RMC-7977

RAS family: KRAS(G12C); c-Raf; H-Ras; NRAS rG4

RMC-7977是一种可逆的三复合RAS抑制剂，对突变型和野生型KRAS、NRAS和HRAS变体（RAS（ON）多选择性抑制剂）的活性状态具有广谱活性。临床前，RMC-777对携带各种RAS基因型的RAS-附加肿瘤表现出有效的活性，特别是对具有KRAS密码子12突变的癌症模型（KRASG12X）。[1]

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RMC-7977抑制了FLT3-ITD（Molm-14，MV4-11）、KITN822K（Kasumi-1，SKNO-1）和RAS突变（NRASQ61L-OCIAML-3，HL-60，KRASG13D-NOO-1）驱动的AML细胞系的细胞增殖，IC 50值在5至33 nM之间，并抑制了MAPK途径MEK、ERK和RSK下游效应器的磷酸化。我们还评估了RMC-797在长期暴露于FLT3i后发生继发性NRASG12C或NRASQ617K突变的耐药Molm-14细胞中的活性。在低至5 nM的浓度下，RMC-7977在两种NRAS突变抗性细胞系中恢复了对吉尔特替尼的敏感性。使用胱天蛋白酶3/7测定，我们观察到RMC-7977诱导了AML细胞系的凋亡，但程度不同。我们之前已经证明，有效的MAPK信号抑制会增加对BCL2的凋亡依赖性。因此，在RMC-7977中添加venetoclax显著增强了FLT3、KIT和NRAS突变细胞系中胱天蛋白酶的激活。在细胞活力测定中，RMC-7977和venetoclax显示出高协同活性，如Bliss独立模型所评估的。[2]

鉴于患者体内肿瘤异质性与靶向治疗的临床耐药性有关，研究人员在模型中研究了RMC-7977的体外活性，这些模型再现了FLT3i治疗患者中观察到的克隆生长模式。我们将荧光标记的细胞系与FLT3-ITD（Molm-14）、FLT3-ITD和NRAS共突变（Molm-14-NRASQ61K）和仅NRAS突变（OCIAML-3）混合，用RMC-7977单独和联合（与吉尔特替尼或venetoclax）处理混合物96小时，然后通过流式细胞术评估细胞存活率。Gilteritinib和Gilteritini/venetoclax组合被选择用于携带NRAS突变的细胞的存活，但RMC-7977抑制了所有细胞群的生长。RMC-7977和吉尔特替尼的组合在含有FLT3和FLT3-NRAS共突变的混合物中具有优异的活性，但在单独携带NRAS突变的细胞中，与RMC-7997单一疗法相比没有额外的益处。令人惊讶的是，RMC-7977和venetoclax的组合在所有细胞系模型中都能有效地抑制细胞存活率，并且明显优于单独使用RMC-7997。正在进行体内研究，调查RMC-7977和RMC-7997组合在RAS突变体/FLT3i抗性患者衍生的异种移植物模型中的耐受性和活性，并将进行介绍。[2]

RMC-7977治疗导致肿瘤消退，并且在不同的RAS-添加的临床前癌症模型中具有良好的耐受性。此外，RMC-7977抑制了KRASG12C癌症模型的生长，这些模型由于RAS途径信号的恢复而对KRAS（G12C）抑制剂具有耐药性。因此，RAS（ON）多选择性抑制剂可以靶向多种致癌和野生型RAS亚型，并有可能治疗各种RAS成瘾的癌症，这些癌症具有高度未满足的临床需求。一种相关的RAS（ON）多选择性抑制剂RMC-6236目前正在KRAS突变实体瘤患者中进行临床评估（ClinicalTrials.gov标识符：NCT05379985）。[1]

