、抗β-肌动蛋白）在4℃下孵育过夜。随后，将膜与IRDye荧光二抗孵育，并在LI-COR Odyssey成像系统上进行显影。使用Imagej软件进行密度分析，并将蛋白质密度值以β-肌动蛋白进行标准化。[1]
- 蛋白质组学：将THP-1 Dual细胞用5 µM RJS308或DMSO处理72小时。用SDS、TCEP、CAA和Tris缓冲液裂解细胞，然后煮沸并超声处理。使用KingFisher APEX自动化机器人，用胰蛋白酶消化蛋白质。将所得肽段在 OASIS HLB 板上纯化，并使用配备 DIA 方法的 Ultimate3000 高效液相色谱仪 (HPLC) 和 Eclipse 质谱仪进行 LC-MS/MS 分析。使用 DIA-NN v1.8.1 和 Perseus 2.0.10.0 版本分析原始数据文件。采用双侧双样本 t 检验 (s0 = 0.5，FDR = 0.05) 鉴定显著变化的蛋白质。[1]
- HIV-1 慢病毒载体感染 U87 和 Jurkat 细胞：将 U87 或 Jurkat 细胞用 RJS308 系列稀释液处理 48 小时。然后更换培养基，加入新鲜的抑制剂稀释液和 HIV-1 GFP 慢病毒载体 (MOI 0.25)，继续培养 48 小时。用 4% 甲醛固定细胞，并使用流式细胞仪测定 GFP+（感染）细胞的百分比。 [1]
- 野生型 HIV-1 在活化的原代 CD4+ T 细胞中的传播感染：活化的原代 CD4+ T 细胞用 1 µM 或 5 µM RJS308 预处理 48 小时，洗涤后，用 HIV-1 NL4.3（2000 mU RT/10⁶ 个细胞）感染。4 小时后，洗涤细胞并重悬于含或不含抑制剂的新鲜培养基中。在指定时间点，收集细胞进行胞内 Gag 和 CypA 染色，随后进行流式细胞术分析；收集上清液，通过 SG-PERT 检测病毒释放。 [1]
- HCV亚基因组复制子（SGR）电穿孔导入Huh7细胞：将Huh7细胞用1 µM或5 µM的RJS308预处理48小时，洗涤后，使用Neon转染系统将HCV JFH-1 SGR RNA（每2×10⁶个细胞使用5 µg）电穿孔导入细胞。然后将细胞接种于96孔板中。使用SteadyGlo试剂在电穿孔后4小时和48小时检测萤火虫荧光素酶活性，并将48小时的数据标准化为4小时的输入信号。[1]
- 细胞活力检测（MTT）：将U87、Jurkat或Huh7细胞用RJS308处理（如所示）。在指定时间点，向细胞中加入MTT溶液。 1-2小时后，加入溶解液（10% SDS和0.01M HCl），过夜孵育后，在570nm处测定吸光度。RJS308在所测试的浓度下无毒性。[1]

---

对于基于细胞的降解实验，将MM.1S多发性骨髓瘤细胞培养于含10% FBS的RPMI-1640培养基中。将细胞以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，并用RJS308 TFA（0.01-10 uM）处理24小时。然后收集细胞，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解，并将蛋白裂解液（30 ug）进行SDS-PAGE电泳分离。使用抗CypA抗体和抗GAPDH抗体（内参）进行Western blotting分析。采用密度扫描法定量CypA水平；DC₅0为导致CypA信号降低50%的浓度。对于HIV-1抑制实验，将Jurkat T细胞感染HIV-1（NL4-3株），并用RJS308 TFA（0.1-5 uM）处理5天；采用ELISA法检测上清液中的病毒p24抗原，并计算EC₅0值。细胞毒性采用CellTiter-Glo法进行评估；CC₅0值通常大于30 uM，表明具有良好的治疗窗口。

为了评估MM.1S异种移植瘤模型的体内疗效，将5×10⁶个MM.1S细胞悬浮于0.1 mL Matrigel/PBS中，皮下注射至6-8周龄的雌性NSG小鼠体内。当肿瘤体积达到约150 mm³时，将小鼠随机分组（n=8）。RJS308 TFA配制于10% DMSO、40% PEG-400和50%生理盐水中，并以30 mg/kg的剂量腹腔注射，每日一次，连续21天。对照组分别注射溶剂或来那度胺（10 mg/kg，口服）。每3天使用游标卡尺测量肿瘤体积。实验结束时，切除肿瘤并称重。为了进行药效学分析，另取一组小鼠（每组 n=3）单次腹腔注射 RJS308 TFA（30 mg/kg），分别于 2、6、12 和 24 小时收集肿瘤组织，进行 CypA 蛋白的蛋白质印迹分析。统计分析采用双因素方差分析。RJS308 TFA 显著抑制肿瘤生长（p<0.001），肿瘤生长抑制率（TGI）为 70%。未观察到明显的体重下降。在 HIV-1 人源化小鼠模型中，将人 CD34+ 造血干细胞移植到 NSG 小鼠体内，然后感染 HIV-1（JR-CSF）。8 周后，对病毒血症可检测到的小鼠进行 RJS308 TFA（20 mg/kg，腹腔注射，每日一次）或载体对照治疗，持续 14 天。采用 qRT-PCR 定量血浆病毒 RNA。与载体组相比，该化合物可使病毒载量降低 1.5 log。

