H-Ile-Lys-Val-Ala-Val-OH   中文名称: 层粘蛋白肽

ERK1/2; Akt

H-Ile-Lys-Val-Ala-Val-OH（0-2.5 mM，0-48 小时）刺激骨髓间充质干细胞 (BMMSC) 增殖和增殖细胞核抗原 (PCNA) 产生 [2]。 H-Ile-Lys-Val-Ala-Val-OH（5 mM，24 小时）启动 BMMSC 细胞周期，导致细胞从 G0/G1 进入 S 期，并阻止其进入 G2/M 期 [2 ]。 H-Ile-Lys-Val-Ala-Val-OH（0-2.5 mM，0-48 小时）通过提高 BMMSC 中 ERK1/2 和 Akt 的磷酸化水平来激活 MAPK/ERK 和 PI3K/Akt 信号通路 [2 ]。

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发现IKVAV肽以剂量和时间依赖的方式诱导BMMSC的增殖和增殖细胞核抗原（PCNA）合成。细胞周期分析显示，IKVAV处理的BMMSC在S期的比例高于对照组。Western blot结果表明，IKVAV通过提高BMMSCs中ERK1/2和Akt的磷酸化水平，激活了丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路。同时，ERK1/2和Akt的磷酸化水平分别被ERK1/2抑制剂（PD98059）和Akt抑制剂（wortmannin）部分阻断。 结论：我们的研究结果表明，IKVAV通过激活MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt信号通路刺激BMMSC群体的生长和增殖。本研究首次揭示了IKVAV肽在信号转导水平上对BMMSC的增强作用，其结果可为IKVAV移植支架在BMMSC组织工程领域的应用提供实验证据[2]。

层粘连蛋白是一种具有多种生物活性的基底膜糖蛋白。含有IKVAV（Ile-Lys-Val-Ala-Val）的A链上的序列已被证明可以促进神经突起生长、细胞粘附以及肿瘤生长和转移。在这里，我们确定了这种合成肽对生物活性的结构要求。合成了12个氨基酸长的全L-（LAM-L）和全D-肽（LAM-D）片段，以及一个交替的含D-和L-氨基酸的肽（LAM-DL），其中包括IKVAV序列（残基2097-2108）。圆二色性光谱分析揭示了LAM-D和LAM-L的镜像构象，主要具有β片结构，并在较小程度上具有α螺旋结构。LAM-DL没有表现出任何明显的有序构象特征。LAM-D和LAM-L对大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）显示出相似的细胞附着活性，而LAM-DL则没有活性。具有随机IKVAV序列的肽类似物（LAM-RM）也是无活性的。在类似的细胞附着试验中，四种肽与层粘连蛋白的竞争实验也观察到了类似的趋势。
在体内实验中，当将鼠黑色素瘤细胞B16F10皮下注射到小鼠体内时，LAM-D和LAM-L都能够促进肿瘤生长。结果表明，IKVAV结构域的构象状态是决定生物活性的一个因素，但对特定的手性没有严格要求。IKVAV区域可能具有序列特异性[1]。

细胞增殖测定[2]
细胞类型： BMMSC
测试浓度： 0、0.004、0.02、0.1、0.5 和 2.5 mM
孵育时间：0、12、24、36、48小时
实验结果：刺激增殖细胞核抗原（PCNA）合成并诱导骨髓间充质干细胞增殖（ BMMSC）以剂量和时间依赖性方式。

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细胞周期分析[2]
细胞类型： BMMSC
测试浓度： 5 mM
孵育持续时间： 24 h
实验结果： 诱导BMMSC细胞周期，使细胞从G0/G1进入S期，并阻止其进入G2/M期；细胞周期中S期比例的增加被认为是BMMSC增殖的标志。

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蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： BMMSC
测试浓度： 0、0.004、0.02、0.1、0.5 和 2.5 mM
孵育时间：0、12、24、36、48 小时
实验结果：p-ERK1/2 和 p- 水平显着增加Akt 具有剂量和时间依赖性。

