RD162

AR/androgen recepto
RD162 targets the androgen receptor (AR), functioning as a specific, second-generation antagonist. It belongs to the diarylthiohydantoin class of non-steroidal antiandrogens, co-developed alongside enzalutamide. RD162 has little to no binding to the progesterone, estrogen, or glucocorticoid receptors, demonstrating high selectivity for AR. By binding to AR, RD162 prevents androgen-induced receptor activation and inhibits AR-mediated transcription, making it a valuable tool for prostate cancer research.

在内源性雄激素受体（AR）基因扩增的情况下，用RD162（1–10 μM）处理人前列腺癌细胞系VCaP四天，以抑制其生长并诱导细胞凋亡[1]。体外荧光偏振实验表明，RD162与孕激素受体、雌激素受体或糖皮质激素受体的结合极少或没有结合[1]。

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RD162与AR的结合具有特异性，因为在体外荧光偏振实验中，RD162与孕激素受体、雌激素受体或糖皮质激素受体的结合极少或没有结合（表S1）。接下来，我们比较了RD162和MDV3100与比卡鲁胺对LNCaP/AR细胞中雄激素依赖性基因表达的影响。比卡鲁胺可诱导雄激素受体（AR）靶基因前列腺特异性抗原（PSA）和跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的表达，而RD162或MDV3100则不能（图1C），表明RD162和MDV3100在去势抵抗性前列腺癌中不具有激动剂活性。在亲代LNCaP细胞中，RD162和MDV3100均能拮抗合成雄激素R1881诱导的PSA和TMPRSS2表达（图S1）。在具有内源性AR基因扩增的人前列腺癌细胞系VCaP中，RD162和MDV3100可抑制细胞生长并诱导细胞凋亡，而比卡鲁胺则无此作用（图1D、E）。这种生长抑制作用可通过与合成雄激素R1881（一种与AR竞争结合的药物）联合治疗而逆转（图S2A），并且在AR阴性的DU145人前列腺癌细胞中未观察到（图S2B）。此外，RD162和MDV3100抑制了从一名获得性比卡鲁胺耐药患者体内分离出的突变型AR蛋白（W741C）的转录活性（图S3）。AR配体结合域（LBD）中的W741C突变使比卡鲁胺发挥纯激动剂的作用[1]。体外实验表明，RD162是一种特异性AR拮抗剂，几乎不与孕激素受体、雌激素受体或糖皮质激素受体结合。它能抑制人前列腺癌细胞中¹⁸F-FDHT与AR的结合，IC₅₀值为30.9 nM。在VCaP细胞（含有内源性AR基因扩增）中，RD162（1-10 μM）抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。RD162在1 μM浓度下完全抑制VCaP细胞增殖，在10 μM浓度下诱导细胞凋亡。其活性通过基于细胞的AR介导转录活性检测进行评估。

当给予RD162（10 mg/kg；灌胃；每日一次；持续28天）时，所有肿瘤均消退[1]。在去势雄性小鼠体内构建的人类LNCaP/AR异种移植瘤中，RD162（0.1、1、10 mg/kg；灌胃；每日一次；持续5天）可显著降低荧光素酶活性，但较低剂量（0.1和1.0 mg/kg/天）的效果可忽略不计。5天后，RD162显著降低细胞增殖[1]。口服给药后，RD162（20 mg/kg；灌胃）的血清半衰期约为30小时，生物利用度约为50%[1]。为了评估RD162的体内活性，我们首先测定了其在小鼠体内的药代动力学特性。口服给药后，RD162 的生物利用度约为 50%，血清半衰期约为 30 小时（图 2A，表 S2A）。单次口服 20 mg/kg 剂量后 24 小时观察到的谷浓度（约 23 μM）超过了基于体外研究预期可阻断 AR 活性的浓度（约 1-10 μM）。我们通过测量在去势雄性小鼠体内生长的 LNCaP/AR 异种移植瘤的荧光素酶活性，评估了 RD162 对体内 AR 功能的药效学作用。这些肿瘤共表达外源性 AR 和 AR 依赖性报告基因构建体 ARR2-Pb-Luc。与载体对照组相比，每日灌胃给予小鼠 10 mg/kg RD162，连续 5 天后，小鼠的荧光素酶活性持续降低（图 2B），而较低剂量（0.1 和 1.0 mg/kg/天）的影响甚微（图 S4A）。与雄激素受体（AR）转录功能降低相一致，RD162治疗5天后，LNCaP/AR异种移植瘤的细胞增殖（通过Ki-67染色检测）显著减少（图S4B）[1]。体内实验表明，RD162可诱导去势抵抗性人前列腺癌小鼠模型的肿瘤消退。它是一种口服生物活性抗雄激素，可特异性结合AR。该化合物在临床前模型中的疗效支持其在前列腺癌研究中的潜力。RD162是一种第二代AR拮抗剂，可能克服与第一代抗雄激素相关的耐药机制。需要进一步的体内研究来全面评估其治疗潜力。