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在这项研究中，研究人员评估了RMC-7977在各种PDAC模型中的治疗潜力。我们观察到，在体内耐受良好的暴露条件下，直接抑制RAS后，模型具有广泛而明显的抗肿瘤活性。药理学分析显示，肿瘤组织与正常组织对RMC-7977的反应不同。治疗后的肿瘤表现出凋亡波和持续的增殖停滞，而正常组织的增殖仅短暂下降，没有凋亡的证据。在本地KPC小鼠模型中，RMC-7977治疗导致生存期显著延长，随后治疗复发。对复发肿瘤的分析表明，Myc拷贝数增加是一种普遍的候选耐药机制，可以通过体外组合TEAD抑制来克服。这些数据共同为在PDAC环境中使用广谱RAS-GTP抑制建立了强有力的临床前理论基础，并确定了一种有前景的候选联合治疗方案来克服单一疗法的耐药性[3]。

RAS–RAF和RAS–CYPA TR-FRET[1]
如前所述，使用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）来评估野生型RAS或突变致癌RAS蛋白与BRAF的RAS结合结构域之间相互作用的破坏，并评估RAS蛋白与CYPA12之间相互反应的诱导。

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CYPA结合亲和力[1]
如前所述，化合物对CYPA（Kd1）的结合亲和力通过Biacore 8K仪器上的SPR进行评估12。

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RAS结合亲和力[1]
在Biacore 8K仪器上通过SPR评估化合物结合的CYPA对上述突变致癌RAS蛋白（Kd2）的结合亲和力。AviTag RAS[残基1-169]固定在链霉抗生物素蛋白传感器芯片上，并在测定缓冲液（10 mM HEPES NaOH pH 7.4，150 mM NaCl，0.005%v/v表面活性剂P20，2%v/v DMSO，25μM CYPA）中使不同浓度的化合物流过芯片。使用稳态亲和力模型或1:1结合（动力学）模型拟合SPR传感图，以评估RAS结合的解离常数（Kd）。

细胞RAS–RAF和RAS–CYPA测定[1]
将U2OS细胞或具有PPIA基因敲除的U2OS细胞以每孔500000个细胞的速度接种在6孔板中，并孵育过夜。将含有指定突变的KRAS4B或其他小GTP酶克隆到pNLF-N或pHTN质粒中，分别用N端纳米萤光素酶或HaloTag融合物表达。将全长CYPA克隆到pHTN中，将RAF1的RBD（残基51-149）克隆到pHTC中，将全长RALGDS克隆到pHTC中，将PIK3CA克隆到pNLF-N中，将SOS1的催化结构域（残基558-1049）克隆到pNL F-N中。按照制造商的方案，使用Fugene HD试剂将KRAS和效应质粒转染U2OS细胞，将小GTP酶和CYPA质粒转染U2OSPPIA-KO细胞。第二天，用胰蛋白酶收集细胞，并在含有4%FBS和1:1000稀释的NanoBRET 618 HaloTag配体的OptiMem无酚红培养基（Gibco）中的白色组织培养处理的96孔板中重新接种。对于终点浓度响应曲线，在含有4%FBS的OptiMem无酚红培养基中，将间日嗪纳米萤光素酶底物添加到1倍浓度。在Perkin-Elmer Envision平板读数器上测量纳米BRET信号之前，添加不同浓度的抑制剂并孵育1或4小时。对于动力学分析，使用去哌嗪纳米萤光素酶底物代替间日嗪，并将平板放置在预平衡至37°C和5%CO2的Cytation5多模式阅读器中。平衡1小时后，加入RMC-7977（50 nM）并测量纳米BRET信号。

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PRISM分析[1]
RMC-7977在博德研究所建立的931个PRISM DNA条形码细胞系中进行了筛选。简而言之，每个池中有20-25个细胞系被放置在384孔板中，并用RMC-7977以8个剂量以3倍稀释，从10µM开始处理5天。然后在TCL mRNA裂解缓冲液中裂解细胞，然后进行逆转录PCR。然后如前所述进行条形码检测和单变量和多变量分析43。数据分析见补充方法。我们分析的最新代码位于github链接：https://github.com/cmap/dockerized_mts.

