Cuproptosis
Cu(II)-Elesclomol targets multiple cellular pathways to exert its anticancer effects. It induces cuproptosis, a recently discovered form of regulated cell death that is dependent on copper accumulation. The compound also induces apoptosis in cancer cells and causes G1 cell cycle arrest. Additionally, Cu(II)-Elesclomol induces DNA double-strand breaks and weakly inhibits DNA topoisomerase I. The copper ion is essential for the compound's activity, as the copper complex is responsible for generating reactive oxygen species and inducing oxidative stress in cancer cells.

强效抗癌药物elesclomol可与铜形成极其稳定的络合物，目前正在进行临床试验。然而，其作用机制尚不完全清楚。用elesclomol或Cu(II)-elesclomol处理人红白血病K562细胞后，细胞生长立即停止，数小时后细胞活力丧失。Annexin V结合实验表明，elesclomol或Cu(II)-elesclomol处理K562细胞可诱导细胞凋亡。Elesclomol或Cu(II)-elesclomol处理可导致同步化中国仓鼠卵巢细胞G1期阻滞。Elesclomol和Cu(II)-elesclomol可诱导K562细胞DNA双链断裂，提示它们可能通过损伤DNA发挥细胞毒性作用。 Cu(II)-elesclomol 对 DNA 拓扑异构酶 I (5.99.1.2) 具有微弱的抑制作用，但对 DNA 拓扑异构酶 IIα (5.99.1.3) 无活性。Elesclomol 或 Cu(II)-elesclomol 处理对活 K562 细胞的线粒体膜电位几乎没有影响。NCI COMPARE 分析表明，Cu(II)-elesclomol 的细胞毒性机制与其他具有细胞毒性的铜螯合化合物类似。使用过表达多种 ATP 结合盒 (ABC) 型外排转运蛋白的交叉耐药细胞系进行的实验表明，elesclomol 和 Cu(II)-elesclomol 对过表达 ABCB1 (Pgp) 或 ABCG2 (BCRP) 的细胞均无交叉耐药性，但对过表达 ABCC1 (MRP1) 的细胞则表现出轻微的交叉耐药性。总之，这些结果表明，elesclomol 可导致细胞生长迅速停止，诱导细胞凋亡，并且可能部分通过其损伤 DNA 的能力抑制细胞生长[1]。体外实验表明，Cu(II)-Elesclomol 可诱导 K562 细胞（慢性粒细胞白血病细胞系）凋亡，并导致 G1 期细胞周期阻滞。该化合物还能诱导癌细胞 DNA 双链断裂。Cu(II)-Elesclomol 对 DNA 拓扑异构酶 I 具有弱抑制作用，DNA 拓扑异构酶 I 是一种在 DNA 复制和转录过程中缓解 DNA 扭转应力的酶。该化合物诱导铜诱导细胞凋亡的能力代表了一种新的作用机制，可能对耐药癌症有效。

目前关于Cu(II)-Elesclomol的体内活性数据有限。基于其强大的体外抗癌活性和作用机制，该化合物有望在黑色素瘤和其他氧化应激敏感型恶性肿瘤的动物模型中展现出抗肿瘤疗效。此类化合物的典型体内研究包括给荷瘤小鼠模型给药，并评估肿瘤生长抑制、生存率以及铜凋亡和细胞凋亡的生物标志物。

拓扑异构酶 I DNA 松弛试验和拓扑异构酶 IIα kDNA 解链及切割试验[1]
采用先前描述的凝胶试验来确定 elesclomol 或 Cu(II)–elesclomol 是否抑制拓扑异构酶 I。pBR322 DNA 购自 MBI Fermentas，拓扑异构酶 I 购自 TopoGEN。拓扑异构酶 I 抑制剂喜树碱 (20 μM) 用作阳性对照。采用我们先前描述的凝胶试验来确定 elesclomol 或 Cu(II)–elesclomol 是否抑制拓扑异构酶 IIα 的催化解链活性。kDNA 由高度环状 DNA 组成的网络结构，在拓扑异构酶 IIα 的 ATP 依赖性反应中解链，生成单个的 DNA 小环。抗癌药物产生的拓扑异构酶II切割DNA共价复合物可通过十二烷基硫酸钠（SDS）快速变性该复合物酶而被捕获。在37℃下，药物诱导的闭合环状质粒pBR322 DNA切割形成线性DNA后，用溴化乙锭凝胶电泳分离SDS处理后的反应产物，方法基本与之前所述相同，不同之处在于，在加入药物之前，所有反应混合物的组分均在冰上混合。

---

对于非细胞体外实验，评估Cu(II)-Elesclomol对DNA拓扑异构酶I活性的影响。将纯化的拓扑异构酶I与该化合物和DNA底物孵育，并通过琼脂糖凝胶电泳测量超螺旋DNA的松弛情况。该化合物诱导DNA损伤的能力也可以使用无细胞DNA切割实验进行评估。可以进行结合研究，以表征 Cu(II)-Elesclomol 与其分子靶标之间的相互作用。

