P2Y1 receptor

MRS2179抑制血小板聚集[3]
在ADP（1μM）前30秒将MRS2179（10μM）添加到洗涤的人血小板中，抑制了血小板聚集和形状变化（图1A），而单独使用MRS2179即使在高浓度下（高达100μM，数据未显示）也不会诱导形状变化或聚集。通过在不同浓度的MRS2179存在下生成ADP的一系列浓度-反应曲线来确定抑制的性质。MRS2179导致浓度-反应曲线向右平行移动，但高浓度ADP可以完全覆盖高浓度MRS2179（图1B）。Schild抑制分析得出pA2值为6.55±0.05（n=5），斜率为0.64，这可以用我们观察到涉及两种受体（P2Y1和P2cyc）激活及其转导机制的整合聚集过程来解释。使用洗涤的大鼠血小板获得了相同的结果，MRS2179抑制ADP诱导的血小板聚集，浓度-反应曲线向右平行移动，pA2值为6（数据未显示）。

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MRS2179仅影响P2Y1受体转导途径[3]
ADP分别通过激活P2Y1和P2cyc受体，诱导细胞内Ca2+储存的同时动员和腺苷酸环化酶的抑制。在2 mM外部Ca2+存在（图2A，左）或不存在（数据未显示）的情况下，0.5μM ADP在洗涤的人血小板中诱导的细胞内Ca2+升高被3μM MRS2179完全抑制。MRS2179以剂量依赖的方式改变了1μM ADP对[Ca2+]i的增加，IC50=0.26μM（图2A，右）。在洗涤的大鼠和小鼠血小板中观察到ADP诱导的[Ca2+]i升高的类似抑制作用（数据未显示）。

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[33P]MRS2179是估算P2Y1位点数量和亲和力的合适放射性配体[3]
ADP与其血小板受体结合的研究目前使用[33P]2MeSADP进行，这是一种与P2Y1和P2cyc Gachet等人结合的放射性配体，1995年，Hechler等人，1998a，Léon等人，1999b。另一方面，在我们看来，MRS2179是用作P2Y1特异性放射性配体的良好候选者。首先，为了验证MRS2179仅从P2Y1受体置换[33P]2MeSADP，我们比较了其与A3P5P的作用，A3P5P是一种众所周知的P2Y1受体拮抗剂，Hechler等人，1998b，Léon等人，1999b。[33P]2MeSADP与洗涤过的人血小板的特异性结合被MRS2179（Ki=111 nM）和A3P5P（Ki=0.25±0.06μM，数据未显示）在约20%的[33P]2MeSADP位点竞争性地部分置换（图3A）。在初步测定中，在+4°C、+20°C、+37°C三个不同温度下测试了[33P]MRS2179与洗涤血小板的结合。最佳条件为20°C，结合与血小板浓度成正比，在20°C下30秒至1分钟后获得最大结合，稳定至少30分钟（数据未显示）。所有后续的饱和实验均使用6×105/ml的血小板浓度和20°C下30分钟的孵育时间进行。[33P]MRS2179与洗涤过的人血小板的特异性结合是饱和的（图3B），具有线性Scatchard图（插入），每个血小板有134±8个结合位点，亲和力（Kd）为109±18 nM（n=3）。通过测量[33P]MRS2179与用P2Y1受体或单独用载体转染的星形细胞瘤细胞（1321 NI）的结合，证实了这一结果。在用P2Y1转染的细胞中，显示出正常的药理学选择性和信号传导特性，每个细胞的结合位点数量为162500±7500，Kd为138±8nM（n=3），而对照细胞没有显示出[33P]MRS2179的结合。观察到小鼠血小板P2Y1受体具有类似的亲和力（数据未显示）。

MRS2179（50 mg/kg；腹膜内注射）可延长出血持续时间[3]。
注射MRS2179（50mg/kg）后30秒，与对照组小鼠相比，MRS2179治疗组小鼠的出血时间显著延长，这反映了体内原发性止血（图5C）。MRS2179治疗小鼠的平均出血时间（±S.D.）为595±189秒（范围120-1200秒，n=4），对照组小鼠的平均流血时间（范围68-110秒，n=6）为83.5±5.7秒，两组之间的差异具有统计学意义（P<0.01，非配对t检验）。MRS2179治疗的大鼠出血时间也延长（数据未显示）。

