Rat 5-HT1B Receptor (IC50 = 47 nM)

NAS-181（化合物 (R)-25）（0-1000 nM）可增强大鼠枕叶皮质切片 K+ 刺激的 [3H]-5-HT 释放[1]。给予 NAS-181（3 mg/kg；皮下注射）的大鼠有更多的湿狗奶昔；然而，当给大鼠给予对氯苯丙氨酸 (pCPA)（200 mg/kg；腹膜内注射）作为预处理时，这种效应会被中和[1]。

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NAS181 对已研究的所有其他受体表现出极低的亲和力 (Ki>3000 nM)，例如多巴胺 D1 和 D2、α1-、α2- 和 β- 肾上腺素受体、5-HT2A、5-HT2C、5-HT6、和 5-HT7 和 5-HT2[1]。在预加载的大鼠枕叶皮质切片中，NAS181 (10-1000 nM) 剂量依赖性地增加 K+ 刺激的 [3H]-5-HT 释放 [1]。

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在寻找新的5-羟色胺（5-HT）受体拮抗剂的过程中，发现化合物（R）-（+）-2-[[[3-（吗啉甲基）-2H-色烯-8-基]氧基]甲基]吗啉甲磺酸盐（R）-25/NAS-181是一种选择性大鼠5-羟色胺1B（r5-HT1B）受体拮抗药。结合谱显示，与牛5-HT1B（Ki=630nM；n=1）受体相比，r5-HT1B（Ki-47+/-5nM；n=3）受体的偏好是13倍。该化合物对所检测的其他单胺能受体的亲和力非常低。r5-HT1B受体拮抗作用通过增强K+刺激的[3H]-5-HT从体外灌流的大鼠脑片中的释放来证明，这种作用被向灌流液中添加5-HT所拮抗。[1]
（R）-25/NAS-181对小牛尾状膜5-HT1D受体（主要构成同源牛5-HT1B受体）的亲和力比大鼠r5-HT1B受体低10倍以上。（R） -25对所有其他受试受体的亲和力都很低，包括5-HT2A、5-HT2C、5-HT6和5-HT7、α1-、α2-和β肾上腺素受体，以及多巴胺D1和D2（表2）。[1]
（R）-25/NAS-181的r5-HT1B拮抗特性特征在于K+刺激的[3H]-5-HT从预加载的大鼠枕皮质切片中释放。如表3（R）所示，-25在10-1000nM的浓度范围内剂量依赖性地增强[3H]-5-HT的释放。此外，（R）-25引起的释放增强在1000nM时被拮抗，但在100nM未标记的5-HT进入灌流液时没有被拮抗（表4），这表明这两种化合物之间存在竞争。[1]

在大鼠大脑区域，NAS-181（20 mg/kg；皮下注射）可促进 5-HTP 的积累[1]。
NAS181（1-10 mg/kg；皮下注射）可剂量依赖性地增加额叶、腹侧海马皮层和 VHipp 中的乙酰胆碱 (ACh) 释放量[1]。在四个大鼠大脑区域（纹状体、额叶皮质、海马和下丘脑）中，NAS181（20 mg/kg；皮下注射）使 5-HT 周转率增加约 40%[1]。给予 NAS181（3 mg/kg；皮下注射）的大鼠表现出湿狗奶昔数量显着增加[1]。

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（R） 皮下注射20mg/kg的-25（NAS-181）可增强大鼠四个脑区（下丘脑、海马、纹状体和额叶皮层）的5-HT代谢，用3-羟基苯肼抑制脱羧酶后，5-HTP的积累量约为40%。在3 mg/kg sc（R）-25下，大鼠湿狗奶昔的数量显著增加，这是一种5-HT2A/5-HT2C反应，在用色氨酸羟化酶抑制剂对氯苯丙氨酸预处理后，5-HT的耗竭消除了这种反应。这些观察结果表明，（R）-25通过抑制末端r5-HT1B自身受体，增加了5-HT的周转和5-HT的突触浓度。[1]