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细胞活力测定[1]
使用CCK-8测定法检测细胞活力。BMMSC（5×104/孔）在96孔板中用含有8%FBS的αMEM培养基培养。24小时后，用含有IKVAV或PBS的αMEM代替培养基（对照组）；处理时间为0至72小时。培养基中IKVAV的浓度梯度为0.004至2.5毫米。为了定量分析细胞增殖，向每个孔中加入10μl WST-8溶液。在给定的处理期后，通过ELISA监测450nm处的吸光度。通过将光密度（OD）归一化为在PBS中孵育的对照细胞的光密度来计算细胞增殖。

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流式细胞术分析[1]
通过FCM分析测定经IKVAV处理的BMMSC的细胞周期和凋亡。根据制造商的方案，使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。BMMSCs在6孔板中以6×105个细胞/ml的浓度在含有不同浓度IKVAV的αMEM或PBS（对照组）中培养24小时。通过胰蛋白酶消化收集细胞，然后在冷PBS中洗涤两次，然后在700 g下离心。在1×105至1×106的范围内，将细胞重新悬浮在500μl结合缓冲液中，再次以1000 rpm离心5分钟，然后去除上清液。 [1]
对于细胞周期测定，将-20°C预冷的90%乙醇缓慢加入细胞中，然后重新悬浮并在冰浴中过夜。再次以1000rpm离心细胞5分钟，去除上清液。将它们重新悬浮在250μl PBS和2μl RNaseA（去离子水中1mg/ml）中，并在37°C水浴中保持40分钟；加入50μl PI（PBS中的100μg/ml），在黑暗中染色20分钟。通过流式细胞术在488nm处检查细胞周期，并通过cell Quest和Modfit软件分析细胞周期分配。[1]
为了检测细胞凋亡，将细胞重新悬浮在500μl结合缓冲液中，并转移到无菌流式细胞术玻璃管中。加入5微升膜联蛋白V-FITC和5μl碘化丙啶，然后在室温下在黑暗中孵育10分钟。通过流式细胞术在488和530nm下分析细胞。染色后1小时内，使用流式细胞仪中的Cell Quest™软件分析细胞分布。每个数据文件收集了10000个细胞的数据。凋亡细胞被鉴定为膜联蛋白V-FITC阳性和PI阴性。

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实时荧光定量聚合酶链反应[1]
根据制造商的说明，使用Trizol试剂从IKVAV诱导的BMMSC中提取总细胞mRNA。将分离的RNA储存在-70°C的焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中，通过SYBR green II荧光染料在260/280 nm处的吸光度测定RNA的数量和质量。根据制造商的说明，使用逆转录辅助第一链cDNA合成试剂盒将总RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。本文中使用的引物序列如下：PCNA引物：sense，TTTCACAAAAGCCACTCCACTG；反义CTTTAAGTCCCATCAGCAAT。GAPDH被用作内部对照，并使用以下引物进行检测：sense，CGCTAACATCAAATGGGGTG；反义TTGCTGACATTTGAGGGAG。使用以下参数进行聚合酶链式反应（PCR）扩增：PCNA和GAPDH的40个扩增周期（95°C下1分钟，58°C下45秒，72°C下20秒）。使用2-ΔΔCt方法的修改来呈现基因表达。

