RMC-7977

RAS family: KRAS(G12C); c-Raf; H-Ras; NRAS rG4
Active (GTP-bound) RAS proteins (KRAS, HRAS, NRAS). RMC-7977 is a pan-RAS inhibitor that targets the active state of all three RAS isoforms (KRAS, HRAS, NRAS), which are key oncogenic drivers. It binds to the active, GTP-bound conformation, preventing interaction with downstream effectors like RAF.

RMC-7977 是一种可逆的三复合物 RAS 抑制剂，对突变型和野生型 KRAS、NRAS 和 HRAS 变体的活性状态均具有广谱活性（一种 RAS(ON) 多选择性抑制剂）。临床前研究表明，RMC-7977 对携带各种 RAS 基因型的 RAS 依赖性肿瘤具有强效活性，尤其对携带 KRAS 12 号密码子突变 (KRASG12X) 的癌症模型有效。[1]

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RMC-7977 抑制了由 FLT3-ITD（Molm-14、MV4-11）、KITN822K（Kasumi-1、SKNO-1）和 RAS 突变（NRASQ61L - OCIAML-3、HL-60、KRASG13D - NOMO-1）驱动的 AML 细胞系的增殖，IC50 值介于 5 至 33 nM 之间，并抑制了 MAPK 通路下游效应分子 MEK、ERK 和 RSK 的磷酸化。我们还评估了 RMC-7977 在长期暴露于 FLT3 抑制剂后产生继发性 NRASG12C 或 NRASQ61K 突变的耐药 Molm-14 细胞中的活性。在低至 5 nM 的浓度下，RMC-7977 即可恢复这两种 NRAS 突变耐药细胞系对吉瑞替尼的敏感性。利用 caspase3/7 检测，我们观察到 RMC-7977 可诱导细胞凋亡，但不同 AML 细胞系的诱导程度存在差异。我们此前已证实，有效的 MAPK 信号通路抑制可增强细胞凋亡对 BCL2 的依赖性。因此，在 RMC-7977 的基础上添加维奈托克可显著增强携带 FLT3、KIT 和 NRAS 突变的细胞系中 caspase 的激活。在细胞活力检测中，RMC-7977 和维奈托克表现出高度协同作用，这通过 Bliss 独立性模型评估得出。[2]
鉴于患者肿瘤异质性与靶向治疗的临床耐药性相关，研究人员在能够重现 FLT3 抑制剂治疗患者中观察到的克隆增殖模式的模型中，研究了 RMC-7977 的体外活性。我们将荧光标记的细胞系混合，这些细胞系分别携带 FLT3-ITD 突变（Molm-14）、FLT3-ITD 和 NRAS 共突变（Molm-14 NRASQ61K）以及仅携带 NRAS 突变（OCIAML-3）。随后，我们分别用 RMC-7977 单独处理以及与吉瑞替尼或维奈托克联合处理这些混合物 96 小时，并通过流式细胞术评估细胞活力。吉瑞替尼和吉瑞替尼/维奈托克联合用药均能促进携带 NRAS 突变的细胞存活，而 RMC-7977 则抑制所有细胞群的增殖。RMC-7977 与吉瑞替尼联合用药在含有 FLT3 和 FLT3-NRAS 共突变的混合物中表现出更优的活性，但在仅携带 NRAS 突变的细胞中，其疗效并不优于 RMC-7977 单药治疗。值得注意的是，RMC-7977 与维奈托克联合用药在所有细胞系模型中均能有效抑制细胞活力，且效果显著优于单独使用 RMC-7977。目前正在进行体内研究，以评估 RMC-7977 及其联合用药在 RAS 突变/FLT3i 耐药患者来源的异种移植模型中的耐受性和活性，相关结果将在后续报告中公布。[2]

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RMC-7977 对活性 RAS 蛋白具有高效抑制作用，其对活性 KRAS、活性 HRAS 和活性 NRAS 的 Kd 值分别为 116 nM、94.7 nM 和 101 nM。它还能与环孢菌素 A (CYPA) 结合，Kd 值为 195 nM，形成 RAS 抑制所需的三元复合物。RMC-7977 可抑制 ERK、CRAF 和 RSK 的磷酸化，最终导致细胞凋亡（PARP 裂解）。