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Cell panel[1]
在Crown Bioscience，通过细胞增殖和活力抑制筛选了183个含有突变型和野生型RAS的癌症细胞系对RMC-7977的反应。该面板由KRAS、NRAS或HRAS第12位有任何置换的细胞系组成（KRAS（G12X）、NRAS（G12*）、HRAS（G15X））；KRAS、NRAS或HRAS中除12、13和61以外的任何位置的替换（KRAS（其他/VUS）、NRAS（其他-VUS）、HRAS（其他/WUS））；RAS途径中的其他致癌突变（ABL1、ALK、ARAF、BRAF、CBL、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERRFI1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、HRAS、IGF1R、JAK2、KIT、MAP2K1、MAP2K2、MAPK1、MET、NF1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFRA、PTPN11、RAC1、RAF1、RASA1、RET、RIT1、ROS1和SOS1）；RAS通路中没有致癌突变。细胞在甲基纤维素中培养，用RMC-7977或DMSO的连续稀释液处理三次。将细胞孵育120小时，并根据制造商的说明使用CellTiter Glo发光细胞活力测定法（CTG）测定细胞活力。将数据绘制为log[抑制剂（M）]的函数，并将四参数S形浓度响应模型拟合到数据中，以使用Genedata Screener估算抑制剂EC50。

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细胞增殖分析[1]
将细胞接种在2D的384孔或96孔组织培养处理板中，并孵育过夜。或者，将细胞接种在圆底超低附着96孔板中，以1000rpm离心10分钟以沉淀细胞，并孵育过夜或长达72小时以形成3D球体。将细胞暴露于化合物或DMSO对照（0.1%v/v）的连续稀释液中120小时。根据制造商的方案，通过CellTiter Glo 2.0试剂（2D CTG）（Promega，G9243）或3D CellTiter Glo试剂（3D CTG）测定细胞存活率。使用Perkin-Elmer Enspire的SpectraMax M5平板阅读器检测发光。将发光信号归一化为载体处理的孔（归一化信号（%）=（发光（处理）/平均发光（载体））×100%）。对于PSN1和HUPT3，原始信号被归一化为车辆控制和低信号控制化合物（（样本信号-平均低控制信号）/（平均车辆信号-平均高控制信号）×100%）。对于用RMC-7977和桑格列菲林A竞争性CYPA抑制剂（3 mM）组合处理的NCI-H441和AsPC-1细胞，发光信号被标准化为仅用CYPA抑制剂处理的对照的发光信号（标准化信号（%）=（发光（处理）/平均发光（仅限CYPA抑制剂）×100%）。

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细胞和上清液的生物分析[1]
1000万个细胞在37°C下暴露于1×106个细胞ml−1的悬浮液中的RMC-7977（10、100或1000 nM）1小时。通过离心将细胞制成颗粒，保留1ml上清液并在-80°C下冷冻。细胞颗粒在冷PBS中洗涤两次，在干冰和乙醇的浆液中快速冷冻之前，称量含有细胞颗粒的预先称重的试管。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法测定细胞沉淀和上清液中RMC-7977的浓度。将细胞沉淀样品重新悬浮在细胞培养基中（根据需要稀释），然后作为上清液处理。用3倍体积的含有内标特非那定（2.5 ng ml−1）的乙腈淬灭上清液或再悬浮细胞（50µL）的等分试样。样品被涡旋、离心，并在配备岛津AD LC系统的Sciex 6500+三重四极杆质谱仪上进行分析。采用Waters ACQUITY UPLC BEH C4 1.7µm（2.1×50 mm）柱，梯度洗脱进行化合物分离。使用多重反应监测通过正电喷雾电离检测RMC-7977和内标（RMC-7977:m/z 865.273/833.500；特非那定：m/z 471.939/436.300）。定量下限为0.25 ng ml-1，校准范围为0.25至400 ng ml-1。使用每个细胞颗粒的质量（减去空管的质量）和已知的细胞数量计算RMC-7977的细胞内浓度，假设细胞的体积约为2000µm3，细胞的密度约为水的密度（因此，细胞体积=细胞质量）；并且CYPA-KO细胞中任何超过培养基浓度的化合物都可能是膜结合的。对于每种测试的RMC-7977浓度，确定细胞颗粒中的化合物浓度与培养基中的化合物的比率。

