| 规格 | 价格 | |
|---|---|---|
| 500mg | ||
| 1g | ||
| Other Sizes |
| 靶点 |
MLKL-IN-4 (Compound 56) targets Mixed Lineage Kinase Domain-like Protein (MLKL).
It covalently binds to the Cys86 residue of human MLKL. [1] |
|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
在HT-29细胞中，MLKL-IN-4（化合物56）能强效抑制TSZ（TNFα、Smac模拟物和z-VAD-FMK）诱导的坏死性凋亡，其EC50值为31 nM。[1]
该化合物在HeLa细胞中对凋亡（由TNFα联合放线菌酮，或TNFα联合Smac，或ABT737联合S63845诱导）或铁死亡（由PACMA31联合瑞戈非尼诱导）无抑制作用，显示出对坏死性凋亡的特异性。[1] 在高达10 μM的浓度下，该化合物在体外对RIP1或RIP3激酶活性无显著抑制作用。[1] 蛋白质印迹分析显示，在经TSZ处理的HT-29细胞中，该化合物不影响RIPK1和MLKL的磷酸化状态。[1] 该化合物不能抑制小鼠胚胎成纤维细胞中TSZ诱导的坏死性凋亡，表明其活性具有物种特异性，这与小鼠MLKL蛋白中缺乏Cys86残基有关。[1] 从机制上看，该化合物能显著抑制MLKL向细胞膜的易位，此结论通过膜组分蛋白质印迹分析和p-MLKL的免疫荧光染色得到证实。[1] 通过检测高分子量MLKL的蛋白质印迹分析，发现该化合物对MLKL的寡聚化仅有微弱或轻微的抑制作用。[1] 在洗涤/非洗涤细胞实验中，将HT-29细胞与该化合物预孵育长达3小时后进行洗涤，其EC50值与未洗涤的对照组相似，证实了其作为共价抑制剂的作用机制。[1] 在使用MLKL探针TC13136的Pull-down实验中，MLKL-IN-4（化合物56）能高效竞争探针与MLKL的结合，证实了其直接且特异地与靶蛋白结合。[1] 在HT-29 MLKL敲除细胞中表达MLKL突变体的实验中，该化合物在表达C86S突变体的细胞中活性消失，证实了与Cys86的共价结合是其抑制功能所必需的。[1] 与黄嘌呤类抑制剂TC13172不同，该化合物在表达F148A突变体的细胞中活性部分保留，表明其作用模式存在差异。[1] 该化合物在表达K157A突变体的细胞中能完全抑制细胞死亡。[1] 化合物 56 (MLKL-IN-4) (10 μM) 不会改变 MLKL 或 RIPK1 的磷酸化状态，但会略微抑制 RIPK1[1]。在 HT-29 细胞中，MLKL-IN-4（1 μM，24 小时）可防止 MLKL 转位到细胞膜上[1]。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
化合物 56，MLKL-IN-4，在 48 小时内表现出 T1/2 和超过 150 倍的还原型谷胱甘肽 (GSH) 反应速率，这可能减轻其脱靶效应和细胞毒性[1]。
|
| 酶活实验 |
使用ADP-Glo激酶测定法评估了对RIPK1和RIPK3的潜在脱靶效应。在白色384孔板中，将重组RIP1激酶（1-375）或全长RIP3激酶与测试化合物（1 μM和10 μM）或DMSO对照预孵育15分钟。测定缓冲液包含25 mM HEPES (pH 7.2)、20 mM MgCl2、12.5 mM MnCl2、5 mM EGTA、2 mM EDTA、12.5 mM β-甘油磷酸酯和2 mM DTT。对于RIP3，测定缓冲液包含5 mM MgCl2，而非20 mM MgCl2和12.5 mM MnCl2。通过加入ATP/MPB（髓鞘碱性蛋白）底物混合物启动反应。在室温下反应90分钟后，加入ADP-Glo试剂和检测溶液。通过测量发光强度来定量ADP的生成量。使用多激酶抑制剂Ponatinib作为阳性对照。MLKL-IN-4（化合物56）在高达10 μM的浓度下未显示对RIP1或RIP3激酶活性的显著抑制。[1]
通过化学反应评估了该化合物与谷胱甘肽巯基的共价结合能力。将MLKL-IN-4（化合物56）与谷胱甘肽在DPBS缓冲液中孵育，并监测其反应速率。该反应的半衰期超过48小时，比TC13172（半衰期为20分钟）慢150倍以上。[1] 通过质谱法确认了其与人MLKL的Cys86残基直接共价结合。将重组人MLKL蛋白与MLKL-IN-4（化合物56）孵育，然后对修饰后的蛋白进行酶解。LC-MS/MS分析及所得的b/y离子谱图表明，该化合物共价结合于含有Cys86的肽段上。[1] |
| 细胞实验 |
在HT-29细胞中评估了坏死性凋亡抑制活性。将细胞接种于96孔板（每孔4000个细胞）。12小时后，加入TNFα (20 ng/mL)、Smac模拟物 (100 nM) 和 z-VAD-FMK (20 nM) (TSZ) 以及不同浓度的测试化合物诱导坏死性凋亡。24小时后，使用Cell Titer-Glo检测试剂盒，通过测量ATP水平来确定细胞活力。使用非线性回归模型计算EC50值。MLKL-IN-4（化合物56）的EC50测定为31 nM。[1]
为了评估其对坏死性凋亡的特异性，使用不同细胞死亡通路的诱导剂处理HeLa细胞。外源性凋亡由TNFα (50 ng/mL) 联合放线菌酮 (1.25 μg/mL) 或TNFα (50 ng/mL) 联合Smac (10 μM) 诱导。内源性凋亡由ABT737 (5 μM) 联合S63845 (2 μM) 诱导。铁死亡由PACMA31 (1 μM) 联合瑞戈非尼 (10 μM) 诱导。用MLKL-IN-4（化合物56）处理细胞24小时后，通过ATP水平评估细胞活力。结果显示该化合物对这些其他形式的细胞死亡无抑制作用。[1] 为确定其共价机制，进行了洗涤/非洗涤实验。将HT-29细胞接种于96孔板。24小时后，用MLKL-IN-4（化合物56）处理细胞5分钟、1小时或3小时。然后移除培养基，并用冷的磷酸钠缓冲液洗涤细胞三次，再加入TSZ处理24小时。另设一组未洗涤的化合物处理作为对照。通过ATP水平测定细胞存活率。不同预孵育时间下洗涤样品的EC50值与未洗涤对照组的EC50值相似，证实了其共价抑制作用。[1] 为了通过蛋白质印迹分析MLKL的寡聚化和磷酸化，用TSZ和MLKL-IN-4（化合物56）（1 μM）处理HT-29细胞6或8小时。收集细胞沉淀，用裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，10%甘油，1% Triton X-100，蛋白酶和磷酸酶抑制剂）裂解。裂解产物经SDS-PAGE分离后，用MLKL、p-MLKL、RIP1、p-RIP1和GAPDH抗体进行免疫印迹分析。该化合物对p-MLKL无影响，但对寡聚化仅有轻微影响。[1] 为分析膜易位，如上所述处理细胞8小时。使用Triton X-114裂解缓冲液对细胞裂解物进行相分离，以分离可溶性组分和膜组分。