RMC-7977 治疗可导致肿瘤消退，并且在多种 RAS 依赖性临床前癌症模型中均表现出良好的耐受性。此外，RMC-7977 还能抑制对 KRAS(G12C) 抑制剂耐药的 KRASG12C 癌症模型的生长，这归因于 RAS 通路信号的恢复。因此，RAS(ON) 多选择性抑制剂可以靶向多种致癌性和野生型 RAS 亚型，并有望治疗多种 RAS 依赖性癌症，满足其高度未被满足的临床需求。一种相关的 RAS(ON) 多选择性抑制剂 RMC-6236 目前正在 KRAS 突变型实体瘤患者中进行临床评估（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT05379985）。[1] 在本研究中，研究人员评估了 RMC-7977 在多种胰腺导管腺癌 (PDAC) 模型中的治疗潜力。我们观察到，在体内耐受性良好的剂量下，直接抑制RAS后，多种模型均表现出广泛而显著的抗肿瘤活性。药理学分析显示，RMC-7977在肿瘤组织和正常组织中的反应存在差异。经治疗的肿瘤组织表现出凋亡波以及持续的增殖停滞，而正常组织仅出现短暂的增殖下降，未观察到凋亡迹象。在自体KPC小鼠模型中，RMC-7977治疗显著延长了生存期，但随后出现治疗期间复发。对复发肿瘤的分析发现，Myc拷贝数增加是一种常见的潜在耐药机制，可通过体外联合TEAD抑制剂来克服。综上所述，这些数据为在PDAC中使用广谱RAS-GTP抑制剂提供了强有力的临床前理论依据，并确定了一种有前景的联合治疗方案，有望克服单药治疗耐药性[3]。

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在体内，RMC-7977 可诱导多种 RAS 驱动的癌症模型（包括 KRAS G12C、G12D 和 G12V 突变肿瘤）的肿瘤消退。它能降低肿瘤中的 ERK 通路信号传导，并表现出良好的耐受性，使其成为治疗多种 RAS 突变癌症的潜在药物。此外，它还能降低 KRAS G12C 模型中的耐药性。

RAS–RAF 和 RAS–CYPA TR-FRET[1]
如前所述，采用时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 技术评估野生型 RAS 或突变致癌 RAS 蛋白与 BRAF 的 RAS 结合域之间相互作用的破坏情况，并评估 RAS 蛋白与 CYPA 之间相互作用的诱导情况¹²。

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CYPA 结合亲和力[1]
如前所述¹²，使用 Biacore 8K 仪器通过 SPR 技术评估化合物与 CYPA 的结合亲和力 (Kd1)。

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RAS 结合亲和力[1]
使用 Biacore 8K 仪器通过 SPR 技术评估化合物结合的 CYPA 与上述突变致癌 RAS 蛋白的结合亲和力 (Kd2)。将AviTag-RAS（残基1-169）固定在链霉亲和素传感器芯片上，并在检测缓冲液（10 mM HEPES-NaOH pH 7.4、150 mM NaCl、0.005% v/v 表面活性剂P20、2% v/v DMSO、25 μM CYPA）中将不同浓度的化合物流过芯片。使用稳态亲和力模型或1:1结合（动力学）模型拟合SPR传感器图，以评估RAS结合的解离常数（Kd）。

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利用表面等离子共振 (SPR) 技术可以进行 RMC-7977 的无细胞检测，以测量其结合动力学。将纯化的、活性的、GTP 结合的 KRAS (G12V) 固定在传感器芯片上，并在重组环孢亲和素 A 存在下，使 RMC-7977 流过芯片。测定其与 KRAS 相互作用的解离常数 (Kd = 292 uM)。另一种 SPR 方法可以测量其与 CYPA 的结合 (Kd = 195 nM)。

细胞 RAS–RAF 和 RAS–CYPA 检测[1]
将 U2OS 细胞或 PPIA 基因敲除的 U2OS 细胞以每孔 500,000 个细胞的密度接种于 6 孔板中，并过夜培养。将含有指定突变的 KRAS4B 或其他小 GTP 酶克隆到 pNLF-N 或 pHTN 质粒中，分别与 N 端纳米荧光素酶或 HaloTag 融合表达。将全长 CYPA 克隆到 pHTN 中，将 RAF1 的 RBD（氨基酸残基 51–149）克隆到 pHTC 中，将全长 RALGDS 克隆到 pHTC 中，将 PIK3CA 克隆到 pNLF-N 中，并将 SOS1 的催化结构域（氨基酸残基 558–1049）克隆到 pNLF-N 中。 U2OS细胞用KRAS和效应质粒转染，U2OS PPIA-KO细胞用小GTP酶和CYPA质粒转染，两种转染均使用Fugene HD试剂，并按照制造商的操作规程进行。次日，用胰蛋白酶收集细胞，并将其重新接种于经组织培养处理的白色96孔板中，培养基为含4% FBS和1:1000稀释的NanoBRET 618 HaloTag配体的OptiMem无酚红培养基（Gibco）。对于终点浓度-反应曲线，在含4% FBS的OptiMem无酚红培养基中加入1×浓度的vivazine纳米荧光素酶底物。加入不同浓度的抑制剂，孵育1或4小时后，使用Perkin Elmer Envision酶标仪测量nano-BRET信号。在动力学分析中，使用恩杜拉嗪纳米荧光素酶底物代替维伐嗪，并将反应板置于预先平衡至 37 °C 和 5% CO2 的 Cytation5 多功能酶标仪中。平衡 1 小时后，加入 RMC-7977 (50 nM) 并测量纳米 BRET 信号。