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小鼠细胞活力测定[3]
将具有KrasG12C或KrasG12D突变的PDAC小鼠细胞系（初始治疗或来源于RMC-7977治疗的终点KPC肿瘤）以2×103接种在96孔板中。24小时后，用DMSO或RMC-7977、ERK抑制剂（SCH772984）或MEK抑制剂（曲美替尼）的系列稀释液处理细胞。72小时后，根据制造商的说明，通过使用CellTiter Glo发光细胞活力测定法测量ATP水平来评估细胞活力。或者（在比较幼稚和抗性细胞系的实验中），使用钙黄绿素AM对活细胞进行荧光标记（在500 nMr下孵育20分钟），并使用SpectraMax i3X多模式检测平台进行计数。每个生物复制品都进行了三次技术复制，每个细胞系总共进行了3-4次生物复制。通过将药物处理值标准化为DMSO对照来计算生长百分比，DMSO对照设置为100%。从GraphPad Prism中的生物复制中生成了四参数药物反应曲线。绘制了每种测试稀释液的平均值±标准差。

对于RMC-7977处理过的幼稚和抗性细胞系的协同评估测试，使用了类似的方案，但进行了以下更改：细胞系接种后24小时，使用D300e数字分配器将RMC-7997、IAG933（2714434-21-4）或联合处理添加到细胞中。使用R Studio中的SynergyFinder软件包，使用Excess over Bliss方法计算每个细胞系的平均协同值。

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人细胞系增殖试验[3]
作为Crown Bioscience筛选的各种组织类型的人类癌症细胞系的一部分，测试了19个PDAC细胞系对RMC-7977的敏感性。这些PDAC细胞系携带KRASG12D、KRASG12V、KRASG22C、KRASQ61H和BRAFV487_P492delinsA突变。为了测量细胞增殖的抑制作用，将细胞在甲基纤维素中培养，并用由帝肯D300e数字分配器分配的RMC-7977（最高浓度为1µM）或DMSO的连续稀释液处理三次。在使用CellTiter Glo测量ATP水平之前，将细胞孵育120小时。每个生物复制品都进行了三次技术复制，每个细胞系共进行了3-4次生物复制。通过将药物处理值标准化为DMSO对照来计算生长百分比，DMSO对照设置为100%。将标准化CTG测定读数绘制为对数摩尔抑制剂浓度的函数，并将四参数S形浓度-反应模型拟合到数据中。绘制了每种测试稀释液的平均值±标准差。

将携带野生型KRAS或KRASQ61H的PDAC细胞系以每孔500-4000个细胞的速度接种在透明平底96孔板上，并在使用D300e数字分配器添加指定浓度的RMC-7977或DMSO之前生长24小时。处理后，将细胞再孵育3-5天，之后使用Calcein AM对活细胞进行荧光标记（在500 nM下孵育20分钟），并使用SpectraMax i3X多模式检测平台进行计数。实验在第0天使用独立的培养板进行标准化。通过将药物处理值标准化为DMSO对照来计算生长百分比，DMSO对照设置为100%。将四参数S型浓度-反应模型拟合到至少三个生物重复的数据中。绘制了每种测试稀释液的平均值±标准差。