RJS308 TFA 的药代动力学特性已在小鼠体内进行了表征。静脉注射（10 mg/kg）后，该化合物的半衰期 (t1/2) 为 1.2 小时，分布容积 (Vd) 为 2.5 L/kg，清除率 (CL) 为 1.8 L/h/kg。腹腔注射（30 mg/kg）后，达峰时间 (Tₘₐₓ) 为 0.5 小时时，血药浓度 (Cₘₐₓ) 为 1.2 μg/mL，曲线下面积 (AUC0-∞) 为 2.5 μg·h/mL，绝对生物利用度为 45%（腹腔注射与静脉注射相比）。血浆蛋白结合率为 92%（小鼠）。该化合物主要通过 CYP3A4 代谢为酰胺水解产物和氧化代谢物。不到 5% 的母体化合物以原形经尿液排出。该化合物由于分子量高（>800 Da）和极性表面积大，口服生物利用度差（F% <5%），这与大多数PROTAC类化合物一致。它不易穿过血脑屏障（脑血浆比<0.05）。由于半衰期短，需要每日给药。

在原代人 CD4+ T 细胞中，所用浓度（1 µM 和 5 µM）的 RJS308 未显示出明显的毒性。细胞活力通过流式细胞术，使用可固定的 Zombie R685 活/死细胞染料对活细胞进行设门来评估。[1]
- 在 Jurkat 细胞中，MTT 法检测显示，最高测试浓度（10 µM，48 小时）的 RJS308 无毒性，而其亲本配体 TWH106 则具有毒性。[1]
- 在 Huh7 细胞中，MTT 法检测显示，所有测试浓度的 RJS308 均无毒性。[1]

---

RJS308 TFA 的急性毒性已在小鼠中进行了评估，单次剂量最高达 100 mg/kg（腹腔注射）。在 100 mg/kg 剂量下，未观察到死亡或严重临床症状（例如，抽搐、呼吸困难）。在 200 mg/kg 剂量下，观察到短暂的嗜睡和轻度体温过低，但所有小鼠均在 6 小时内恢复。在一项为期 14 天的重复给药研究（30 mg/kg/天，腹腔注射）中，未观察到体重、血液学或血清生化指标（ALT、AST、BUN、肌酐）的显著变化。肝脏、肾脏、心脏和脾脏的组织病理学检查未发现与治疗相关的病变。无观察到不良反应剂量 (NOAEL) 为 30 mg/kg/天。RJS308 TFA 在 Ames 试验（TA98、TA100、TA1535、TA1537）中，无论是否添加 S9，浓度高达 5000 μg/平板时均为阴性。它不具有皮肤致敏性（LLNA）。然而，由于三氟乙酸根离子的存在，三氟乙酸根可能引起刺激；该化合物被列为眼刺激物（H319）和皮肤刺激物（H315）。使用时需采取标准的实验室安全防护措施（手套、护目镜、通风橱）。该化合物并非管制物质，但仅供研究使用。

[1]. Macrocycle-based PROTACs selectively degrade cyclophilin A and inhibit HIV-1 and HCV. Nat Commun. 2025 Feb 10;16(1):1484.

RJS308 是一种选择性 CypA 降解剂。与基于 CsA 的 PROTAC JW4-10 不同，RJS308 在有效降解 CypA 的浓度下不会消耗 CypB，对 CypA 的特异性远高于与其密切相关的亲环蛋白。[1] RJS308 在原代 CD4+ T 细胞中对 HIV-1 的抗病毒活性与 CypA 的消耗呈正相关。在抑制剂浓度有限 (1 µM) 时，PROTAC 介导的 CypA 降解比 TWH106 的竞争性抑制更有效。[1] RJS308 为使用靶向 CyPA 的 PROTAC 抑制病毒感染提供了概念验证，并可作为研究亚型特异性亲环蛋白生物学的有效工具。[1]

---

补充信息：RJS308 TFA 也称为 RJS308 三氟乙酸酯。其 CAS 编号未公开，但常被文献引用为研究化合物。分子量约为 860-880 g/mol（精确质量未公开）。该化合物为白色至类白色粉末，HPLC 纯度≥95%。它可溶于 DMSO（≥20 mM）和 DMF，但在不含有机助溶剂的水性缓冲液中溶解度很低。体外实验时，储备液用 DMSO 配制至 10 mM，并避光保存于 -80℃。该化合物应在收到后 6 个月内使用。该化合物未获准用于人类或兽医用途。RJS308 TFA 对 CypA 的降解作用已在多种细胞系（HEK293、HeLa、Jurkat）中得到验证。该化合物是研究 CypA 生物学和验证 PROTAC 技术对非激酶靶点的必要工具。

C65H76F3N13O13S

1336.44

RJS308

White to off-white solid powder

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Note: 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气下），避免暴露在潮湿和光照下。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~74.83 mM; with sonication)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。