Z62954982 (ZINC08010136)

Rac1 (IC50=12 μM)
Rac1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1). Z62954982 is a selective Rac1 inhibitor. It functions by disrupting the interaction between Rac1 and its guanine nucleotide exchange factor (GEF) Tiam1, thereby preventing Rac1 activation (GTP loading).

Z62954982（5-100 μM；作用4小时）可浓度依赖性地降低细胞内Rac1-GTP水平，对人平滑肌细胞（SMC）的抑制作用最强，IC50值为12.2 μM[1]。在培养的SMC中，Z62954982（25 μM；作用4小时）的抑制作用最强（86.0%），并显著降低了Rac1-GTP/Rac1的比值[1]。在HDMEC和HUVEC单层细胞中，Z62954982（10-100 μM；作用72小时）可浓度依赖性地降低跨内皮电阻（TER）[2]。

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在培养的平滑肌细胞 (SMC) 中，25 uM Z62954982 可显著降低 Rac1-GTP 与总 Rac1 的比值，抑制率达 86%。在内皮细胞中（10-100 uM，处理 72 小时），它可导致跨内皮电阻呈浓度依赖性下降，反映出其对细胞屏障功能的影响。

Z62954982（腹腔注射；隔日10 mg/kg或每日20 mg/kg；持续3周）已被证实可降低bcr-/-和abr-/-小鼠缺氧反应中肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的p38磷酸化水平和IL-6释放[3]。此外，该药物未显示明显的毒性。

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在体内，Z62954982 以腹腔注射（ip）的方式给药，小鼠模型中剂量为每隔一天 10 mg/kg 或每天 20 mg/kg。研究表明，Z62954982 能抑制视网膜外植体培养中阴极导向的细胞生长，并被用于研究 Rac1 在血管屏障功能和神经元发育中的作用。

无细胞结合实验不适用于Rac1抑制剂，因为它们的作用机制是通过破坏蛋白质-蛋白质相互作用而非结合活性位点。表面等离子共振（SPR）或荧光偏振实验可用于检测Z62954982与纯化的Rac1或Rac1/Tiam1复合物的结合，但功能性实验通常在细胞中进行。

体外细胞增殖实验和流式细胞术细胞周期分析[3]
将雄性 bcr−/−、abr−/− 和野生型 FVB/J 小鼠的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs，第 3 代）接种于 6 孔板（1×10⁴ 个细胞/孔），并在无血清培养基中培养 24 小时。通过流式细胞术分析确认细胞同步化有效。然后将细胞置于常氧或低氧（5% O₂）条件下，并分别加入或不加入 25 µmol/L 的 Rac 抑制剂 Z62954982（ZINC08010136）。Z62954982 用 DMSO（二甲基亚砜）配制成浓缩储备液。培养基中 DMSO 的最终浓度为 0.1%；对照孔仅加入 0.1% DMSO。 Z62954982未表现出细胞毒性作用，因为经药物处理的PASMC细胞活力约为95%，与0.1% DMSO处理的PASMC细胞活力相当。培养基每2天更换一次。5天后，收集上清液用于IL-6的测定。细胞经胰蛋白酶消化后计数。然后用70%乙醇固定PASMC细胞，并与染色液（20 µg/ml碘化丙啶、0.2 mg/ml无DNase的RNase、0.01% Triton-100，溶于PBS）孵育。使用流式细胞仪分析细胞周期。PASMC细胞的增殖指数计算公式为：(S+G2/M)/(G0/G1+ S + G2/M) ×100%。 G0/G1、S、G2/M 分别代表处于 G0/G1 期、S 期和 G2/M 期的细胞百分比。

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定量实时 PCR[3]
为了分离 RNA 和蛋白质，将来自 Bcr−/−、Abr−/− 和 WT 小鼠的第 3 代肺动脉平滑肌细胞 (PASMC) 接种于 10 cm 培养皿中（3×10⁴ 个细胞/皿）。将细胞置于常氧或低氧（5% O₂）培养箱中，分别用 DMSO 或 Z62954982（25 µmol/L，溶于 DMSO）处理 5 天。每隔一天更换一次培养基。对于 Z62954982 处理的细胞，在更换培养基的同时添加新鲜的 Z62954982。第5天，收集细胞，用PBS洗涤3次，刮取细胞，用于RNA提取（RNA迷你试剂盒）或蛋白质分离（见下文）。取2 µg RNA反转录为cDNA。

