RD162

AR/androgen recepto

通过内源性 AR 基因扩增，用 RD162 (1–10 μM) 处理人前列腺癌细胞系 VCaP 四天，以抑制生长并诱导细胞凋亡[1]。在体外荧光偏振测定中，RD162 与孕酮、雌激素或糖皮质激素受体几乎没有结合[1]。

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RD162与AR的结合是特异性的，因为在体外荧光偏振试验中，它与黄体酮、雌激素或糖皮质激素受体几乎没有结合(表S1)。接下来，我们比较了RD162和MDV3100与比卡鲁胺对LNCaP/AR细胞雄激素依赖性基因表达的影响。比卡鲁胺诱导AR靶基因PSA和跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的表达，而RD162或MDV3100则没有(图1C)，这表明RD162和MDV3100在去势抗性环境中不具有激动剂活性。在亲代LNCaP细胞中，RD162和MDV3100均能拮抗合成雄激素R1881对PSA和TMPRSS2的诱导(图S1)。在具有内源性AR基因扩增的人前列腺癌细胞系VCaP中(11)，RD162和MDV3100抑制生长并诱导凋亡，而比卡鲁胺则没有(图1D, E)。通过与合成雄激素R1881共同处理，这种生长抑制被逆转，R1881与AR结合竞争(图S2A)，并且在AR阴性的DU145人前列腺癌细胞中未观察到(图S2B)。此外，RD162和MDV3100抑制了从比卡鲁胺获得性耐药患者中分离的突变AR蛋白(W741C)的转录活性(图S3)。AR LBD中W741C的取代导致比卡鲁胺作为纯激动剂[1]。

当给予 RD162（10 mg/kg；口服强饲；每天；28 天）时，所有肿瘤都会消退[1]。在去势雄性小鼠中产生的人 LNCaP/AR 异种移植物中，RD162（0.1、1、10 mg/kg；口服强饲；每天；持续 5 天）可靠地降低荧光素酶活性，但 0.1 和 1.0 mg/kg/天的较低剂量影响可以忽略不计。五天后，RD162 显着降低细胞增殖[1]。口服给药后，RD162（20 mg/kg；灌胃）的血清半衰期约为 30 小时，生物利用度约为 50%[1]。

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为了评估RD162的体内活性，我们首先测定了其在小鼠体内的药代动力学性质。口服给药后，RD162的生物利用度约为50%，血清半衰期约为30小时(图2A，表S2A)。单次口服20 mg/kg剂量(~ 23 μM)后24小时观察到的谷水平超过体外研究(~ 1-10 μM)预期阻断AR活性的浓度。我们通过测定去势雄性小鼠培养的LNCaP/AR异种移植物的荧光素酶活性，评估RD162对体内AR功能的药效学影响。这些肿瘤共表达外源性AR和AR依赖性报告基因ARR2-Pb-Luc。每天灌胃10 mg/kg RD162 5天后，小鼠的荧光素酶活性持续降低(图2B)，而较低剂量的0.1和1.0 mg/kg/天影响最小(图S4A)。与AR转录功能降低相对应的是，经Ki-67染色检测，LNCaP/AR异种移植物的细胞增殖在RD162处理5天后显著降低(图S4B)。[1]

配体结合研究[1]
RD162和MDV3100在细胞中与AR的相对结合亲和力，相对于双氢睾酮(DHT)和比卡鲁胺，通过竞争分析来确定，在与18F-FDHT预孵育的细胞中加入越来越高浓度的冷竞争对手。LNCaP/AR(密码子开关)细胞在添加10% FBS的Iscove或RPMI培养基中繁殖。细胞胰蛋白酶化，PBS洗涤，三份细胞样品与20,000 cpm 18F-FDHT和越来越多的冷竞争对手(1 pM至1μ m)混合。在室温下将溶液在摇床上摇匀，1小时后分离细胞，用Brandel细胞收收机用tris缓冲盐水冰洗。所有分离的细胞样本用闪烁计数器计数，用适当的总活性标准和空白对照，并确定18F-FDHT的特定摄取。将这些数据与冷竞争者的浓度作对比，得到s型位移曲线。采用单点模型和最小二乘曲线拟合程序确定IC50值，曲线拟合的R2 >0.99。