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本研究旨在探讨5-羟色胺（1B）受体拮抗剂NAS-181（（R）-（+）-2-（3-吗啉代甲基-2H-色烯-8-基）氧甲基吗啉甲磺酸盐）对大鼠脑内胆碱能、谷氨酸能和GABA能神经传递的影响。通过微透析监测自由运动大鼠不同组额叶皮层（FC）和腹侧海马（VHipp）中乙酰胆碱、谷氨酸和GABA的细胞外水平。NAS-181（1、5或10 mg/kg，皮下注射）引起ACh水平的剂量依赖性增加，在注射后80分钟达到对照组的500%（FC）和230%（VHipp）的最大值。相反，皮下注射10或20mg/kg剂量的NAS-181对这些区域的Glu和GABA的基础细胞外水平没有影响。目前的数据表明，FC和VHipp（与认知功能密切相关的大脑结构）中的ACh神经传递受这些区域胆碱能末端5-HT（1B）异质受体的紧张抑制控制[2]。

放射性配体结合研究。[1]
按照Jackson等人27的描述（括号中的放射性配体和组织）确定了以下受体的亲和力：5-HT1A（[3H]OH-DPAT，大鼠海马）、α1-肾上腺素受体（[3H]哌唑嗪，大鼠皮层）、α2-肾上腺素受体（[3H]RX821002（（1,4-[6,7-3H]苯并二恶烷-2-甲氧基-2-基）-2-咪唑啉盐酸盐，大鼠皮质）、β-肾上腺素受体（~3H]二氢阿普洛尔，大鼠大脑皮层）、多巴胺D1（[3H]1CH-23390，大鼠纹状体）；多巴胺D2（[3H]raclopride、细胞（LtkhD2A）膜）。如Johansson等人所述，测定了以下受体：28 5-HT2A（[3H]酮色林，大鼠皮层）、5-HT2C（[3H]mesulergine，大鼠皮质）、5-HT6（[3H]-5-HT，细胞（CHOr5-HT6）膜）、5-HT7（[3H'-5-HT，电池（CHOr5-T7）膜）。[125I]在60μM异丙肾上腺素存在的情况下，碘氰基吡啶洛尔被用作大鼠大脑皮层膜中r5-HT1B受体的配体，以避免与Hoyer等人所述的β肾上腺素受体结合。根据Heuring和Peroutka的方法，在8-OH-DPAT（100 nM）和美苏利精氨酸（100 nM）存在下，29小牛尾状体膜用于用[3H]-5-HT测定5-HT1D受体，以避免结合5-HT1A和5-HT2C受体；在这三种测定中使用了30μM的5-羟色胺来确定特异性结合。如Ross所述，用[3H]DTG（N，N'-二（邻甲苯基）胍）测定与整个大鼠脑膜中σ受体的结合。

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钾刺激预加载[3H]-5-HT的大鼠皮质切片的[3H]溢出。[1]
使用了Rényi等人描述的方法。将预加载[3H]-5-HT的枕叶皮层切片（0.3×0.3mm）用新鲜氧化的Krebs-Henseleit缓冲液（pH 7.4）进行超灌注，该缓冲液含有2.5μM西酞普兰，流速为0.4mL/min。洗涤50分钟后，收集4分钟的组分，62分钟后，给予含有25mM KCl的缓冲溶液4分钟，然后用原始缓冲液进行超灌注。将切片在缓冲液中以适当浓度用试验化合物超灌72分钟。从98分钟开始，第二次加入25 mM KCl和试验化合物4分钟，然后继续超灌，并在122分钟停止。通过液体闪烁计数各组分中的放射性和切片中的剩余放射性，并确定每个组分的释放百分比。测定第二次刺激（S2）后在试验化合物存在下的释放率与第一次刺激（S1）后的释放率，并将其表示为不含试验化合物的对照中相应比率的百分比。为了评估内在活性，试验化合物和5-HT在同一溶液中给药。

动物/疾病模型： 大鼠[1]
剂量： 20 mg/kg
给药途径： 皮下注射
实验结果： 下丘脑、海马、额叶皮层和纹状体中 5-HTP 的积累显著增加，这些脑区中 5-HIAA/5-HT 的比值甚至更高（40-60%）。