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PRISM 检测[1]
在 Broad 研究所建立的 931 个 PRISM DNA 条形码细胞系中筛选了 RMC-7977。简而言之，将每组 20-25 个细胞系接种于 384 孔板中，并用 RMC-7977 处理 5 天，RMC-7977 以 8 个浓度进行三倍稀释，起始浓度为 10 µM。然后用 TCL mRNA 裂解缓冲液裂解细胞，并进行逆转录 PCR。条形码的检测以及单变量和多变量分析随后按照先前描述的方法进行⁴³。
细胞系[1]
在 Crown Bioscience，我们通过细胞增殖和活力抑制试验筛选了 183 个携带突变型和野生型 RAS 的癌细胞系对 RMC-7977 的反应。该细胞系包括 KRAS、NRAS 或 HRAS 第 12 位氨基酸发生任何替换的细胞系（KRAS(G12X)、NRAS(G12X)、HRAS(G12X)）。 KRAS、NRAS 或 HRAS 基因除 12、13 和 61 位点以外的任何位置的替换（KRAS(其他/VUS)、NRAS(其他/VUS)、HRAS(其他/VUS)）；RAS 通路中的其他致癌突变（ABL1、ALK、ARAF、BRAF、CBL、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERRFI1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、HRAS、IGF1R、JAK2、KIT、MAP2K1、MAP2K2、MAPK1、MET、NF1、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFRA、PTPN11、RAC1、RAF1、RASA1、RET、RIT1、ROS1 和 SOS1）；且RAS通路中未检测到致癌突变。细胞在甲基纤维素培养基中培养，并用RMC-7977或DMSO进行系列稀释处理，每个处理设置三个复孔。细胞培养120小时后，使用CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒（CTG）按照制造商说明书测定细胞活力。数据以 log [抑制剂 (M)] 为函数绘制，并使用 Genedata Screener 对数据拟合四参数 S 型浓度响应模型以估计抑制剂 EC50。

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细胞增殖分析[1]
将细胞以二维方式接种于 384 孔或 96 孔组织培养处理板中，并过夜培养。或者，将细胞接种于圆底超低吸附96孔板中，以1000 rpm离心10分钟收集细胞，并孵育过夜或长达72小时，以形成3D球体。将细胞暴露于系列稀释的化合物或DMSO对照（0.1% v/v）中120小时。根据制造商的方案，使用CellTiter-Glo 2.0试剂（2D CTG）（Promega，G9243）或3D CellTiter-Glo试剂（3D CTG）测定细胞活力。使用Perkin Elmer Enspire SpectraMax M5酶标仪检测发光值。发光信号以载体处理孔为基准进行标准化（标准化信号（%）=（处理组发光值/载体组平均发光值）× 100%）。对于 PSN1 和 HUPT3，原始信号以载体对照和低信号对照化合物进行标准化（（样本信号 – 平均低对照信号）/（平均载体信号 – 平均低对照信号）× 100%）。对于用 RMC-7977 和桑格非林 A 竞争性 CYPA 抑制剂 (3 mM) 联合处理的 NCI-H441 和 AsPC-1 细胞，发光信号以仅使用 CYPA 抑制剂处理的对照组进行标准化（标准化信号 (%) =（发光（处理组）/平均发光（仅使用 CYPA 抑制剂）× 100%））。