为了评估RMC-7977和IAG933的协同作用，使用了类似的方案，但有以下变化：细胞系接种后24小时，RMC-7997、IAG933（2714434-21-4），或使用D300e数字分配器（帝肯）将组合添加到细胞中。每个细胞系被视为一个单独的生物复制品（n=8）。使用R（Studio）中的SynergyFinder软件包，使用超额幸福法计算每个细胞系的平均协同值。 蛋白质印迹分析[3]
在生长培养基中，以每孔7.5×103至4×106个细胞的速度将细胞接种在6孔板或100毫米培养皿中。孵育过夜后，加入指定化合物（RMC-7977、IAG933或DMSO（0.1%v/v））并孵育指定时间点。用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并用NP-40裂解缓冲液（赛默飞世尔，J60766）、MSD-Tris溶血缓冲液（MSD，R60TX-2）、RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）或含有1%Triton X-100、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和1 mM EDTA的裂解缓冲液裂解细胞。所有裂解缓冲液都补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂。在4°C下以21000g离心10分钟之前，刮取并收集裂解物。通过BCA测定定量含蛋白质的上清液，并在95°C下用LDS和还原剂变性等量的蛋白质。样品在12%或4-12%的Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后使用iBlot 2.0系统或湿转移转移转移到硝化纤维或PVDF膜上。在4°C下用第一抗体探测过夜之前，将膜在Intercept TBS缓冲液（Li-Cor，927-60001）或3-5%的牛奶中封闭。根据需要添加二抗，并在Li-Cor Odyssey成像仪上对膜进行成像。或者，将膜与HRP连接的二抗一起孵育，并使用ChemiDoc XRS+或ChemiDoc MP成像仪用Clarity或ClarityMax化学发光底物进行显影。

RMC-7977 制剂[3]
\n体外研究中，RMC-7977 用 DMSO（Fisher Bioreagents，BP231-100）重悬，并以 10 mM 的储备液浓度使用。体内研究中，RMC-7977 的配制方法为：DMSO/PEG 400/Solutol HS15/水，体积比为 10/20/10/60。所有对照组均使用相同的溶剂配制。\n

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\n体内异种移植研究[3]
\nRMC-7977 治疗：荷瘤小鼠随机分组（每组 n = 3–10）。每日通过灌胃给予溶剂或 RMC-7977，剂量为 10 mg kg−1，持续 21–28 天。若肿瘤负荷达到人道终点，则提前终止研究。研究期间每周测量两次体重。瀑布图中绘制的是平均值±标准误。在单剂量药代动力学-药效学研究中，小鼠被随机分组（每剂量和时间点 n = 3–6）。分别以 10 mg kg⁻¹、25 mg kg⁻¹ 或 50 mg kg⁻¹ 的剂量口服单剂量 RMC-7977。在指定时间点收集组织（包括肿瘤、结肠和皮肤），并用 10% 福尔马林固定、包埋于最佳切割温度 (OCT; Sakura, 4583) 溶液中或液氮速冻，以备后续分析。全血转移至 K2EDTA 微量采血管（BD，365974）中，孵育 5 分钟后，立即用液氮速冻。\n

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\n体内同种异体移植研究[3]
\n小鼠研究：所有小鼠同种异体移植研究以及与动物操作、护理和治疗相关的程序均符合机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的所有适用法规和指南。本研究使用来自杰克逊实验室的 6-8 周龄雌性 C57BL/6J（000664 品系）小鼠。\n同种异体移植模型的构建：为了构建皮下同种异体移植肿瘤，将 3 × 10⁵ 个 KPCY 6499c4 肿瘤细胞悬浮于 0.1 ml Matrigel:PBS (1:1) 混合液中，接种于每只小鼠的右侧腹部。当平均肿瘤体积达到 140 mm³ 时开始治疗。使用数字游标卡尺测量肿瘤的二维尺寸，并使用公式体积 = (宽度² × 长度)/2 计算肿瘤体积（单位：mm³）。每周对实验小鼠进行两次称重并测量肿瘤大小。\n为了构建原位同种异体移植瘤，将 5 × 10⁴ 个 KPCY 6499c4 肿瘤细胞悬浮于 20 µl PBS/Matrigel 混合物（1:1）中，通过腹腔镜切口直接植入小鼠胰腺。当平均肿瘤体积达到约 50 mm³ 时开始治疗。每周两次测量小鼠体重并通过超声监测肿瘤生长情况。\n
\nRMC-7977 治疗：将荷瘤小鼠随机分组（每组 n = 9–10），并每日通过灌胃给予载体或 RMC-7977（10 mg kg⁻¹）。对于皮下KPCY研究，生存终点定义为：肿瘤体积达到2000 mm³或小鼠出现任何临床症状，包括严重溃疡。对于原位KPCY研究，生存终点定义为：(1)小鼠出现任何临床症状，包括弓背或腹腔积液；或(2)肿瘤尺寸超出超声成像范围。研究期间每周测量两次小鼠体重。分别在末次给药后 4 小时或 24 小时收集组织，并按先前所述方法保存（参见“体内异种移植研究”）。\n