采用竞争性试剂盒测定RD162对大鼠AR和人孕激素受体(PR)、全长人雌激素受体α (ERα)和人糖皮质激素受体(GR)配体结合域的相对体外结合亲和力。荧光偏振用作读数，实验在96孔板(Costar®黑色聚苯乙烯圆底分析板#3792)上进行，并读取(每孔5个读数;0.1秒积分时间;整个盘子读5 ~ 8遍;G因子= 0.91)，使用具有荧光素激发(485 nM)和发射(530 nM)滤波器的Analyst™AD板阅读器。每个激素剂量重复三次，相对误差通过从平均值计算三个值的标准误差来确定。在所有情况下，我们控制了最小竞争(载体单独)、无受体、无荧光配体和最大竞争(10-5 M R1881、黄体酮、雌二醇(E2)或地塞米松)。结合曲线拟合采用单结合位点竞争模型，使用Prism统计分析软件包。所有病例的R2值均大于0.8。为了保证结果的重复性，我们进行了多次实验，在所有情况下，平均值(SEM)的标准误差都小于0.3个logIC50平均值的对数单位。Ki值与SEM一起作为实验的平均值计算，结合亲和力作为相对于该受体的紧密结合配体控制的百分比报告。

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体外血清蛋白结合[1]
将磷酸缓冲盐水(PBS)中纯化的HSA(4.5%)和AAG(1.1%)的储备蛋白溶液与适当体积的抗雄激素储备液(36X或50X, 40%乙醇/水)混合，以获得含有蛋白质(4% HSA + 0.1% AAG)和抗雄激素(0.4,2.0或10µM比卡鲁胺，RD162或MDV3100)的测试样品。将测试样品充分混合，并将250 μL至500 μL的三份样品转移到玻璃离心管中。使用前，所有的超离心管和移液管尖都用0.1%的Tween 20水溶液处理，以减少抗雄激素的非特异性结合损失。加入乙腈/甲醇(4/1 v/v) 1.0 mL，充分混合，在-20℃或冰浴中保存~ 1小时，然后1000g离心10分钟。将上清液转移到96孔板上，用LC-MS/MS分析药物水平。这些样品代表了抗雄激素的超离心前总量。然后将每种加标蛋白样品约0.5 mL一式三份转移到每个离心管中(Amicon®Ultra，分子量切断5000或10000)。将填充的试管精确平衡(用适当的瓶盖)，然后放置在离心机中。样品在~ 3500 g下，在~4℃下离心~1.0 hr。超滤后，每根试管小心地将3份样品(100 μL)滤液转移到玻璃离心管中。加入乙腈/甲醇(4/1 v/v) 0.5 mL，充分混合，在-20℃或冰浴中保存~ 1小时，1000 g离心10分钟。将上清液转移到96孔板上，使用MSKCC分析药理学核心设施开发的验证方法，通过LC-MS/MS分析抗雄激素水平。这些值代表未结合的抗雄激素量。计算抗雄激素与血清蛋白结合的平均结果(n=3)，并报道蛋白结合配体的百分比。[1]

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时间分辨荧光共振转移试验[1]
Lantha Screen TR-FRET雄激素受体共激活剂试验(Invitrogen)使用DMSO中5倍连续稀释制备的100X原料药进行。根据制造商的建议，在384孔板中制备化验样品，然后在室温下孵育2小时，然后收集数据。对于每个实验中的每个药物处理，在332 nm激发(截止为420 nm)后，通过对四个相同制备的孔的平均值求得525 nm和488 nm处的发射值，每个孔使用SpectraMax M5平板阅读器读取10次。然后将每个处理的525/488排放比除以用车辆获得的排放比，以确定每个处理的排放比的倍数变化。所提供的数据表示两个独立实验中发射比的平均倍数变化，实验之间的平均值为标准误差。

细胞活力测定[1]
细胞类型： VCaP 细胞
测试浓度： 1, 10 μM
孵育时间： 4 天
实验结果：抑制细胞生长。

动物/疾病模型： 去势雄性小鼠携带 LNCaP/AR 异种移植瘤[1]
剂量： 10 mg/kg
给药途径： 灌胃；每日；持续 28 天
实验结果： 导致所有肿瘤消退。

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动物/疾病模型：雄性小鼠[1]
剂量：20 mg/kg（药代动力学/PK 分析）
给药途径：po（口服灌胃）（溶于 0.5% 羟甲基丙基纤维素溶液）
实验结果：口服给药后生物利用度约为 50%，血清半衰期约为 30 小时。