细胞生长和活力、细胞周期同步化、细胞周期分析和膜联蛋白V流式细胞术[1]
使用台盼蓝法测定总细胞密度和活力，实验在Bio-Rad TC10™全自动细胞计数器上进行。在这些实验中，将密度为50,000个细胞/ml的红白血病K562细胞接种于96孔板中，并用200 nM elesclomol或Cu(II)–elesclomol持续处理不同时间。细胞周期同步化实验按照我们之前描述的方法进行。由于坏死细胞膜对碘化丙啶具有通透性，产生强烈的红色荧光，因此也可以测量坏死细胞的数量。在同步化实验中，将中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养至汇合，培养基为添加10%胎牛血清的α-MEM。将细胞以 2 × 10⁴ 个细胞/ml 的密度接种于含 0% 胎牛血清的 α-MEM 培养基中，饥饿培养 48 小时后，再用含 10% 胎牛血清的 α-MEM 培养基补充血清。补充血清后，立即将细胞置于直径 35 mm 的培养皿中，分别用 DMSO 溶剂对照或 50 nM 的 elesclomol 或 Cu(II)-elesclomol 处理不同时间。细胞用 75% 乙醇固定，并在室温下用含有 20 μg/ml 碘化丙啶、100 μg/ml RNase A 和 0.1% (v/v) Triton X-100 的溶液染色 30 分钟。使用 BD FACSCanto™ II 流式细胞仪系统进行流式细胞术分析，并使用 FlowJo 软件分析细胞周期中处于亚 G0/G1 期、G0/G1 期、S 期和 G2/M 期的细胞比例。[1]
用 elesclomol 和 Cu(II)–elesclomol 处理 K562 细胞后诱导的凋亡细胞比例，通过双色流式细胞术同时测量积分绿色（Annexin V-FITC）荧光和积分红色（碘化丙啶）荧光进行定量，方法如我们之前所述。使用凋亡检测试剂盒测定 Annexin V-FITC 与细胞外膜上磷脂酰丝氨酸的结合。简而言之，将悬浮的 K562 细胞在 37 °C 下孵育 5 小时，期间不进行任何处理，或用指定浓度的 elesclomol 或 Cu(II)–elesclomol 处理。细胞经1000 × g离心3分钟收集，合并的细胞用厂家提供的结合缓冲液洗涤。约2.5 × 10⁵个细胞重悬于500 μl厂家提供的结合缓冲液中，并与5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶混合，最终浓度为1 μg/ml。避光孵育15分钟后，使用流式细胞仪分析细胞。[1]

---

线粒体膜电位测定[1]
用不同浓度的elesclomol或Cu(II)–elesclomol处理K562细胞。将线粒体膜电位传感染料JC-1加载到悬浮的K562细胞（96孔黑色板，每孔20万个细胞）中。具体操作为：将细胞与8 μM JC-1在Hank's缓冲液（pH 7.4，Ca2+/Mg2+浓度分别为1.3 mM和0.8 mM）中于37 °C孵育20分钟，具体方法如前所述。之后，用Hank's缓冲液轻轻洗涤细胞。使用BMG Fluostar Galaxy荧光酶标仪测定经不同浓度elesclomol或Cu(II)-elesclomol处理6小时的细胞的红色荧光（激发波长λEx 544 nm，发射波长λEm 590 nm）与绿色荧光（激发波长λEx 485 nm，发射波长λEm 520 nm）的平均比值，该比值可作为线粒体膜电位的指标。如前所述，我们使用离子载体缬氨霉素（1 μM，可使线粒体膜去极化）和阿霉素（1.6 μM）作为阳性对照。

---

在体外细胞实验中，我们测试了 Cu(II)-Elesclomol 在多种癌细胞系（包括 K562 细胞）中的作用。用该化合物的系列稀释液处理细胞，并使用标准方法检测细胞活力。通过 Annexin V 染色和流式细胞术检测细胞凋亡。通过碘化丙啶染色和流式细胞术进行细胞周期分析。通过 γ-H2AX 灶的免疫荧光染色评估 DNA 双链断裂。还可以检测铜依赖性细胞死亡标志物，以确认铜依赖性细胞死亡的诱导。该化合物在 DMSO 中的溶解度为 5 mg/mL。

在体内动物研究中，Cu(II)-Elesclomol 通常会在黑色素瘤或其他癌症的异种移植小鼠模型中进行评估。将已建立肿瘤的小鼠通过腹腔或静脉注射给予不同剂量的化合物。定期使用游标卡尺测量肿瘤体积，并计算肿瘤生长抑制率。在研究终点，可检测肿瘤组织中铜凋亡、细胞凋亡和 DNA 损伤的生物标志物。监测体重和总体健康状况以评估耐受性。