配体结合研究[1]
使用竞争性实验测定了RD162和MDV3100细胞中AR与二氢睾酮(DHT)和比卡鲁胺的相对结合亲和力。该实验中，将浓度递增的非竞争性配体加入预先用¹⁸F-FDHT孵育的细胞中。LNCaP/AR（密码子转换）细胞在添加10% FBS的Iscove培养基或RPMI培养基中培养。细胞经胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，取三份细胞样品与20,000 cpm的¹⁸F-FDHT和递增浓度的非竞争性配体（1 pM至1 μM）混合。将溶液在室温下于轨道摇床上振荡，1小时后，使用Brandel细胞收集器分离细胞，并用冰冷的Tris缓冲盐溶液洗涤。所有分离的细胞样本均使用闪烁计数器进行计数，并设置了适当的总活性标准和空白对照，测定了 18F-FDHT 的特异性摄取量。将这些数据与非竞争性试剂的浓度作图，得到 S 形位移曲线。IC50 值采用单一位点模型和最小二乘曲线拟合程序确定，曲线拟合的 R² 值 > 0.99。

使用竞争性试剂盒测定了 RD162 与大鼠雄激素受体 (AR) 和人孕激素受体 (PR) 的配体结合域以及全长人雌激素受体 α (ERα) 和人糖皮质激素受体 (GR) 的相对体外结合亲和力。采用荧光偏振作为读数方式，实验在96孔板（Costar®黑色聚苯乙烯圆底检测板#3792）中进行，并使用配备荧光素激发（485 nm）和发射（530 nm）滤光片的Analyst™ AD酶标仪进行读数（每孔5次读数；积分时间0.1秒；全板读数5至8次；G因子=0.91）。每种激素剂量均进行三次重复实验，相对误差通过计算三次重复实验结果的标准误差与平均值的比值来确定。所有实验均设置了最小竞争（仅溶剂）、无受体、无荧光配体和最大竞争（10⁻⁵ M R1881、孕酮、雌二醇(E2)或地塞米松）四种对照。使用Prism统计分析软件，采用单一位点竞争模型拟合结合曲线。所有情况下的R²值均大于0.8。为确保结果的可重复性，实验重复多次，所有情况下，平均值的标准误差 (SEM) 均小于平均 logIC50 值的 0.3 个对数单位。Ki 值计算为各实验的平均值，并附有 SEM。结合亲和力以相对于该受体的紧密结合配体对照的百分比表示。[1]

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体外血清蛋白结合[1]
将纯化的 HSA (4.5%) 和 AAG (1.1%) 的磷酸盐缓冲液 (PBS) 储备液与适量的抗雄激素储备液（36 倍或 50 倍，溶于 40% 乙醇/水溶液）混合，以获得含有蛋白质（4% HSA + 0.1% AAG）和抗雄激素（0.4、2.0 或 10 µM 比卡鲁胺、RD162 或 MDV3100）的测试样品。将测试样品充分混匀，取三份样品（250 μL 至 500 μL）转移至玻璃离心管中。所有超速离心管和移液器吸头在使用前均用 0.1% Tween 20 水溶液处理，以减少抗雄激素的非特异性结合损失。加入 1.0 mL 乙腈/甲醇 (4/1 v/v) 混合液，充分混匀，置于 -20 °C 或冰浴中约 1 小时，然后以 1000 g 离心 10 分钟。将上清液转移至 96 孔板，并用 LC-MS/MS 分析药物浓度。这些样品代表超速离心前抗雄激素的总量。将约0.5 mL的各加标蛋白样品以三份重复的方式转移至各离心管（Amicon® Ultra，截留分子量5,000或10,000）中。将装满样品的离心管精确平衡（盖上合适的管盖），然后放入离心机。样品在约4°C下以约3,500 g离心约1小时。超滤后，小心地将各离心管中的滤液（100 μL）以三份重复的方式转移至玻璃离心管中。加入0.5 mL乙腈/甲醇（4/1 v/v）混合溶液，充分混匀，并在-20°C或冰浴中放置约1小时，然后以1000 g离心10分钟。将上清液转移至96孔板，并使用MSKCC分析药理学核心实验室开发的经验证的方法，通过LC-MS/MS分析抗雄激素水平。这些数值代表游离的抗雄激素量。计算抗雄激素与血清蛋白的平均结合率（n=3），并报告蛋白结合配体的百分比。[1]