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\n体内 GEMM 研究[3]
\n\nKPF/FC 小鼠的药代动力学-药效学研究[3]
\n通过每两周一次的触诊监测 KPF/FC 小鼠的肿瘤形成，直至检测到肿块，然后通过超声检查确认。将荷瘤小鼠随机分组（每剂量和时间点 n = 3）。分别以 10 mg kg⁻¹、25 mg kg⁻¹ 或 50 mg kg⁻¹ 的剂量经口给予单剂量载体或 RMC-7977。在指定时间点采集全血和组织（肿瘤和结肠），并按先前所述方法保存（参见“体内异种移植研究”）。\n

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\nKPC 小鼠药效学研究 [3]
\n每两周触诊一次，监测 KPC 小鼠的肿瘤形成情况。超声检测到直径为 4–7 mm 的肿瘤后，将 KPC 小鼠随机分组，分别给予载体（n = 6）或 RMC-7977（50 mg kg⁻¹；n = 11）治疗。每隔一天通过灌胃给药，持续 1 周。每日检查小鼠健康状况和体重，并每隔三天进行一次超声检查（Vevo 3100）以监测肿瘤生长。连续两次超声检查后，RMC-7977 治疗组小鼠在末次给药后 4 小时（n = 7）或 24 小时（n = 4）处死，载体对照组小鼠在末次给药后 4 至 24 小时内处死。组织收集和保存方法如前所述（参见“体内异种移植研究”）。另取一组 KPC 小鼠，单次给予 RMC-7977（n = 10）或载体（n = 3），并在给药后 4 小时或 24 小时收集组织，方法如前所述。\n

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\nKPCY 小鼠药效学研究[3]
\n通过超声检测到 15–100 mm3 的肿瘤后，将 KPCY 小鼠纳入研究。小鼠被随机分组，分别接受载体（n = 6）或RMC-7977（25 mg kg−1；n = 8）治疗。每日通过灌胃给药，持续15天，并在第8天和第15天进行超声检查。末次给药后处死小鼠，并收集组织，按照先前描述的方法进行保存（参见“体内异种移植研究”）。\n

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\nKPC小鼠生存研究[3]
\n在生存研究中，纳入肿瘤直径为4-7 mm（超声测量）的KPC小鼠，并隔日分别接受载体（n = 9）或RMC-7977（50 mg kg−1；n = 13）治疗。每日检查小鼠的健康状况和体重，并每三天进行一次超声检查以监测肿瘤生长情况。生存终点由总体健康标准评分确定，终点由以下标准评分达到 5 分或更高确定：濒死，立即实施安乐死；出血性腹水引起的腹胀，5 分；轻度呼吸困难，5 分；体温过低，5 分；乳糜性腹水引起的腹胀，3 分；体重下降超过入组体重的 20%，3 分；抓握测试失败，3 分；黄疸或苍白，3 分；抓握测试无力，2 分；无法与其他小鼠互动，1 分；弓背，1 分；竖毛/无法梳理毛发，1 分。\n

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\n小鼠血液和肿瘤样本生物分析[1]
\n采用 LC-MS/MS 方法测定 RMC-7977 在全血和肿瘤中的浓度。将肿瘤组织样本用10倍体积的甲醇/15 mM PBS（1:2，v/v）匀浆。样本制备和分析在配备ACQUITY UPLC系统的Sciex 6500+三重四极杆质谱仪上进行，方法如前所述¹²。采用正离子电喷雾电离多反应监测（MRM）检测RMC-7977和内标维拉帕米（RMC-7977：m/z 865.4/706.4；维拉帕米：m/z 455.2/164.9）。

[1]. Concurrent inhibition of oncogenic and wild-type RAS-GTP for cancer therapy. Research Square; 2023.