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MRS2179体外抑制血小板聚集[3]
为了测试MRS2179在外核苷酸酶存在下的稳定性，我们用0.1 U/ml的阿普啶虫酶孵育2小时后测量了可能的降解产物。孵育前（图4A1）和孵育后（图4A2）MRS2179的HPLC图谱是相同的。因此，MRS2179在apyrase存在下是化学稳定的。在富含柠檬酸血小板的血浆中孵育MRS2179 2小时不影响MRS2179对ADP诱导的血小板聚集的抑制活性（数据未显示）。此外，当MRS2179（100μM）与洗涤过的血小板一起孵育2小时时，ADP诱导的聚集仍然受到抑制（图4B），证实了MRS2179的稳定性。随后将MRS2179静脉注射到麻醉的大鼠体内，以研究ADP诱导的离体聚集。在注射50mg/kg后的不同时间点采集血液样本，以追踪化合物的活性。在MRS2179治疗的大鼠富含柠檬酸血小板的血浆中，注射MRS2179后5分钟，ADP浓度高达10μM时，ADP诱导的血小板聚集受到抑制（图5A、B）。在该剂量（50mg/kg）下，对30μM ADP的聚集反应持续存在，但与对照组相比有所减少（图5A，B）。

腺苷酸环化酶活性的测定[3]
将450-μl洗涤过的血小板重新悬浮在含有2 mM Ca2+和1 mM Mg2+的Tyrode缓冲液中，在聚集计比色皿中以1100 rpm的速度搅拌，并以30秒的间隔加入以下试剂：（i）10μM前列腺素E1，（ii）1μM AR-C66096MX或不同浓度的MRS-2179，以及（iii）5μM ADP或载体（Tyrode不含Ca2+或Mg2+的缓冲液）。1分钟后，通过加入50μl冰冷的6.6N高氯酸停止反应。将高氯酸提取物在11000×g下离心5分钟以消除蛋白质沉淀，并使用三辛胺和氟利昂（28:22，vol/vol）的混合物从上清液中分离出环AMP。将上层水相冻干，将干燥残渣溶解在配有用于环AMP测量的商业放射免疫测定试剂盒的缓冲液中。

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绑定研究[3]
如早期工作所述（Gachet等人，1995），在37°C下测定[33P]2MeSADP（850 Ci/mmol）与洗涤血小板的竞争性结合5分钟。在20°C下，在3 ml聚丙烯管（最终体积为1 ml）中测量[33P]MRS-2179（2000 Ci/mmol）与含0.01%不含人血清白蛋白脂肪酸的Tyrode缓冲液中洗涤的人血小板的结合30分钟，并通过同位素稀释确定饱和度。通过向反应混合物中加入洗涤过的血小板开始反应，所有实验均进行三次。非特异性结合，通过在1 mM未标记的A3P5P存在下孵育确定，约占总结合的10-15%。 在适当的未标记配体浓度增加的情况下，使用单一浓度的放射性标记配体[33P]MRS-2179（0.5 nM，200.000 dpm）或[33P]2MeSADP（0.2 nM，200000 dpm）进行饱和和置换实验。通过加入冰冷的Tyrode缓冲液并在真空下通过Whatman GF/C玻璃纤维过滤器快速过滤来终止反应，之后将试管和过滤器冲洗两次。通过闪烁计数（Wallac 1409β计数器，计数率（DPM/CPM±S.E.M.）：1.070±0.0018；芬兰图尔库），并使用EBDA-LIGAND程序对数据进行分析（Munson和Rodbard，1980）。使用GraphPad软件包计算放射性配体的解离常数（Kd）和药物的抑制常数（Ki）。

如前所述，在火鸡红细胞膜中测量了腺嘌呤核苷酸类似物对P2Y1受体促进的肌醇磷酸形成的刺激。K0.5值是每种化合物3-8条独立测定的浓度-效应曲线的平均值。简言之，将1 mL经洗涤的火鸡红细胞在含有0.5 mCi 2-[3H]肌-肌醇（20 Ci/mmol；American Radiolabeled Chemicals，股份有限公司，St.Louis，MO）的无肌醇培养基中，在37°C的95%空气/5%CO2的湿润气氛中孵育18-24小时。如上所述，通过在低张力缓冲液（5 mM磷酸钠，pH 7.4，5 mM MgCl2，1 mM EGTA）中快速裂解制备红细胞重影。36在含有424μM CaCl2、0.91 mM MgSO4、2 mM EGTA、115 mM KCl、5 mM KH2PO4和10 mM Hepes（pH 7.0）的培养基中，在25μL[3H]肌醇标记的重影（约175μg蛋白质，200-500000 cpm/次）中测量磷脂酶C活性。测定（最终体积为200μL）含有1μM GTPγS和指定浓度的核苷酸类似物。将幽灵在30°C下孵育5分钟，并通过阴离子交换色谱法对总[3H]肌醇磷酸盐进行定量，如前所述[1]。

动物/疾病模型： CL57BLr6 小鼠[3]
剂量： 50 mg/kg
给药途径： 小鼠颈静脉注射
实验结果： 经MRS-2179处理的小鼠，在注射MRS-2179后30秒，出血时间显著延长，反映了体内初级止血功能。