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时间分辨荧光共振转移测定[1]
使用Lantha Screen TR-FRET雄激素受体共激活因子测定试剂盒（Invitrogen），采用DMSO五倍系列稀释制备的100倍药物储备液进行测定。按照制造商的建议，在384孔板中制备测定样品，然后在室温下孵育2小时，之后进行数据采集。在每个实验中，对于每种药物处理，在332 nm激发（截止波长为420 nm）后，通过对四个相同制备的孔进行平均，获得525 nm和488 nm处的发射值。每个孔使用SpectraMax M5酶标仪读取10次。然后将每种处理的525/488发射比值除以载体处理的发射比值，以确定每种处理引起的发射比值的倍数变化。所呈现的数据代表两次独立实验的平均发射比值倍数变化，并标明了两次实验间平均值的标准误差。

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RD162的体外酶/受体结合试验通常包括使用雄激素受体和放射性标记或荧光标记的雄激素作为示踪剂的竞争性结合实验。通过剂量反应结合实验评估化合物与AR的结合亲和力，并确定IC₅₀值（¹⁸F-FDHT结合的IC₅₀值为30.9 nM）。检测在生理pH值的缓冲溶液中进行，使用合适的受体制剂。通过平行结合试验证实其对雄激素受体（AR）的选择性优于孕激素受体、雌激素受体和糖皮质激素受体。

细胞活力检测[1]
细胞类型： VCaP 细胞
测试浓度： 1、10 μM
孵育时间： 4 天
实验结果： 抑制细胞生长。

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RD162 的体外细胞检测采用 AR 阳性前列腺癌细胞系，例如 VCaP，这些细胞系含有内源性 AR 基因扩增。细胞用不同浓度的化合物处理 24-72 小时。使用雄激素反应元件 (ARE)-荧光素酶构建体进行报告基因检测，评估 AR 介导的转录活性。使用 MTT 或 CCK-8 检测评估细胞增殖。使用 Annexin V 染色或 caspase 活性检测评估细胞凋亡。使用 qPCR 检测 PSA 等 AR 靶基因的表达。采用标准细胞培养条件（37°C，5% CO₂），并使用经活性炭处理的血清。

动物/疾病模型： 去势雄性小鼠携带 LNCaP/AR 异种移植瘤[1]
剂量： 10 mg/kg
给药途径： 灌胃；每日；持续 28 天
实验结果： 导致所有肿瘤消退。

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动物/疾病模型：雄性小鼠[1]
剂量：20 mg/kg（药代动力学/PK 分析）
给药途径：口服（po）（溶于 0.5% 羟甲基丙基纤维素溶液）
实验结果：口服给药后生物利用度约为 50%，血清半衰期约为 30 小时。

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药代动力学分析[1]
RD162 的药代动力学研究制剂如下：将 RD162 配制成浓度分别为 2.5 mg/ml、5 mg/ml、7.5 mg/ml、10 mg/ml 和 15 mg/ml 的口服制剂，溶于 0.5% 无菌羟甲基丙基纤维素 (HMPC) 溶液中，并在使用前储存于 4℃ 的棕色玻璃瓶中。每份RD162混悬液均在配制后一周内使用。静脉注射制剂的配制浓度为2 mg/ml，溶于10% (w/v) 无菌蓖麻油-PEG 35和5%甲醇溶液中。将RD162以20 mg/kg的剂量单次口服(po)或静脉注射(iv)给8周龄雄性B6D2F1小鼠（每时间点n=3），并在给药后不同时间点（5分钟至24小时）采用LC-MS/MS法分析血浆。为了评估血液中RD162的浓度，将冷冻血浆样品在室温下解冻，并用甲醇和乙腈（1/4，v/v）的混合溶剂进行提取。样品在-20℃下孵育约1小时，然后在1000g下离心10分钟。将上清液转移至96孔板，并采用高效液相色谱/串联质谱法（HPLC/MS/MS）进行分析。绘制RD162的校准曲线，以便根据外部参考标准将峰面积转换为药物含量。RD162的检测限在几纳克范围内。采用WinNonlin程序的双室模型分析法分析药代动力学（PK）数据。分析的参数包括最大血浆浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax）、血浆浓度-24h曲线下面积（AUC0-24h）、从零时点至无穷大的血浆浓度-2曲线下面积（AUC0-inf）以及半衰期（T1/2）。AUC采用双室模型分析，并线性插值至无穷大计算。口服生物利用度基于AUC0-inf计算。图 2a 显示了口服药代动力学曲线。

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RD162 的体内动物研究通常采用口服给药的方式，将化合物给予前列腺癌啮齿动物模型，包括去势抵抗性前列腺癌模型。研究终点包括肿瘤生长测量、肿瘤组织中雄激素受体（AR）靶基因表达评估、细胞凋亡标志物评估以及药代动力学分析。该化合物在这些模型中可诱导肿瘤消退。所有操作均须遵守机构动物护理和使用指南。