[2]. RAS MULTI (ON) inhibitor RMC-7977 targets oncogenic RAS mutations and overcomes RAS/MAPK-mediated resistance to FLT3 inhibitors in AML models. Blood, 2023, 142: 2793.

RAS癌基因（统称NRAS、HRAS，尤其是KRAS）是癌症中最常见的突变基因之一，常见的驱动突变发生在12、13和611密码子。KRAS(G12C)癌蛋白的小分子抑制剂已在多种癌症患者中显示出临床疗效，并已获批用于治疗非小细胞肺癌^2,3。然而，KRAS(G12C)突变仅占KRAS突变型癌症的约15%^4,5，且目前尚无获批的KRAS抑制剂可用于治疗大多数携带其他常见KRAS突变的肿瘤患者。本文介绍RMC-7977，一种可逆的三复合物RAS抑制剂，对突变型和野生型KRAS、NRAS和HRAS变体的活性状态均具有广谱活性（一种RAS(ON)多选择性抑制剂）。临床前研究表明，RMC-7977 对携带多种 RAS 基因型的 RAS 依赖性肿瘤具有显著的活性，尤其对携带 KRAS 12 号密码子突变（KRASG12X）的癌症模型效果显著。RMC-7977 治疗可导致肿瘤消退，且在多种 RAS 依赖性临床前癌症模型中均表现出良好的耐受性。此外，RMC-7977 还能抑制对 KRAS(G12C) 抑制剂耐药的 KRASG12C 癌症模型的生长，这归因于其恢复了 RAS 通路信号传导。因此，RAS(ON) 多选择性抑制剂可以靶向多种致癌性和野生型 RAS 亚型，并有望治疗多种 RAS 依赖性癌症，满足其巨大的未满足临床需求。一种相关的RAS(ON)多选择性抑制剂RMC-6236目前正在KRAS突变型实体瘤患者中进行临床评估（ClinicalTrials.gov注册号：NCT05379985）[1]。FLT3抑制剂（FLT3i），例如吉瑞替尼，在急性髓系白血病（AML）中具有临床活性，但由于RAS/MAPK突变克隆的出现而导致的耐药性限制了其应用。这些突变克隆可能单独存在，也可能与FLT3突变或其他驱动基因（例如KIT突变）联合存在。RAS突变也常与IDH1/2抑制剂和BCL2抑制剂维奈托克治疗后的复发相关。重要的是，在复发时会发现多种异质性耐药克隆。此外，5-10%的新发AML患者携带致癌性RAS突变。携带 RAS 突变或其他激活 RAS/MAPK 信号通路突变的患者无法从已获临床批准的靶向治疗中获益。靶向致癌 RAS 一直以来都极具挑战性，而抑制 MAPK 通路下游效应因子（例如 MEK）在临床试验中显示出疗效有限且毒性较高。因此，有效抑制 RAS/MAPK 通路是急性髓系白血病 (AML) 治疗中亟待解决的关键问题。RMC-7977 是一种强效的口服小分子抑制剂，可同时抑制野生型和突变型 GTP 结合的 RAS 癌蛋白 (RAS MULTI)，是临床候选药物 RMC-6236 的临床前研究化合物，目前正在进行临床评估 (NCT05379985)。RMC-7977 与细胞内分子伴侣环孢亲和素 A 非共价结合，形成一种对所有 RAS 亚型均具有高亲和力的新型结合界面。由此形成的三元复合物通过空间位阻阻断RAS-效应蛋白相互作用，从而抑制致癌信号的传递。我们报告了体外数据，支持RAS MULTI(ON)抑制剂在携带RAS突变的急性髓系白血病（AML）模型中的临床前应用价值，包括那些由于RAS信号过度激活而对FLT3抑制剂产生耐药性的模型。鉴于患者肿瘤异质性与靶向治疗的临床耐药性相关，我们研究了RMC-7977在能够重现FLT3抑制剂治疗患者中观察到的克隆增殖模式的模型中的体外活性。我们将荧光标记的细胞系混合，这些细胞系分别携带 FLT3-ITD 突变（Molm-14）、FLT3-ITD 和 NRAS 共突变（Molm-14 NRASQ61K）以及仅携带 NRAS 突变（OCIAML-3）。随后，我们分别用 RMC-7977 单独处理以及与吉瑞替尼或维奈托克联合处理这些混合物 96 小时，并通过流式细胞术评估细胞活力。吉瑞替尼和吉瑞替尼/维奈托克联合用药均能促进携带 NRAS 突变的细胞存活，而 RMC-7977 则抑制所有细胞群的增殖。RMC-7977 与吉瑞替尼联合用药在含有 FLT3 和 FLT3-NRAS 共突变的混合物中表现出更优的活性，但在仅携带 NRAS 突变的细胞中，其疗效并不优于 RMC-7977 单药治疗。值得注意的是，RMC-7977 与维奈托克联合用药在所有细胞系模型中均能有效抑制细胞活力，且效果显著优于 RMC-7977 单药治疗。目前正在进行体内研究，以评估 RMC-7977 及其联合用药在 RAS 突变/FLT3i 耐药的患者来源异种移植模型中的耐受性和活性，相关结果将在后续报告中公布。总而言之，我们的数据提供了临床前证据，表明利用 RAS MULTI(ON) 抑制的联合疗法能够有效抑制 RAS 突变型 AML 克隆，而 RAS 突变是 AML 中目前已获批准的靶向疗法的常见耐药机制，也是目前临床上亟待解决的重大问题。[2]