使用MLKL抗体进行蛋白质印迹分析，结果显示该化合物阻断了MLKL向膜的易位。GAPDH和COXIV分别用作可溶性组分和膜组分的对照。[1] 在MLKL-flag HT-29细胞中进行免疫荧光染色。用TSZ和化合物处理细胞8小时，用4%多聚甲醛固定，用0.1% Triton X-100透化，并用5% BSA封闭。使用抗p-MLKL抗体和荧光素标记的二抗检测p-MLKL。细胞核用Hoechst 33342染色。与DMSO对照组相比，MLKL-IN-4（化合物56）处理后，细胞质中出现了更小的p-MLKL斑点。[1] 通过细胞毒性实验和结晶紫染色评估了化合物对细胞存活和增殖的影响。用MLKL-IN-4（化合物56）处理HT-29细胞长达4天，每48小时更换一次含相同化合物的新鲜培养基。通过ATP水平测量细胞活力，并在7天后使用0.1%结晶紫染色评估集落形成能力。高浓度的该化合物不影响细胞存活或增殖。[1] 为了研究作用模式，在HT-29 MLKL敲除细胞中重建野生型MLKL或突变体（C86S、F148A、K157A）。用TSZ和化合物处理这些细胞24小时。通过ATP水平测定细胞活力。MLKL-IN-4（化合物56）在C86S细胞中活性消失，在F148A细胞中活性部分保留，在K157A细胞中活性完全保留。[1] |
| 参考文献 |
| 分子式 |
C30H27CLN4O5
|
|---|---|
| 分子量 |
559.01
|
| 精确质量 |
558.166997
|
| CAS号 |
3031406-17-1
|
| PubChem CID |
165368937
|
| 外观&性状 |
Typically exists as solid at room temperature
|
| LogP |
3.4
|
| tPSA |
110 Ų
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
2
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
5
|
| 可旋转键数目(RBC) |
8
|
| 重原子数目 |
40
|
| 分子复杂度/Complexity |
1170
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| SMILES |
N-[6-chloro-1-[3-[4-hydroxy-3-[(2-oxo-1-pyridinyl)methyl]phenyl]prop-2-ynyl]-3-methyl-2,4-dioxopyrimidin-5-yl]-3-(4-methylphenyl)propanamide
|
| InChi Key |
ATSRNJYTNQHJIO-UHFFFAOYSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C30H27ClN4O5/c1-20-8-10-21(11-9-20)13-15-25(37)32-27-28(31)35(30(40)33(2)29(27)39)17-5-6-22-12-14-24(36)23(18-22)19-34-16-4-3-7-26(34)38/h3-4,7-12,14,16,18,36H,13,15,17,19H2,1-2H3,(H,32,37)
|
| 化学名 |
N-[6-chloro-1-[3-[4-hydroxy-3-[(2-oxo-1-pyridinyl)methyl]phenyl]prop-2-ynyl]-3-methyl-2,4-dioxopyrimidin-5-yl]-3-(4-methylphenyl)propanamide
|
| 别名 |
MLKL-IN-4; compound 56 [PMID: 36136378]; CHEMBL5195950; SCHEMBL27384347; ...; 3031406-17-1;
|
| HS Tariff Code |
2934.99.9001
|
| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
|
| 溶解度 (体外实验) |
May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples
|
|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。
注射用配方
注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)(IP/IV/IM/SC等) *生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。 注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline) 注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil) 示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。 View More
注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)] 口服配方
口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠) 口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素) 示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。 View More
口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400) 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 1.7889 mL | 8.9444 mL | 17.8888 mL | |
| 5 mM | 0.3578 mL | 1.7889 mL | 3.5778 mL | |
| 10 mM | 0.1789 mL | 0.8944 mL | 1.7889 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
RIPK1 ligand-Linker Conjugate-1
RIPK1-ligand-2
RIPK1-IN-34
RIPK1-IN-35
InvivoChem的所有产品仅用于作科学研究，不面向患者销售
Copyright 2020 InvivoChem LLC | All Rights Reserved 粤ICP备20063088号-1
粤公网安备 44011102003439号
463611831