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实验当天，将动物置于 CMA/120 系统（CMA/微透析）中进行初始 2 小时的适应性训练。将 CMA/12 微透析探针（8 mm 轴长，2 mm 膜长）插入手术动物的引导套管中。探针以1 μl/min的恒定流速灌注人工脑脊液（aCSF），该人工脑脊液含有148 mM NaCl、4 mM KCl、0.8 mM MgCl₂、1.4 mM CaCl₂、1.2 mM Na₂HPO₄、0.3 mM NaH₂PO₄，pH 7.2和0.5 μM新斯的明。经过120分钟的稳定期后，使用CMA/170型冷冻馏分收集器（CMA/Microdialysis）每20分钟收集一次样品。前4个样品用于测定ACh、Glu和GABA的细胞外基础水平，之后，将药物（NAS-181）皮下注射到颈背部。继续收集馏分3小时。 [2]

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5-HT 在各脑区的代谢率。[1]
通过皮下注射 5-羟色氨酸脱羧酶抑制剂 3-羟基苄肼二盐酸盐 (NSD 1015)（100 mg/kg），测定大鼠下丘脑、海马、额叶皮层和纹状体中 5-羟色氨酸 (5-HTP) 的积累量，从而测定 5-HT 的代谢率。在皮下注射 NSD 1015 前 30 分钟皮下注射测试化合物，30 分钟后处死大鼠。迅速解剖出各脑区，用干冰冷冻，并储存于 -70 °C。采用高效液相色谱法 (HPLC) 分析 5-HTP、5-HT 和 5-羟基吲哚乙酸 (5-HIAA)。

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湿狗抖动行为的测定。 [1]
在注射测试化合物后 5 分钟开始，测定 60 分钟内湿狗的抖动次数，包括全身抖动和头部抖动。每组使用 8-10 只大鼠，并与生理盐水处理的大鼠（n = 30）进行比较。

[1]. (R)-(+)-2-[[[3-(Morpholinomethyl)-2H-chromen-8-yl]oxy]methyl] morpholine methanesulfonate: a new selective rat 5-hydroxytryptamine1B receptor antagonist. J Med Chem. 1998 May 21;41(11):1934-42.

[2]. Effects of the 5-HT1B receptor antagonist NAS-181 on extracellular levels of acetylcholine, glutamate and GABA in the frontal cortex and ventral hippocampus of awake rats: a microdialysis study. Eur Neuropsychopharmacol. 2007 Sep;17(9):580-6.

(R)-25 的受体谱表明，该化合物是一种选择性 5-HT1B 受体配体，具有中等至高的效力。由于 (R)-25 对小牛尾状核中的 5-HT1D 受体亲和力较低（小牛尾状核主要由牛 5-HT1B 受体组成），因此 (R)-25 的受体谱与 2'-甲基-4'-(5-甲基[1,2,4]恶二唑-3-基)联苯-4-羧酸[4-甲氧基-3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]酰胺 (GR127,935) 的受体谱不同。GR127,935 对 5-HT1B 受体的两种同源形式均具有高亲和力，并且对 5-HT1D 受体也具有高亲和力。 (R)-25 对后一种受体类型的亲和力尚待阐明。
在体外模型中，(R)-25 增强了灌流大鼠枕叶皮层切片中 K⁺ 刺激的 [³H]-5-HT 释放，并且 (R)-25 与 5-HT 之间存在竞争性拮抗作用，表明 (R)-25 是该受体的拮抗剂。此外，(R)-25 显著增加了 3-羟基苄肼处理的大鼠所有四个检测脑区中 5-HTP 的积累，并进一步提高了脑内 5-HIAA/5-HT 的比值。这些发现提示，这些 5-HT 末端区域的 5-HT 周转率增加，这可能是由于末端 5-HT 释放增加所致。(R)-25 诱导的湿狗样摇晃行为与这一观点高度吻合，因为用 pCPA 耗竭脑内 5-HT 后，该反应消失。这些观察结果表明，在正常情况下，末端5-HT1B受体在决定末端释放的5-HT量方面发挥着功能性作用。
由于(R)-25是一种选择性5-HT1B受体拮抗剂，因此该化合物可能成为研究啮齿动物中5-HT1B受体功能作用的宝贵工具。[1]