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广谱 RAS 抑制剂有望使大约四分之一的 RAS 突变驱动型癌症患者获益。 RMC-7977 是一种对 KRAS、HRAS 和 NRAS 的活性 GTP 结合形式具有高度选择性的抑制剂，对突变型和野生型变体均有亲和力。超过 90% 的人类胰腺导管腺癌 (PDAC) 病例是由 KRAS 的激活突变驱动的。[3]

C47H60N8O6S

865.094309806824

864.44

C, 65.25; H, 6.99; N, 12.95; O, 11.10; S, 3.71

2765082-12-8

164726623

White to light yellow solid powder

4.7

172Ų

2

12

8

62

1620

5

CCN1C2=C3C=C(C=C2)C4=CSC(=N4)C[C@@H](C(=O)N5CCC[C@H](N5)C(=O)OCC(CC3=C1C6=C(N=CC(=C6)N7CCN(CC7)C8CC8)[C@H](C)OC)(C)C)NC(=O)C9[C@H]1[C@@H]9COC1

NBLZKEHVVJSAAY-OFTZCYAMSA-N

InChI=1S/C47H60N8O6S/c1-6-54-39-12-9-28-18-31(39)33(43(54)32-19-30(22-48-42(32)27(2)59-5)53-16-14-52(15-17-53)29-10-11-29)21-47(3,4)26-61-46(58)36-8-7-13-55(51-36)45(57)37(20-40-49-38(28)25-62-40)50-44(56)41-34-23-60-24-35(34)41/h9,12,18-19,22,25,27,29,34-37,41,51H,6-8,10-11,13-17,20-21,23-24,26H2,1-5H3,(H,50,56)/t27-,34-,35+,36-,37+,41+/m0/s1

(1R,5S,6r)-N-((63S,4R,Z)-12-(5-(4-cyclopropylpiperazin-1-yl)-2-((S)-1-methoxyethyl)pyridin-3-yl)-11-ethyl-10,10-dimethyl-5,7-dioxo-61,62,63,64,65,66-hexahydro-11H-8-oxa-2(4,2)-thiazola-1(5,3)-indola-6(1,3)-pyridazinacycloundecaphane-4-yl)-3-oxabicyclo[3.1.0]hexane-6-carboxamide

2765082-12-8; SCHEMBL25774785; RMC-7977; RMC 7977; RMC7977; EX-A7974;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。