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离体研究[3]
体重300 g的雄性Wistar大鼠，腹腔注射200 μl盐酸赛拉嗪（0.2 mg/kg）和氯胺酮（1 mg/kg）进行麻醉。在零时点，将MRS-2179（50 mg/kg）或载体注射到阴茎静脉。 5分钟后，从腹主动脉抽取6.3 ml血液至含有0.7 ml 3.15%柠檬酸钠的注射器中，并立即在室温下以1570×g离心70秒。去除柠檬酸盐处理的富血小板血浆（cPRP），并用贫血小板血浆（PPP）将血小板浓度调整至5×10⁵/μl。如上所述，在对照组和MRS-2179处理组大鼠的柠檬酸盐处理的富血小板血浆中测定血小板聚集率。体内研究[3]：向小鼠颈静脉注射MRS-2179（50 mg/kg）或载体后1分钟测量出血时间。CL57BL/6小鼠由Iffa Credo饲养。体重20-30克的雄性小鼠经腹腔注射150微升含0.2%赛拉嗪碱和1%氯胺酮的生理盐水混合液进行麻醉。小鼠尾部距尾尖3毫米处截断，立即浸入37℃的等渗0.9%氯化钠缓冲液中。出血时间定义为止血所需的时间。

[1]. Synthesis, biological activity, and molecular modeling of ribose-modified deoxyadenosine bisphosphate analogues as P2Y(1) receptor ligands. J Med Chem. 2000;43(5):829-842.

[2]. von Kügelgen I. Pharmacological profiles of cloned mammalian P2Y-receptor subtypes. Pharmacol Ther. 2006;110(3):415-432.

[3]. Inhibition of platelet function by administration of MRS2179, a P2Y1 receptor antagonist. Eur J Pharmacol. 2001;412(3):213-221.

我们研究了腺苷-3',5'-二磷酸酯作为P2Y(1)受体拮抗剂的构效关系，揭示了N(6)-甲基的增强效力作用以及核糖部分取代的可能性（Nandanan等，J. Med. Chem. 1999, 42, 1625-1638）。我们引入了受限的碳环（以探究糖环褶皱的作用）、与腺嘌呤部分连接的非糖苷键以及磷酸基团的转移。通过测定每种类似物刺激火鸡红细胞膜中磷脂酶C的能力（激动剂效应）以及抑制30 nM 2-甲基硫代腺苷-5'-二磷酸酯诱导的磷脂酶C刺激的能力（拮抗剂效应），表征了其在P2Y(1)受体上的生物活性。在某些情况下，引入N(6)-甲基可将纯激动剂转化为拮抗剂。一种碳环N(6)-甲基-2'-脱氧腺苷二磷酸类似物是纯P2Y(1)受体拮抗剂，其效力与核糖类似物(MRS-2179)相当。在一系列环约束的甲氧基碳衍生物中，稠合的环丙烷部分将核苷的假糖环限制为假旋转循环中定义的北式(N)或南式(S)构象，其中6-NH(2) (N)-类似物是纯激动剂，EC(50)为155 nM，其效力比相应的(S)-异构体高86倍。 2-氯-N(6)-甲基-(N)-甲氧基碳类似物是IC50为51.6 nM的拮抗剂。因此，核糖环的(N)构象似乎在P2Y(1)受体的识别中更占优势。环丁基类似物是IC50为805 nM的拮抗剂，而含吗啉环的类似物几乎没有活性。脱水己糖醇环修饰的二磷酸衍生物作为激动剂(6-NH2)或拮抗剂(N(6)-甲基)表现出微摩尔级的效力。强效拮抗剂的能量最小化结构的分子模型表明，两个磷酸基团可能占据共同区域。(N)-和(S)-甲氧基碳激动剂类似物被对接至先前报道的P2Y(1)受体模型的假定结合位点。 [1]