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细胞和上清液的生物分析[1]
将 1000 万个细胞以 1 × 10⁶ 个细胞/毫升的浓度悬浮于 RMC-7977（10、100 或 1000 nM）中，在 37 °C 下孵育 1 小时。细胞经离心沉淀后，取1 ml上清液并于−80 °C冷冻保存。细胞沉淀用冷PBS洗涤两次，预先称重的装有细胞沉淀的试管在用干冰和乙醇混合物速冻前再次称重。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法测定细胞沉淀和上清液中RMC-7977的浓度。将细胞沉淀样品重悬于细胞培养基中（必要时稀释），然后按上清液处理。取50 µL上清液或重悬的细胞，加入3倍体积的含内标特非那定（2.5 ng ml−1）的乙腈溶液进行淬灭。涡旋混匀后，离心，并在配备岛津AD LC系统的Sciex 6500+三重四极杆质谱仪上进行分析。采用Waters ACQUITY UPLC BEH C4 1.7 µm (2.1 × 50 mm)色谱柱，以梯度洗脱进行化合物分离。RMC-7977和内标物采用正离子电喷雾电离多反应监测（MRM）模式进行检测（RMC-7977：m/z 865.273/833.500；特非那定：m/z 471.939/436.300）。定量下限为0.25 ng ml⁻¹，校准范围为0.25至400 ng ml⁻¹。RMC-7977的细胞内浓度根据每个细胞沉淀的质量（减去空管的质量）和已知的细胞数量计算得出，假设细胞体积约为2000 µm³，细胞密度近似等于水的密度（因此，细胞体积=细胞质量）。并且，CYPA-KO 细胞中任何浓度超过培养基浓度的化合物都可能与细胞膜结合。对于每种测试浓度的 RMC-7977，均测定了细胞沉淀物中化合物浓度与培养基中化合物浓度的比值。

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小鼠细胞活力检测[3]
将携带 KrasG12C 或 KrasG12D 突变的 PDAC 小鼠细胞系（未经治疗或来源于 RMC-7977 治疗的终点 KPC 肿瘤）以 2 × 10³ 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中。24 小时后，用 DMSO 或 RMC-7977 的系列稀释液、ERK 抑制剂 (SCH772984) 或 MEK 抑制剂 (曲美替尼) 处理细胞。72 小时后，使用 CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒，按照制造商的说明测量 ATP 水平，评估细胞活力。或者（在比较未处理和耐药细胞系的实验中），使用Calcein AM（500 nm 波长孵育20分钟）对活细胞进行荧光标记，并使用SpectraMax i3X多功能检测平台进行计数。每个生物学重复均进行三次技术重复，每个细胞系共进行3-4次生物学重复。通过将药物处理值标准化至DMSO对照组（设定为100%）来计算生长百分比。使用GraphPad Prism软件，根据生物学重复数据生成四参数药物反应曲线。绘制了每个测试稀释度的平均值±标准差。
为了评估RMC-7977对未经治疗和耐药细胞系的协同作用，采用了类似的方案，但有以下改动：在细胞系接种24小时后，使用D300e数字分液器将RMC-7977、IAG933（南通海福生物科技有限公司，2714434-21-4）或联合治疗添加到细胞中。使用R Studio中的SynergyFinder包，通过Excess over Bliss方法计算每个细胞系的平均协同值。

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人细胞系增殖实验[3]
作为Crown Bioscience筛选的各种组织类型的人癌细胞系的一部分，我们测试了19种PDAC细胞系对RMC-7977的敏感性。这些PDAC细胞系携带KRASG12D、KRASG12V、KRASG12C、KRASQ61H和BRAFV487_P492delinsA突变。为了检测细胞增殖抑制情况，将细胞培养于甲基纤维素培养基中，并用RMC-7977（最高浓度为1 µM）或DMSO进行三重复处理，DMSO由Tecan D300e数字分液器分装。细胞培养120小时后，使用CellTiter-Glo检测ATP水平。每个生物学重复均进行三次技术重复，每个细胞系共进行3-4次生物学重复。通过将药物处理组的值标准化至DMSO对照组（设定为100%）来计算生长百分比。将标准化的CTG检测读数绘制为抑制剂摩尔浓度的对数函数，并用四参数S型浓度-反应模型拟合数据。对每个测试稀释度绘制平均值±标准差图。
将携带野生型KRAS或KRASQ61H的PDAC细胞系以每孔500-4000个细胞的密度接种于透明平底96孔板中，培养24小时后，使用D300e数字分液器加入指定浓度的RMC-7977或DMSO。处理后，细胞继续培养3-5天，然后用Calcein AM（500 nM，孵育20分钟）对活细胞进行荧光标记，并使用SpectraMax i3X多功能检测平台进行计数。实验数据以第0天的独立培养板进行标准化。生长百分比通过将药物处理组的值标准化至DMSO对照组（设定为100%）来计算。使用四参数S型浓度-反应模型拟合至少三个生物学重复的数据。对每个测试稀释度绘制平均值±标准差图。
为了评估RMC-7977和IAG933联合作用的协同效应，采用了类似的方案，但有以下改动：在细胞系接种24小时后，使用D300e数字分液器（Tecan）将RMC-7977、IAG933（2714434-21-4）或二者组合加入细胞中。每个细胞系被视为一个独立的生物学重复（n = 8）。使用R(Studio)中的SynergyFinder包，通过超越Bliss法计算每个细胞系的平均协同效应值。Western blot分析[3]
将细胞以每孔7.5 × 10³至4 × 10⁶个细胞的密度接种于6孔板或100 mm培养皿中，培养基为生长培养基。过夜孵育后，加入指定化合物（RMC-7977、IAG933 或 DMSO (0.1% v/v)），并孵育指定时间点。用冰冷的 PBS 洗涤细胞两次，然后用 NP-40 裂解缓冲液（Thermo Fisher，J60766）、MSD Tris 裂解缓冲液（MSD，R60TX-2）、RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS）或含有 1% Triton X-100、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl 和 1 mM EDTA 的裂解缓冲液裂解细胞。所有裂解缓冲液均添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂。细胞裂解液经刮取收集后，于4℃下以21,000g离心10分钟。取上清液进行BCA蛋白定量，并取等量蛋白，加入LDS和还原剂于95℃变性。将样品在12%或4-12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后使用iBlot 2.0系统或湿转印法转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜上。膜在Intercept TBS缓冲液（Li-Cor，927-60001）或3-5%脱脂奶粉溶液中封闭，然后在4℃下与一抗孵育过夜。根据需要加入二抗，最后使用Li-Cor Odyssey成像仪进行成像。或者，将膜与辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗孵育，然后使用 Clarity 或 ClarityMax 化学发光底物，通过 ChemiDoc XRS+ 或 ChemiDoc MP 成像仪进行显色。