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在细胞 Rac1 激活实验中，细胞先用 Z62954982 处理，然后用 Rac1 激活剂（例如 PDGF-BB）刺激。裂解后，使用 Rac1 结合域的 GST 融合蛋白（例如 PAK-PBD）下拉活性 Rac1（GTP 结合型）。然后通过蛋白质印迹法定量沉淀的 Rac1 量。细胞活力和屏障功能通过标准方法进行评估。

动物/疾病模型：雄性 bcr-/-、abr-/- 和野生型小鼠（8 至 10 周龄同窝小鼠）暴露于低氧（10% O2）或常氧（21% O2）环境 3 周[3]
剂量：10 mg/kg 或 20 mg/kg
给药途径：腹腔注射；隔日 10 mg/kg 或每日 20 mg/kg；持续 3 周
实验结果：在小鼠低氧条件下，p38 MAPK 磷酸化增强，IL-6 水平升高。

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雄性 bcr−/−、abr−/− 和野生型小鼠（8 至 10 周龄同窝小鼠）暴露于低氧（10% O2）或常氧（21% O2）环境 3 周。在体内Rac1抑制剂治疗实验中，我们采用腹腔注射（ip）的方式，每隔一天以10 mg/kg的剂量注射Z62954982，或每天以20 mg/kg的剂量注射Z62954982。对照组小鼠注射等体积的溶剂（DMSO：玉米油=1∶9）。在治疗期间和治疗结束时，我们监测了暴露于常氧环境的溶剂组和Z62954982治疗组的野生型小鼠，观察是否存在明显的药物毒性迹象。然而，未发现任何毒性迹象。两组小鼠骨髓中的髓系细胞数量相当，肾脏（数据未显示）和肝脏均未见异常[3]。

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标准的体内实验方案包括将雄性小鼠（例如，bcr-/-、abr-/-）暴露于低氧环境（10% O2）3周。Z62954982以10 mg/kg的剂量隔日腹腔注射，或以20 mg/kg的剂量每日腹腔注射。实验终点包括测量肺血管阻力、使用伊文思蓝染料评估血管渗漏，以及分析肺组织中Rac1激活及其下游信号通路。

未见报道。文献中没有关于Z62954982的药代动力学数据。作为一种小分子（分子量375.42），其吸收、分布、代谢和排泄特性尚未明确，但通常采用腹腔注射进行体内研究，提示其口服生物利用度可能有限。

未报告。目前尚无该研究化合物的正式毒理学数据。靶向毒性可能包括破坏多种组织中Rac1的关键功能，因为Rac1对细胞迁移、黏附和活性氧产生等过程至关重要。

[1]. Virtual Screening Approach for the Identification of New Rac1 Inhibitors. J Med Chem. 2009 Jul 23;52(14):4087-90.

[2]. Activation of RhoA, but Not Rac1, Mediates Early Stages of S1P-Induced Endothelial Barrier Enhancement. PLoS One. 2016 May 17;11(5):e0155490.

[3]. Lack of BCR and Abr Promotes Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension in Mice. PLoS One. 2012;7(11):e49756.

Rac1蛋白参与动脉粥样硬化斑块形成的多个过程，是心血管疾病潜在的新药理学靶点。本文介绍了一种药效团虚拟筛选方法，并结合分子对接计算，最终鉴定出五种新的Rac1抑制剂。这些化合物在降低细胞内Rac1-GTP水平方面比参考化合物NSC23766更有效，因此支持将该方法应用于新型Rac1抑制剂的开发。[1]

