AF40431

IC50: 4.4 µM (sortilin) Kd: 0.7 µM (sortilin)[1]

Sortilin是一种I型膜糖蛋白，属于液泡蛋白分选10蛋白（Vps10p）分选受体家族，在中枢神经系统中表达最丰富。Sortilin已成为调节神经元活力的关键因素，并被认为是一系列疾病的可能治疗靶点。本文报道了首次报道的sortilin小分子配体AF40431的鉴定。通过共结晶获得sortilin-AF40431配合物的晶体，配合物的结构分辨率为2.7Å。AF40431结合在sortilin的神经降压素结合位点，AF40431的亮氨酸部分模仿神经降压素C末端亮氨酸和AF40431 4-甲基伞形酮部分与苯丙氨酸形成π堆叠的结合模式[1]。

闪烁邻近试验[1]
通过闪烁邻近试验（SPA）测量3H-神经降压素与sortilin结合的位移来确定化合物亲和力。实验在测定缓冲液（50mM HEPES pH 7.4，100mM NaCl，2.0 mM CaCl2、0.1%BSA、0.1%吐温-20），总体积为40µl。在加入5 nM 3H-神经降压素和镍螯合物成像珠之前，该化合物在室温下与150 nM sortilin预孵育30分钟。6小时后，在ViewLux上以360秒的曝光时间读取印版。未标记的神经降压素和DMSO空白分别用作阳性和阴性对照。对10个浓度为1a–1h和AF40431的化合物进行剂量反应评估（涵盖2.5 nM至50µM的浓度）。使用XLfit 4中的sigmoid浓度响应（可变斜率）通过非线性回归计算半最大抑制浓度（IC50）值。所有报告的值都是至少四次测定的平均值。

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等温滴定量热法[1]
通过等温滴定量热法（ITC）测量AF40431与sortilin的结合。滴定实验在MicroCal iTC200等温滴定量热计上进行。用pH 7.4的PBS缓冲液透析索替林AF40431溶解在pH 7.4的PBS缓冲液中，该缓冲液补充了4%（v/v）的二甲亚砜（DMSO）。所有溶液都经过过滤和脱气，以避免气泡形成，并在每次实验前平衡到相应的温度。在25°C下，用AF40431（500µM）滴定添加了4%（v/v）DMSO的Sortilin（30µM），分20步，每次2µl（第一步，0.4µl）。注射之间的时间设置为150秒，注射器混合速度设置为1000转/分-1。通过将配体注入补充有4%DMSO的PBS中来测量稀释产生的热量。从反应热中减去该热量，得到有效结合热。最后，通过使用Origin软件分析滴定数据，确定了结合化学计量比（n）、平衡离解常数（Kd）、摩尔焓和结合过程的熵变。

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AF40431荧光光谱[1]
AF40431和sortilin在pH 7.4的PBS缓冲液中稀释至终浓度为0.1µM。在RF-5301PC荧光分光光度计上记录荧光，该光度计分别保持在23±1°C，使用3 nm和5 nm的激发和发射狭缝宽度。通过分别扫描250-430nm和370-600nm的范围来确定激发和发射波长。

[1]. Identification of the first small-molecule ligand of the neuronal receptor sortilin and structure determination of the receptor-ligand complex. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2014 Feb;70(Pt 2):451-60.

The phenol group of the 4-methylumbelliferone moiety of AF40431 is located in the position corresponding to that of Ile12 of NTS in the sortilin–NTS complex (Figs. 5 ▶ a and 5 ▶ b) and, similar to Ile12, the phenol does not seem to contribute to the binding (Quistgaard et al., 2009 ▶). A parallel π-stacking interaction is formed between the 2-pyrone of the 4-methyl­umbelliferone moiety of AF40431 and sortilin. An off-centre stacking is caused by the two electron-rich systems of 2-pyrone and Phe281 (Hunter & Sanders, 1990 ▶). The hydroxyl, ketone and methyl groups of 4-methylumbelliferone are not involved in interactions with sortilin and hence the structure–activity relationship should be explored for this two-ring system. [1]
NTS binds to G-coupled neurotensin receptors (NTSRs) via amino acids 8–13, with the C-terminal leucine forming an electrostatic interaction with an arginine in the binding site (White et al., 2012 ▶). Hence, off-target reactions of AF40431 with the NTSRs could be expected. However, the Ile12 pocket of NTSR1 is narrow and steric clashes between the 4-­methylumbelliferone moiety of AF40431 and Phe128 of transmembrane helix 2 (TM2) and Tyr351 of TM7 in NTSR1 were identified when AF40431 was superimposed on NTS in the NTSR1–NTS complex structure (White et al., 2012 ▶; Fig. 6 ▶ b). No competition of NTS binding to NTSR1 was observed for AF40431 (IC50 > 50 µM; data not shown).[1]
The Calcein Blue moiety has previously been applied as a tracer in cellular and tissue studies (O’Malley et al., 1999 ▶). The fluorescent property of Calcein Blue is retained in AF40431 and the fluorescence is not statically quenched by the π-­stacking with Phe317 upon binding to sortilin (Fig. 6 ▶ c). Hence, AF40431 could be applied as a molecular tracer of sortilin. The identification of AF40431 suggests that sortilin is ligandable by small molecules and thus provides a stimulus to further small-molecule ligand discovery efforts for sortilin.[1]

C17H21NO5

319.3523

319.141

181125-92-8

5391672

White to off-white solid powder

0.4

95.9

3

6

6

23

487

1

O1C(C([H])=C(C([H])([H])[H])C2C([H])=C([H])C(=C(C1=2)C([H])([H])N([H])[C@]([H])(C(=O)O[H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])O[H])=O

YPJLUCAXHFPZJD-ZDUSSCGKSA-N

InChI=1S/C17H21NO5/c1-9(2)6-13(17(21)22)18-8-12-14(19)5-4-11-10(3)7-15(20)23-16(11)12/h4-5,7,9,13,18-19H,6,8H2,1-3H3,(H,21,22)/t13-/m0/s1

(2S)-2-[(7-hydroxy-4-methyl-2-oxochromen-8-yl)methylamino]-4-methylpentanoic acid

AF40431; 181125-92-8; N-[(7-Hydroxy-4-Methyl-2-Oxo-2h-Chromen-8-Yl)methyl]-L-Leucine; CHEMBL3098769; (2S)-2-[(7-hydroxy-4-methyl-2-oxochromen-8-yl)methylamino]-4-methylpentanoic acid; ((7-Hydroxy-4-methyl-2-oxo-2H-chromen-8-yl)methyl)-L-leucine; BDBM50445039; EiM07-28733;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 25 mg/mL (78.28 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。