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使用KRAS突变型癌细胞系（例如MIA PaCa-2、NCI-H358）进行细胞实验。将细胞接种于96孔板中，并用不同浓度的RMC-7977处理48-72小时。使用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力。对于信号通路研究，裂解细胞并通过Western blot分析p-ERK、p-CRAF、p-RSK和PARP裂解（凋亡标志物）的表达水平。

RMC-7977 制剂[3]
体外研究中，RMC-7977 用 DMSO（Fisher Bioreagents，BP231-100）重悬，并以 10 mM 的储备浓度使用。体内研究中，RMC-7977 的配制方法为：DMSO/PEG 400/Solutol HS15/水，体积比为 10/20/10/60。所有对照组均使用相同的溶剂配制。

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体内异种移植研究[3]
RMC-7977 治疗：荷瘤小鼠随机分组（每组 n = 3–10）。每日通过灌胃给予溶剂或 RMC-7977，剂量为 10 mg kg−1，持续 21–28 天。若肿瘤负荷达到人道终点，则提前终止研究。研究期间每周两次测量小鼠体重。瀑布图中绘制的是平均值±标准误。在单剂量药代动力学-药效学研究中，小鼠被随机分组（每剂量和时间点n=3-6只）。RMC-7977以10 mg kg⁻¹、25 mg kg⁻¹或50 mg kg⁻¹的剂量经口给予单剂量。在指定时间点收集组织（包括肿瘤、结肠和皮肤），并用10%福尔马林固定、包埋于最佳切割温度（OCT；Sakura，4583）溶液中或液氮速冻，以备后续分析。全血转移至K2EDTA微量采血管（BD，365974），孵育5分钟后，立即液氮速冻。

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体内同种异体移植研究[3]
小鼠研究：所有小鼠同种异体移植研究以及与动物操作、护理和治疗相关的程序均符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）的所有适用法规和指南。本研究使用来自杰克逊实验室的6-8周龄雌性C57BL/6J（000664品系）小鼠。同种异体移植模型的构建：为了构建皮下同种异体移植肿瘤，每只小鼠右侧腹部接种3 × 10⁵个KPCY 6499c4肿瘤细胞，细胞悬浮于0.1 ml Matrigel:PBS（1:1）混合液中。当平均肿瘤体积达到140 mm³时开始治疗。使用数字游标卡尺测量肿瘤的二维尺寸，并使用公式体积 = (宽度² × 长度)/2 计算肿瘤体积（mm³）。每周对实验小鼠进行两次称重并测量肿瘤大小。为了构建原位同种异体移植瘤，将 5 × 10⁴ 个 KPCY 6499c4 肿瘤细胞悬浮于 20 µl PBS/Matrigel 混合物（1:1）中，通过腹腔镜切口直接植入小鼠胰腺。当平均肿瘤体积达到约 50 mm³ 时开始治疗。每周两次测量小鼠体重并通过超声监测肿瘤生长情况。
RMC-7977 治疗：将荷瘤小鼠随机分组（每组 n = 9–10），并每日通过灌胃给予载体或 RMC-7977（10 mg kg⁻¹）。对于皮下KPCY研究，生存终点定义为：肿瘤体积达到2000 mm³或小鼠出现任何临床症状，包括严重溃疡。对于原位KPCY研究，生存终点定义为：(1)小鼠出现任何临床症状，包括弓背或腹腔积液；或(2)肿瘤尺寸超出超声成像范围。研究期间每周测量两次小鼠体重。分别在末次给药后 4 小时或 24 小时收集组织，并按先前所述方法保存（参见“体内异种移植研究”）。