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蛋白质印迹分析[1]
在有或没有激酶抑制剂的情况下，用不同浓度的IKVAV处理BMMSCs，持续不同的时间段。用裂解缓冲液处理细胞（使用前加入1mm苯甲基磺酰氟）。随后将裂解物在12000g下离心5分钟，收集上清液用于蛋白质分析；使用Bradford蛋白质测定试剂盒测定样品蛋白质浓度。首先将细胞裂解物中等量的蛋白质重新悬浮在含有62 mm Tris-HCl（pH 6.8）、2%十二烷基硫酸钠、10%甘油、5%β-巯基乙醇和0.04%溴酚蓝的样品缓冲液中，然后通过十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在Tris缓冲盐水吐温-20（TBST）（25 mm Tris-HCl（pH 7.5），50 mm NaCl，0.1%吐温-20）中短暂洗涤后，用5%（TBST中）脱脂奶粉封闭膜1小时。将膜在4°C下与适当浓度的一抗一起孵育过夜。在TBST中洗涤后，将膜在第二抗体中孵育30分钟，再次在TBST中将其洗涤并放置在振动台上。使用ECL试剂盒检测印迹，并通过扫描密度法定量信号。在GAPDH表达标准化后，所有数据均表示为对照细胞和处理细胞之间的相对差异。此外，在实验中，PD98059和渥曼青霉素被用来抑制MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt信号。BMMSCs用适当的抑制剂预处理30分钟，然后加入IKVAV。IKVAV处理后24小时进行蛋白质印迹分析。

[1]. The all-D-configuration segment containing the IKVAV sequence of laminin A chain has similar activities to the all-L-peptide in vitro and in vivo. J Biol Chem. 1992 Jul 15;267(20):14118-21.

[2]. IKVAV regulates ERK1/2 and Akt signalling pathways in BMMSC population growth and proliferation. Cell Prolif. 2014 Apr;47(2):133-45.

为了探究上述两条信号通路（IKVAV介导的BMMSC增殖）的激活是否与ERK1/2和Akt的磷酸化功能相关，我们使用了ERK1/2和Akt信号通路抑制剂PD98059和wortmannin。抑制剂处理后，p-ERK1/2和p-Akt水平均下调，PCNA表达和细胞活力也相应降低。因此，我们得出结论，PCNA mRNA的生物合成以及IKVAV诱导的BMMSC的增殖活性均受MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt信号通路的调控。我们的结果表明，Akt和ERK1/2信号通路的失活显著抑制了IKVAV诱导的BMMSC的生长和增殖。 Akt 和 ERK1/2 信号通路在 IKVAV 诱导的 BMMSC 群体生长和增殖中发挥重要作用。
总之，我们阐明了 IKVAV 肽通过激活 Akt 和 ERK1/2 信号通路调控 BMMSC 群体生长和增殖的作用。结果表明，IKVAV 肽刺激了 MAPK/ERK1/2 和 PI3K/Akt 级联反应的激活，促进了 PCNA mRNA 的生物合成和 BMMSC 的增殖。这是首个指出 IKVAV 肽在信号转导水平上调控 BMMSC 生长和增殖的研究。该结果为 IKVAV 接枝支架在基于 BMMSC 的组织工程领域的应用提供了实验证据。[1]

C25H48N6O6

528.69

528.363

131167-89-0

131343

H-Ile-Lys-Val-Ala-Val-OH; L-isoleucyl-L-lysyl-L-valyl-L-alanyl-L-valine

IKVAV

White to off-white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

856.6±65.0 °C at 760 mmHg

471.9±34.3 °C

0.0±0.6 mmHg at 25°C

1.511

1.27

206

7

8

17

37

775

6

CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N

XQQUSYWGKLRJRA-RABCQHRBSA-N

InChI=1S/C25H48N6O6/c1-8-15(6)18(27)23(34)29-17(11-9-10-12-26)22(33)30-19(13(2)3)24(35)28-16(7)21(32)31-20(14(4)5)25(36)37/h13-20H,8-12,26-27H2,1-7H3,(H,28,35)(H,29,34)(H,30,33)(H,31,32)(H,36,37)/t15-,16-,17-,18-,19-,20-/m0/s1

(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-amino-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylbutanoic acid

131167-89-0; H-Ile-Lys-Val-Ala-Val-OH; IKVAV; Ile-lys-val-ala-val; Isoleucyl-lysyl-valyl-alanyl-valine; L-Valine,L-isoleucyl-L-lysyl-L-valyl-L-alanyl-; (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-amino-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-methylbutanoic acid; SCHEMBL180642;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O: 100 mg/mL (189.15 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。