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药代动力学分析[1]
RD162 的药代动力学研究制剂如下：将 RD162 配制成浓度分别为 2.5 mg/ml、5 mg/ml、7.5 mg/ml、10 mg/ml 和 15 mg/ml 的口服制剂，溶于 0.5% 无菌羟甲基丙基纤维素 (HMPC) 溶液中，并在使用前储存于 4℃ 的棕色玻璃瓶中。每份RD162混悬液均在配制后一周内使用。静脉注射制剂的配制浓度为2 mg/ml，溶于10% (w/v) 无菌蓖麻油-PEG 35和5%甲醇溶液中。将RD162以20 mg/kg的剂量单次口服(po)或静脉注射(iv)给8周龄雄性B6D2F1小鼠（每时间点n=3），并在给药后不同时间点（5分钟至24小时）采用LC-MS/MS法分析血浆。为了评估血液中RD162的浓度，将冷冻血浆样品在室温下解冻，并用甲醇和乙腈（1/4，v/v）的混合溶剂进行提取。样品在-20℃下孵育约1小时，然后在1000g下离心10分钟。将上清液转移至96孔板，并采用高效液相色谱/串联质谱法（HPLC/MS/MS）进行分析。绘制RD162的校准曲线，以便根据外部参考标准将峰面积转换为药物含量。RD162的检测限在几纳克范围内。采用WinNonlin程序的双室模型分析法分析药代动力学（PK）数据。分析的参数包括最大血浆浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax）、血浆浓度-24h曲线下面积（AUC0-24h）、从零时点至无穷大的血浆浓度-2曲线下面积（AUC0-inf）以及半衰期（T1/2）。AUC采用双室模型分析，并线性插值至无穷大计算。口服生物利用度基于AUC0-inf计算。口服PK曲线如图2a所示。

口服RD162的生物利用度约为50%，血清半衰期约为30小时。

[1]. Development of a second-generation antiandrogen for treatment of advanced prostate cancer. Science. 2009 May 8;324(5928):787-90.

转移性前列腺癌的治疗方法是使用拮抗雄激素作用的药物，但大多数患者会进展为更具侵袭性的去势抵抗性前列腺癌，这是由雄激素受体高表达驱动的。本文对二芳基硫代乙内酰脲类化合物RD162和MDV3100进行了表征，这两种化合物是从非甾体类抗雄激素筛选中优化而来，即使在雄激素受体高表达的情况下也能保持活性。与临床使用的抗雄激素比卡鲁胺相比，这两种化合物与雄激素受体的结合亲和力更高，降低了其核转位效率，并抑制了雄激素受体与DNA反应元件的结合以及共激活因子的募集。RD162和MDV3100可口服，并在去势抵抗性人前列腺癌小鼠模型中诱导肿瘤消退。在I/II期临床试验中，首批接受MDV3100治疗的30名患者中，有13名（43%）患者的血清前列腺特异性抗原（PSA，一种前列腺癌生物标志物）浓度持续下降（>50%）。因此，这些化合物似乎是治疗晚期前列腺癌的潜在候选药物。[1]

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两项证据表明，RD162在这些小鼠体内的活性是通过抑制雄激素受体（AR）而非通过脱靶效应介导的。首先，在LNCaP/AR模型中，RD162的抗肿瘤活性呈剂量依赖性，0.1 mg/kg剂量下肿瘤生长有所减缓，1 mg/kg剂量下肿瘤出现少量消退（图S7），这与相同剂量对荧光素酶成像实验中AR转录活性的影响密切相关（图S4A）。其次，比卡鲁胺和 RD162 均未抑制 AR 阴性 DU145 前列腺癌异种移植瘤的生长（图 S8）。[1]

C22H16F4N4O2S

476.45

476.093

C, 55.46; H, 3.39; F, 15.95; N, 11.76; O, 6.72; S, 6.73

915087-27-3

11957756

White to off-white solid powder

1.55

4.841

112.02

1

8

3

33

883

0

JPQFGMYHKSKKGW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H16F4N4O2S/c1-28-18(31)15-6-5-14(10-17(15)23)30-20(33)29(19(32)21(30)7-2-8-21)13-4-3-12(11-27)16(9-13)22(24,25)26/h3-6,9-10H,2,7-8H2,1H3,(H,28,31)

4-[7-[4-cyano-3-(trifluoromethyl)phenyl]-8-oxo-6-sulfanylidene-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-yl]-2-fluoro-N-methylbenzamide

RD162; RD 162; RD-162; 4-[7-[4-cyano-3-(trifluoromethyl)phenyl]-8-oxo-6-sulfanylidene-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-yl]-2-fluoro-N-methylbenzamide; N-Methyl-4-[7-(4-cyano-3-trifluoromethylphenyl)-8-oxo-6-thioxo-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-yl]-2-fluorobenzamide; Depyridinyl Phenyl Apalutamide; 5ZE6THH5VF;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 125 mg/mL (262.36 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。