Cu(II)-Elesclomol 的药代动力学数据有限。作为一种分子量为 462.05 的铜-药物复合物，该化合物的药代动力学性质会受到铜代谢和分布的影响。该化合物可溶于 DMSO，因此可以配制成多种溶剂用于体内给药。粉末可在 -20°C 下保存长达 3 年，或在 4°C 下保存 2 年；溶剂中的储备液可在 -80°C 下保存 6 个月，或在 -20°C 下保存 1 个月。需要进一步的药代动力学研究来全面表征其 ADME 特性。

Cu(II)-Elesclomol 的毒理学数据有限。作为一种含铜化合物，它能诱导铜凋亡和氧化应激，因此其毒性特征会受到铜积累和氧化还原活性的影响。开发该化合物用于治疗需要进行全面的毒理学研究，包括急性毒性、重复给药毒性、遗传毒性和器官特异性毒性评估。该化合物仅供研究使用，不得用于人体。

[1]. Cellular mechanisms of the cytotoxicity of the anticancer drug elesclomol and its complex with Cu(II). hem Pharmacol. 2015 Feb 1;93(3):266-76.

埃雷斯克洛莫是一种新型抗癌药物，已在晚期黑色素瘤患者中完成了III期临床试验，目前正在进行针对其他多种癌症的I期和II期临床试验（http://www.clinicaltrials.gov）。埃雷斯克洛莫和Cu(II)–埃雷斯克洛莫（图1）均表现出强大的体外活性，通常在低纳摩尔浓度下也能抑制癌细胞生长。一些研究表明，埃雷斯克洛莫的细胞毒性是通过其Cu²⁺复合物介导的氧化应激诱导。最近对铜复合物作为抗癌药物的开发进行了综述。一项使用HClO特异性荧光探针的最新研究表明，埃雷斯克洛莫可以在乳腺癌MCF7细胞中诱导产生高度活跃、强氧化性的HClO。然而，目前尚不清楚这是否是直接或间接的效果。埃雷斯克洛莫对Cu²⁺和Cu⁺均具有强结合亲和力。埃雷斯克洛莫可以从培养基中清除铜，并选择性地将其运输到线粒体，从而诱导氧化应激。研究表明，埃雷斯克洛莫将铜运输到细胞内后，会被细胞排出，然后可以自由地将更多铜运输到细胞内。MCF7细胞在修复氧化DNA损伤的能力受损时对埃雷斯克洛莫更为敏感，这表明埃雷斯克洛莫可能还通过DNA损伤机制发挥一些细胞毒性作用。有趣的是，研究表明，血清乳酸脱氢酶水平正常的患者在接受埃雷斯克洛莫治疗后预后优于血清乳酸脱氢酶水平高的患者。酵母基因缺失突变体的研究表明，埃雷斯克洛莫的作用机制并不是通过特定的细胞蛋白靶点，而是与任何其他目前批准的抗癌药物不同[1].

---

Cu(II)-埃雷斯克洛莫是埃雷斯克洛莫的Cu²⁺复合物，能够诱导癌细胞发生铜死亡、凋亡、G1细胞周期停滞和DNA双链断裂。该化合物对DNA拓扑异构酶I的抑制作用较弱，并在针对抗氧化能力低的癌细胞方面显示出前景，特别是在黑色素瘤和其他对氧化应激敏感的恶性肿瘤中。Cu(II)-埃雷斯克洛莫代表了一类新型抗癌药物，利用铜依赖的细胞死亡途径。

C19H18CUN4O2S2

462.047822475433

461.016

C, 49.39; H, 3.93; Cu, 13.75; N, 12.13; O, 6.93; S, 13.88

1224195-72-5

488832-69-5 (Elesclomol)

155813013

Brown to reddish brown solid

107Ų

0

6

2

28

516

0

CN(C(=S)C1=CC=CC=C1)[N-]C(=O)CC(=O)[N-]N(C)C(=S)C2=CC=CC=C2.[Cu+2]

UUSCWIGUMPDFDE-UHFFFAOYSA-L

InChI=1S/C19H20N4O2S2.Cu/c1-22(18(26)14-9-5-3-6-10-14)20-16(24)13-17(25)21-23(2)19(27)15-11-7-4-8-12-15;/h3-12H,13H2,1-2H3,(H2,20,21,24,25);/q;+2/p-2

copper;[benzenecarbonothioyl(methyl)amino]-[3-[benzenecarbonothioyl(methyl)amino]azanidyl-3-oxopropanoyl]azanide

NSC766922; NSC-766922; Cu(II) Elesclomol; Cu(II)Elesclomol

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。