RD162 的口服生物利用度约为 50%，血清半衰期约为 30 小时。RD162 具有口服生物活性。其分子量为 476.45 g/mol，分子式为 C₂₂H₁₆F₄N₄O₂S。作为一种第二代非甾体类抗雄激素，RD162 具有良好的药代动力学特性，支持口服给药。该化合物通常储存在推荐用于研究化学品的条件下。详细的药代动力学参数，包括半衰期、Cmax 和 AUC，可从临床前研究报告中获得。RD162 与恩扎卢胺共同开发。

RD162仅供研究用途，未获准用于人体治疗。作为一种研究用化学品，其全面的毒理学数据在公开文献中尚不详尽。处理该化合物时应遵守标准安全预防措施，包括使用适当的个人防护装备。与所有研究用化学品一样，在考虑进行临床开发之前，必须进行全面的毒理学分析。该化合物应在通风良好的区域操作，并遵循正确的废物处理程序。

[1]. Development of a second-generation antiandrogen for treatment of advanced prostate cancer. Science. 2009 May 8;324(5928):787-90.

转移性前列腺癌的治疗涉及使用拮抗雄激素作用的药物，但大多数患者会进展为更具侵袭性的去势抵抗性前列腺癌，这种癌症由雄激素受体过度表达驱动。本文描述了从非类固醇抗雄激素筛选中优化的二芳基硫氨基酸化合物RD162和MDV3100，这些化合物即使在雄激素受体过度表达的情况下仍保持活性。与临床使用的抗雄激素比卡鲁胺相比，这些化合物对雄激素受体的结合亲和力更高，核转移效率降低，并抑制雄激素受体与DNA反应元件的结合及共激活因子的招募。RD162和MDV3100为口服给药，并在去势抵抗性人前列腺癌的小鼠模型中诱导肿瘤退缩。在一项I/II期临床试验中，在首批接受MDV3100治疗的30名患者中，有13名（43%）显示血清前列腺特异性抗原（PSA，前列腺癌生物标志物）持续下降（>50%）。因此，这些化合物似乎是治疗晚期前列腺癌的潜在候选者。两项证据表明，RD162在这些小鼠中的活性是通过抑制雄激素受体（AR）而非离靶效应介导的。首先，在LNCaP/AR模型中，RD162的抗肿瘤活性是剂量依赖性的，在0.1 mg/kg的剂量下肿瘤生长减缓，而在1 mg/kg的剂量下则出现轻微回归（图S7），这与相同剂量对AR转录活性的影响密切相关，如在荧光素酶成像实验中所示（图S4A）。其次，无论是比卡鲁胺还是RD162都未能抑制AR阴性DU145前列腺癌异种移植瘤的生长（图S8）。\nRD162（CAS#: 915087-27-3）是一种第二代非类固醇抗雄激素，属于二芳基硫脲类，与恩杂鲁胺共同开发。它是一种口服生物活性、特异性AR拮抗剂，能够以30.9 nM的IC₅₀抑制¹⁸F-FDHT与AR的结合。RD162对孕激素、雌激素或糖皮质激素受体几乎没有结合。它在去势抵抗性前列腺癌小鼠模型中诱导肿瘤回归。该化合物不是药物，且尚未进行临床试验。

C22H16F4N4O2S

476.45

476.093

C, 55.46; H, 3.39; F, 15.95; N, 11.76; O, 6.72; S, 6.73

915087-27-3

11957756

White to off-white solid powder

1.55

4.841

112.02

1

8

3

33

883

0

CNC(=O)C1=C(C=C(C=C1)N2C(=S)N(C(=O)C23CCC3)C4=CC(=C(C=C4)C#N)C(F)(F)F)F

JPQFGMYHKSKKGW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H16F4N4O2S/c1-28-18(31)15-6-5-14(10-17(15)23)30-20(33)29(19(32)21(30)7-2-8-21)13-4-3-12(11-27)16(9-13)22(24,25)26/h3-6,9-10H,2,7-8H2,1H3,(H,28,31)

4-[7-[4-cyano-3-(trifluoromethyl)phenyl]-8-oxo-6-sulfanylidene-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-yl]-2-fluoro-N-methylbenzamide

RD162; RD 162; RD-162; 4-[7-[4-cyano-3-(trifluoromethyl)phenyl]-8-oxo-6-sulfanylidene-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-yl]-2-fluoro-N-methylbenzamide; N-Methyl-4-[7-(4-cyano-3-trifluoromethylphenyl)-8-oxo-6-thioxo-5,7-diazaspiro[3.4]octan-5-yl]-2-fluorobenzamide; Depyridinyl Phenyl Apalutamide; 5ZE6THH5VF;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 125 mg/mL (262.36 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。