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内皮屏障功能受损是炎症的标志。Rho家族GTP酶在调节内皮屏障功能中起着至关重要的作用，但它们的确切作用，尤其是在鞘氨醇-1-磷酸（S1P）诱导的内皮屏障增强中的作用，仍不清楚。我们使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）或人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）的融合培养物来模拟内皮屏障。采用电细胞-基质阻抗传感器（ECIS）测量跨内皮电阻（TER）以评估屏障功能。研究了Rac1和RhoA在S1P诱导的屏障增强中的作用。结果表明，使用Z62954982进行Rac1的药理学抑制未能阻断S1P诱导的屏障增强。同样，表达显性失活形式的Rac1或使用siRNA敲低天然Rac1也未能阻断S1P诱导的TER升高。相反，使用Rhosin和Y16抑制剂联合阻断RhoA显著降低了S1P诱导的TER升高。使用荧光共振能量转移（FRET）生物传感器实时评估RhoA激活情况表明，S1P主要增加细胞边缘和连接处的RhoA激活。此外，细胞边缘肌球蛋白轻链-2磷酸化水平的升高以及细胞间连接附近F-肌动蛋白和黏着斑蛋白的增加也促进了这一过程，而这些变化可通过RhoA的药理学抑制来阻断。这些结果表明，S1P可以激活细胞周边的RhoA，刺激肌动蛋白细胞骨架和黏着斑的局部激活，从而增强内皮屏障功能。然而，S1P诱导的Rac1激活似乎在此过程中并不发挥重要作用。[2]

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背景：Bcr和Abr是GTP酶激活剂，它们在体内特异性地下调某些细胞类型中小GTP酶Rac的活性。Rac1在平滑肌细胞中表达，而平滑肌细胞是肺动脉高压发病机制中的关键细胞类型。缺氧相关性肺动脉高压的分子机制尚不清楚。方法/主要发现：本研究比较了Bcr和Abr基因敲除小鼠与野生型对照小鼠在缺氧暴露后肺动脉高压的发生情况。此外，本研究还培养了这些小鼠的肺动脉平滑肌细胞，并在缺氧条件下检测了其增殖、p38激活和IL-6的产生。结果显示，Bcr或Abr基因敲除小鼠在缺氧暴露后表现出右心室压力升高、心肌肥大和肺血管重塑。肺血管周围白细胞浸润增加，并且在缺氧条件下，bcr-/-和abr-/-巨噬细胞产生的活性氧（ROS）增加。与炎症和氧化应激在肺动脉高压相关血管损伤中的作用一致，Bcr和Abr基因敲除小鼠在缺氧暴露后表现出内皮细胞渗漏增加。在缺氧处理下，Bcr 或 Abr 缺陷小鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖速度也比野生型小鼠更快。此外，在 Bcr 或 Abr 缺失的情况下，这些细胞中活化的 Rac1、磷酸化的 p38 和白细胞介素-6 的水平升高。使用新型 Rac 抑制剂 Z62954982 抑制 Rac1 的活化，可降低缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞的增殖、p38 磷酸化和 IL-6 水平。结论：Bcr 和 Abr 通过抑制 Rac1 活性，从而降低白细胞产生的氧化应激、p38 磷酸化、IL-6 产生以及肺动脉平滑肌细胞的增殖，在下调缺氧诱导的肺动脉高压中发挥关键作用。[3]

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Z62954982 是一种第二代 Rac1 抑制剂，其效力和选择性均优于广泛使用的 NSC23766。它的研发对于研究 Rac1 在多种生物学过程中的具体作用至关重要，这些生物学过程包括心血管疾病（例如肺动脉高压）、神经生物学（神经元生长和分支）以及癌症（细胞迁移和转移）。Z62954982 对 Rac1 相对于相关 GTP 酶（Cdc42、RhoA）的高选择性，使其成为解析 Rac1 在复杂信号网络中具体作用的卓越化学工具。

C20H21N3O5S

415.46

415.12

1090893-12-1

9141046

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.618

1.49

133

2

7

6

29

668

0

CC1=C(C=C(C=C1)NC(=O)C2=CC(=CC=C2)OCC3=C(ON=C3C)C)S(=O)(=O)N

OZZQJOAJXMUXCO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H21N3O5S/c1-12-7-8-16(10-19(12)29(21,25)26)22-20(24)15-5-4-6-17(9-15)27-11-18-13(2)23-28-14(18)3/h4-10H,11H2,1-3H3,(H,22,24)(H2,21,25,26)

3-[(3,5-dimethyl-1,2-oxazol-4-yl)methoxy]-N-(4-methyl-3-sulfamoylphenyl)benzamide

Rac1 Inhibitor II; 1090893-12-1; Z62954982; 3-[(3,5-dimethyl-1,2-oxazol-4-yl)methoxy]-N-(4-methyl-3-sulfamoylphenyl)benzamide; SCHEMBL15239985;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。