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体内 GEMM 研究[3]
KPF/FC 小鼠的药代动力学-药效学研究[3]
通过每两周一次的触诊监测 KPF/FC 小鼠的肿瘤形成，直至检测到肿块，然后通过超声检查确认。荷瘤小鼠随机分组（每剂量和时间点 n = 3）。单次口服给予载体或RMC-7977，剂量分别为10 mg kg⁻¹、25 mg kg⁻¹或50 mg kg⁻¹。在指定时间点采集全血和组织（肿瘤和结肠），并按先前所述方法保存（参见“体内异种移植研究”）。

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KPC小鼠药效学研究[3]
每两周触诊一次，监测KPC小鼠的肿瘤形成情况。超声检测到直径为4-7 mm的肿瘤后，将KPC小鼠随机分组，分别给予载体（n = 6）或RMC-7977（50 mg kg⁻¹；n = 11）治疗。每隔一天通过灌胃给药，持续1周。每日检查小鼠的健康状况和体重，并每三天进行一次超声检查（Vevo 3100）以监测肿瘤生长情况。连续两次超声检查后，RMC-7977 治疗组小鼠分别在末次给药后 4 小时 (n = 7) 或 24 小时 (n = 4) 处死，载体对照组小鼠在末次给药后 4 至 24 小时内处死。组织收集和保存方法如前所述（参见“体内异种移植研究”）。另取一组 KPC 小鼠，分别接受单次 RMC-7977 (n = 10) 或载体 (n = 3) 治疗，并在给药后 4 小时或 24 小时收集组织，方法如前所述。

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KPCY 小鼠药效学研究 [3]
KPCY 小鼠在超声检测到 15–100 mm³ 肿瘤后入组。小鼠随机分组，分别接受载体 (n = 6) 或 RMC-7977 (25 mg kg−1; n = 8) 治疗。治疗通过灌胃法每日进行，持续15天，并在第8天和第15天进行超声检查。末次给药后处死小鼠，并按先前所述方法收集和保存组织（参见“体内异种移植研究”）。

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KPC小鼠生存研究[3]
在生存研究中，纳入肿瘤直径为4-7 mm（超声测量）的KPC小鼠，并隔日分别给予赋形剂（n = 9）或RMC-7977（50 mg kg−1；n = 13）治疗。每日检查小鼠的健康状况和体重，并每三天进行一次超声检查以监测肿瘤生长。生存终点由总体健康标准评分确定，终点定义为基于以下标准评分达到5分或更高：濒死，立即实施安乐死；因出血性腹水导致的腹胀，5分；轻度呼吸困难，5分；体温过低，5分；乳糜腹水引起的腹胀，3分；体重下降超过入组体重的20%，3分；抓握测试失败，3分；黄疸或苍白，3分；抓握力弱，2分；无法与其他小鼠互动，1分；弓背，1分；竖毛/无法梳理毛发，1分。

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小鼠血液和肿瘤样本生物分析[1]
采用LC-MS/MS方法测定RMC-7977在全血和肿瘤中的浓度。将肿瘤组织样本用10倍体积的甲醇/15 mM PBS（1:2，v/v）匀浆。样品制备和分析在配备ACQUITY UPLC系统的Sciex 6500+三重四极杆质谱仪上进行，方法如前所述¹²。采用正离子电喷雾电离多反应监测法检测RMC-7977和内标维拉帕米（RMC-7977：m/z 865.4/706.4；维拉帕米：m/z 455.2/164.9）。

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体内疗效评估采用小鼠异种移植模型（例如，使用MIA PaCa-2胰腺癌细胞或H358肺癌细胞）。RMC-7977每日口服给药。使用游标卡尺测量肿瘤体积。药效学分析包括在给药后不同时间点收集肿瘤组织，并通过免疫组化（IHC）或蛋白质印迹法（Western blot）评估p-ERK水平。基于血液和肿瘤中的化合物浓度建立药代动力学/药效学（PK/PD）模型。