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膜结合的P2受体介导细胞外核苷酸在细胞间信号传导中的作用。P2X受体是配体门控离子通道，而P2Y受体属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族。目前，P2Y家族由8种人类亚型组成，这些亚型已被克隆并进行了功能鉴定；在许多脊椎动物中也发现了物种同源物。P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y11受体均与磷脂酶C的激活偶联。P2Y11受体还介导腺苷酸环化酶的激活。相反，P2Y12、P2Y13和P2Y14受体的激活会导致腺苷酸环化酶活性的抑制。 P2Y1受体的表达广泛。该受体参与血小板聚集、血管舒张和神经调节。它可被ADP及其类似物激活，包括2-甲基硫代-ADP（2-MeSADP）。2'-脱氧-N6-甲基腺苷-3',5'-二磷酸（MRS-2179）和2-氯-N6-甲基-(N)-甲氧基碳-2'-脱氧腺苷-3',5'-二磷酸（MRS2279）是强效且选择性的拮抗剂。P2Y2转录本分布丰富。其功能的一个重要例子是控制气道上皮细胞中的氯离子流。P2Y2受体可被UTP和ATP激活，并可被苏拉明阻断。P2Y2激动剂二喹福索用于治疗干眼症。 P2Y4受体表达于胎盘和上皮细胞中。人P2Y4受体对UTP作为激动剂具有很强的亲和力，而大鼠P2Y4受体对UTP和ATP的激活作用大致相同。P2Y4受体不被苏拉明阻断。P2Y6受体广泛分布于心脏、血管和大脑等组织中。该受体对UDP作为激动剂具有亲和力，并可被1,2-二-(4-异硫氰酸苯基)乙烷（MRS2567）选择性阻断。P2Y11受体可能在免疫细胞分化中发挥作用。人P2Y11受体可被天然存在的激动剂ATP激活，并可被苏拉明和活性蓝2（RB2）阻断。P2Y12受体在血小板聚集以及神经元细胞抑制中起着至关重要的作用。 P2Y12受体可被ADP激活，尤其能被2-甲基硫代ADP强效激活。核苷酸拮抗剂，包括N6-(2-甲基硫代乙基)-2-(3,3,3-三氟丙基硫代)-β,γ-二氯亚甲基-ATP（=坎格瑞洛；AR-C69931MX）、核苷类似物AZD6140以及噻吩并吡啶类化合物氯吡格雷和普拉格雷的活性代谢物，均可阻断该受体。这些P2Y12受体拮抗剂在药物治疗中用于抑制血小板聚集。P2Y13受体表达于免疫细胞和神经元细胞，同样可被ADP和2-甲基硫代ADP激活。 2-氯-5-硝基吡哆醛磷酸类似物6-(2'-氯-5'-硝基偶氮苯基)-吡哆醛-α5-磷酸 (MRS2211) 是一种选择性拮抗剂。编码人P2Y14受体的mRNA存在于多种组织中。然而，该受体的生理功能尚未明确。UDP-葡萄糖及其类似物作为激动剂发挥作用；目前尚不清楚其拮抗剂。此外，有报道称UDP可作为另一种激动剂作用于半胱氨酰白三烯受体——这表明这些受体具有双重激动剂特异性。 [2]

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本研究测定了强效P2Y1受体拮抗剂N6-甲基-2'-脱氧腺苷-3',5'-二磷酸（MRS-2179）对体外、离体腺苷-5'-二磷酸（ADP）诱导的血小板聚集以及体内出血时间的影响。在洗涤血小板悬液中，MRS-2179抑制了ADP诱导的血小板形态改变、聚集和Ca2+升高，但对ADP诱导的腺苷酸环化酶抑制无影响。使用新型放射性配体[33P]MRS-2179的结合研究表明，洗涤的人血小板每个血小板具有134±8个结合位点，亲和力（Kd）为109±18 nM。最后，静脉注射MRS-2179可抑制大鼠血小板对ADP的聚集反应，并延长大鼠或小鼠的出血时间，与对照组相比。这些结果表明，这种强效的P2Y1受体拮抗剂有望成为评估靶向P2Y1受体的药物在体内抗血栓治疗中作用的有效工具。[3]

C11H13N5NA4O9P2

513.16

512.977

C, 25.75; H, 2.55; N, 13.65; Na, 17.92; O, 28.06; P, 12.07

1454889-37-2

MRS2179 tetrasodium hydrate; 101204-49-3

90479745

Typically exists as solid at room temperature

210

1

13

5

31

594

3

[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].CNC1N=CN=C2N([C@@H]3C[C@H](OP([O-])(=O)[O-])[C@@H](COP([O-])(=O)[O-])O3)C=NC=12

XLPQPYQWGFCKEY-IDAKGYGSSA-J

InChI=1S/C11H17N5O9P2.4Na/c1-12-10-9-11(14-4-13-10)16(5-15-9)8-2-6(25-27(20,21)22)7(24-8)3-23-26(17,18)19;;;;/h4-8H,2-3H2,1H3,(H,12,13,14)(H2,17,18,19)(H2,20,21,22);;;;/q;4*+1/p-4/t6-,7+,8-;;;;/m0..../s1

tetrasodium;[(2R,3S,5S)-5-[6-(methylamino)purin-9-yl]-2-(phosphonatooxymethyl)oxolan-3-yl] phosphate

MRS 2179 tetrasodium salt; 1454889-37-2; MRS2179TetrasodiumSalt; tetrasodium;[(2R,3S,5S)-5-[6-(methylamino)purin-9-yl]-2-(phosphonatooxymethyl)oxolan-3-yl] phosphate; MRS 2179 tetrasodium;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。