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这些报告为通过微透析取样在清醒大鼠中检测5-HT1B受体拮抗剂NAS-181对细胞外Glu和GABA水平的影响提供了理论依据。如图3和图4所示，皮下注射剂量高达20 mg/kg的NAS-181对海马和皮质细胞外谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）浓度没有影响。对此的一种可能解释是，在体内条件下，谷氨酸能和GABA能神经元仅受到抑制性5-HT1B异源受体的微弱调控。另一种可能的解释与微透析技术在监测神经元释放的Glu和GABA池方面的局限性有关。细胞外Glu和GABA的来源既包括神经元也包括胶质细胞，而微透析技术能否检测到神经元来源的Glu和GABA，最近有研究提出了质疑（Timmerman和Westerink，1997）。据我们所知，目前只有少数微透析研究探讨了5-HT1B受体对Glu和GABA释放的调节作用。因此，Srkalovic等人…… (1994) 观察到，给予 5-HT1B 受体激动剂 TMFPP 后，基础谷氨酸 (Glu) 水平降低；而非选择性 5-HT 受体拮抗剂美特戈林则显著增加了视交叉上核的细胞外谷氨酸水平。另一项研究发现，在大鼠额叶皮层 (FC) 中，藜芦碱诱导的细胞外谷氨酸和天冬氨酸 (Asp) 水平升高可被 CP-93,129 共同灌注所减弱 (Golembiowska 和 Dziubina, 2002)。然而，这项微透析研究以及上述涉及电生理记录的研究均是在强刺激条件下并使用 5-HT1B 受体激动剂进行的，这使得我们难以得出关于 5-HT1B 受体对大鼠脑内谷氨酸能和 GABA 能神经元可能存在的持续性调节活性的结论。然而，本研究结果表明，NAS-181对乙酰胆碱（ACh）释放的强效刺激作用不太可能是通过解除额叶皮层（FC）和腹侧海马（VHipp）区域GABA能传入纤维或中间神经元的抑制作用介导的，而是通过胆碱能神经末梢的5-HT1B异源受体对ACh神经传递进行直接抑制性调控。
总之，本微透析研究表明，全身性给予5-HT1B受体拮抗剂NAS-181可显著且剂量依赖性地增加清醒大鼠额叶皮层和腹侧海马的细胞外ACh水平。谷氨酸（Glu）和GABA的浓度不受影响。这些结果提示ACh神经传递受到5-HT1B异源受体的持续性抑制性调控。大鼠基底前脑胆碱能末梢或细胞体水平的 5-HT1B 异源受体的具体作用机制尚需通过双探针微透析方法进行进一步研究。[2]

C20H30N2O7S

442.53

442.17737

C, 54.28; H, 6.83; N, 6.33; O, 25.31; S, 7.24

205242-62-2

NAS-181 dimesylate;1217474-40-2; 205242-61-1

9955014

Typically exists as solid at room temperature

765ºC at 760 mmHg

416.5ºC

1.31E-24mmHg at 25°C

2.598

177.69

2

9

5

30

545

1

CS(O)(=O)=O.CS(O)(=O)=O.O1CCN(CC2=CC3C=CC=C(OCC4CNCCO4)C=3OC2)CC1

JDFGAOJLDPTWBF-UNTBIKODSA-N

InChI=1S/C19H26N2O4.CH4O3S/c1-2-16-10-15(12-21-5-8-22-9-6-21)13-25-19(16)18(3-1)24-14-17-11-20-4-7-23-17;1-5(2,3)4/h1-3,10,17,20H,4-9,11-14H2;1H3,(H,2,3,4)/t17-;/m1./s1

methanesulfonic acid;(2R)-2-[[3-(morpholin-4-ylmethyl)-2H-chromen-8-yl]oxymethyl]morpholine

NAS-181; 205242-62-2; FU2LC28NCH; NAS181; UNII-FU2LC28NCH;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。