小鼠药代动力学研究表明，RMC-7977 具有良好的口服生物利用度，在血液和肿瘤组织中均能达到较高的药物暴露量。口服给药后，通常采用液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 测定全血和肿瘤组织中的药物浓度，以确定药代动力学参数。其半衰期适合每日一次口服给药。

小鼠临床前毒理学研究表明，RMC-7977在治疗剂量下耐受性良好，疗效研究中未观察到明显的体重减轻。由于RAS信号通路对维持正常的上皮稳态至关重要，因此其靶向毒性可能包括皮疹或胃肠道紊乱。临床开发需要进一步的毒理学研究。

[1]. Concurrent inhibition of oncogenic and wild-type RAS-GTP for cancer therapy. Research Square; 2023.

[2]. RAS MULTI (ON) inhibitor RMC-7977 targets oncogenic RAS mutations and overcomes RAS/MAPK-mediated resistance to FLT3 inhibitors in AML models. Blood, 2023, 142: 2793.

RAS癌基因（统称为NRAS、HRAS，尤其是KRAS）是癌症中最常见的突变基因之一，常见的驱动突变发生在12、13和611密码子。KRAS(G12C)癌蛋白的小分子抑制剂已在多种癌症患者中显示出临床疗效，并已被批准用于治疗非小细胞肺癌^2,3。然而，KRAS(G12C)突变仅占KRAS突变型癌症的约15%^4,5，目前尚无获批的KRAS抑制剂可用于治疗大多数携带其他常见KRAS突变的肿瘤患者。本文介绍了一种可逆的三复合物RAS抑制剂RMC-7977，该抑制剂对突变型和野生型KRAS、NRAS和HRAS变体均具有广谱活性（一种多选择性RAS(ON)抑制剂）。临床前研究表明，RMC-7977对携带多种RAS基因型的RAS依赖性肿瘤具有显著活性，尤其对携带KRAS 12号密码子突变（KRASG12X）的癌症模型效果显著。RMC-7977治疗可导致肿瘤消退，并在多种RAS依赖性临床前癌症模型中显示出良好的耐受性。此外，RMC-7977还能抑制对KRAS(G12C)抑制剂耐药的KRASG12C癌症模型的生长，这归因于其对RAS通路信号的恢复作用。因此，多选择性RAS(ON)抑制剂可以靶向多种致癌性和野生型RAS亚型，有望治疗多种RAS依赖性癌症，满足其巨大的未满足临床需求。一种相关的多选择性RAS(ON)抑制剂RMC-6236目前正在KRAS突变型实体瘤患者中进行临床评估（ClinicalTrials.gov注册号：NCT05379985）[1]。FLT3抑制剂（FLT3i），例如吉普替尼，在急性髓系白血病（AML）中具有临床活性，但其应用受到RAS/MAPK突变克隆耐药性的限制。这些突变克隆可能单独存在，也可能与FLT3突变或其他驱动基因（例如KIT突变）联合存在。RAS突变也常与IDH1/2抑制剂和BCL2抑制剂维奈托克治疗后的复发相关。重要的是，复发时会发现多种异质性耐药克隆。此外，5-10%的新诊断急性髓系白血病（AML）患者携带致癌性RAS突变。携带RAS突变或其他激活RAS/MAPK信号通路突变的患者无法从临床批准的靶向治疗中获益。靶向致癌性RAS一直极具挑战性，而抑制MAPK通路下游效应因子（如MEK）在临床试验中显示出疗效有限且毒性较高。因此，有效抑制RAS/MAPK通路是急性髓系白血病（AML）治疗中亟待解决的关键问题。RMC-7977是一种强效的口服小分子抑制剂，可同时抑制野生型和突变型GTP结合RAS癌蛋白（RAS MULTI）。它是临床候选药物RMC-6236的临床前研究化合物，目前正在进行临床评估（NCT05379985）。 RMC-7977 与细胞内分子伴侣环孢素 A 非共价结合，形成一种对所有 RAS 亚型均具有高亲和力的新型结合界面。由此产生的三元复合物通过空间位阻阻断 RAS 效应蛋白的相互作用，从而抑制致癌信号传导。我们报道了体外数据，支持 RAS MULTI(ON) 抑制剂在 RAS 突变型急性髓系白血病 (AML) 模型中的临床前价值，包括那些由于 RAS 信号过度激活而对 FLT3 抑制剂产生耐药性的模型。鉴于患者肿瘤异质性与靶向治疗的临床耐药性之间的关联，我们研究了 RMC-7977 在能够重现接受 FLT3 抑制剂治疗的患者中观察到的克隆增殖模式的模型中的体外活性。我们将携带 FLT3-ITD 突变（Molm-14）、FLT3-ITD 和 NRAS 共突变（Molm-14 NRASQ61K）以及仅携带 NRAS 突变（OCIAML-3）的荧光标记细胞系混合。然后，我们用 RMC-7977 单独处理这些混合细胞，以及 RMC-7977 与吉普替尼或维奈托克联合处理这些混合细胞 96 小时，并通过流式细胞术评估细胞活力。吉普替尼和吉普替尼/维奈托克联合用药均能促进携带 NRAS 突变细胞的存活，而 RMC-7977 则抑制所有细胞群的增殖。RMC-7977 与吉瑞替尼联合用药在同时携带 FLT3 和 FLT3-NRAS 共突变的细胞混合物中显示出更优的活性，但在仅携带 NRAS 突变的细胞中，其疗效并不优于 RMC-7977 单药治疗。值得注意的是，RMC-7977 与维奈托克联合用药在所有细胞系模型中均能有效抑制细胞活力，其疗效显著优于 RMC-7977 单药治疗。目前正在进行体内研究，以评估 RMC-7977 及其联合疗法在 RAS 突变/FLT3i 耐药的患者来源异种移植模型中的耐受性和活性，相关结果将在后续报告中发表。总之，我们的数据提供了临床前证据，表明采用 RAS MULTI(ON) 抑制剂的联合疗法可以有效抑制 RAS 突变型 AML 克隆，而 RAS 突变是目前 AML 中已获批准的靶向疗法的常见耐药机制，构成了一项重大的临床挑战。[2]

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预计广谱 RAS 抑制剂将使约四分之一的 RAS 突变驱动型癌症患者获益。 RMC-7977 是一种对 KRAS、HRAS 和 NRAS 的活性 GTP 结合形式具有高度选择性的抑制剂，对突变型和野生型变体均有亲和力。超过 90% 的人类胰腺导管腺癌 (PDAC) 病例是由 KRAS 的激活突变驱动的。[3]

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RMC-7977 是由 Revolution Medicines 公司开发的一种新型、首创的泛 RAS 抑制剂。它通过一种独特的“三重复合物”机制，靶向所有三种主要 RAS 亚型（KRAS、HRAS 和 NRAS）的活性 GTP 结合状态，该机制使其能够同时结合靶向 RAS 和丰富的细胞蛋白亲环蛋白 A (CYPA)。这种创新机制使其克服了早期直接 RAS 抑制剂的诸多局限性，使其成为治疗多种 RAS 突变型癌症（约占所有人类癌症的 20-30%）的极具前景的临床前候选药物。

C47H60N8O6S

865.094309806824

864.44

C, 65.25; H, 6.99; N, 12.95; O, 11.10; S, 3.71

2765082-12-8

164726623

White to light yellow solid powder

4.7

172Ų

2

12

8

62

1620

5

CCN1C2=C3C=C(C=C2)C4=CSC(=N4)C[C@@H](C(=O)N5CCC[C@H](N5)C(=O)OCC(CC3=C1C6=C(N=CC(=C6)N7CCN(CC7)C8CC8)[C@H](C)OC)(C)C)NC(=O)C9[C@H]1[C@@H]9COC1

NBLZKEHVVJSAAY-OFTZCYAMSA-N

InChI=1S/C47H60N8O6S/c1-6-54-39-12-9-28-18-31(39)33(43(54)32-19-30(22-48-42(32)27(2)59-5)53-16-14-52(15-17-53)29-10-11-29)21-47(3,4)26-61-46(58)36-8-7-13-55(51-36)45(57)37(20-40-49-38(28)25-62-40)50-44(56)41-34-23-60-24-35(34)41/h9,12,18-19,22,25,27,29,34-37,41,51H,6-8,10-11,13-17,20-21,23-24,26H2,1-5H3,(H,50,56)/t27-,34-,35+,36-,37+,41+/m0/s1

(1R,5S,6r)-N-((63S,4R,Z)-12-(5-(4-cyclopropylpiperazin-1-yl)-2-((S)-1-methoxyethyl)pyridin-3-yl)-11-ethyl-10,10-dimethyl-5,7-dioxo-61,62,63,64,65,66-hexahydro-11H-8-oxa-2(4,2)-thiazola-1(5,3)-indola-6(1,3)-pyridazinacycloundecaphane-4-yl)-3-oxabicyclo[3.1.0]hexane-6-carboxamide

2765082-12-8; SCHEMBL25774785; RMC-7977; RMC 7977; RMC7977; EX-A7974;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。