PDE4B (IC50 = 7.2 nM)

在人 PBMC 中，nerandomilast（二水合物）可抑制由植物血凝素 P（Phytohemagglutinin P）和脂多糖诱导的 TNF-α 引起的 IL-2 释放，IC50 值分别为 9 nM 和 35 nM [2]。 Nerandomilast（二水合物）的 IC50 值为 91 nM，可抑制大鼠全血中 TNF-α 的释放[2]。

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Nerandomilast/BI 1015550优先抑制磷酸二酯酶4B [2]
Nerandomilast/BI 1015550优先抑制PDE4B对cAMP的水解，IC50为10 nmol/L，而PDE4A为248 nmol/L， PDE4C为8,700 nmol/L， PDE4D为91 nmol/L（表1）。在相似的实验条件下，人PDE7A和人PDE3A的IC50值分别为14 μmol/L和120 μmol/L，对PDE7A和PDE3A的影响较小。同样，人PDE1C仅在高IC50值（以cAMP和cGMP为底物时分别为46 μmol/L和85 μmol/L）时被抑制，人PDE9A（底物cGMP）的IC50值为100 μmol/L。BI 1015550对人PDE2A和PDE5无抑制作用，对牛PDE6无抑制作用。

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Nerandomilast抑制纯化人外周血单个核细胞肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-2的释放[2]
在人PBMCs中，BI 1015550抑制lps诱导的TNF- α释放，IC50为35 nmol/L（图1A），抑制植物血凝素p诱导的IL-2释放，IC50为9 nmol/L（图1B）。

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Nerandomilast体外抑制脂多糖诱导的肿瘤坏死因子-α在人和大鼠全血中的释放，并刺激白细胞介素-6在大鼠体内的释放，而在人体内没有，全血[2]
在大鼠全血中，BI 1015550完全抑制TNF-α释放，IC50值为91 nmol/L。在人全血中，BI 1015550抑制TNF-α释放高达70-80%，IC50值为670 nmol/L（图2A）。在相同的实验条件下，与未添加PDE4抑制剂的lps处理样品相比，高浓度BI 1015550导致大鼠全血中IL-6的浓度依赖性增加了四倍（图2B）。相比之下，在人全血中，高浓度BI 1015550不会导致IL-6增加，而是导致IL-6释放的浓度依赖性降低，最大抑制率约为30-40%（图2B）。

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与尼达尼布相比，Nerandomilast对人肌成纤维细胞转化具有互补作用，与尼达尼布联合使用对成纤维细胞增殖具有协同作用[2]
BI 1015550抑制TGF-β刺激的IPF-LF α-SMA蛋白表达，IC50为210 nmol/L。与10-100 nmol/L的尼达尼布联合使用没有产生额外的抑制效果（图6A）。最高浓度为100 nmol/L的尼达尼布对α-SMA蛋白表达无抑制作用。BI 1015550能减弱TGF-β诱导的Col1、Col3和FN mRNA的表达，IC50值分别为269、213和246 nmol/L（图6B-D）。与100 nmol/L的尼达尼布联用对Col3 mRNA表达有抑制作用（图6C）。BI 1015550抑制bFGF + il -1β诱导的细胞增殖，IC50为255 nmol/L。Nintedanib （100 nmol/L）单独使用可抑制15%的增殖。BI 1015550与100 nmol/L尼达尼布联合使用可产生协同抑制作用，并使浓度-响应曲线向左移动，IC50为23 nmol/L（图6E）。BI 1015550与吡非尼酮（100µmol/L）联合使用在体外实验中对两种描述的成纤维细胞没有产生任何额外的抑制作用（数据未显示）。

1.0mg/kg的Nerandomilast（二水合物）（实施例2）减少了大鼠的肠道转运，但对体重没有明显影响（0、0.3、1.0和3.0mg/kg；口服；单剂量）[1]。 nerandomilast（二水合物）的 ED50 值为 0.1 mg/kg，可以减轻大鼠肺组织的炎症[1]。 nerandomilast（二水合物）（0.01、0.1 和 1.0 mg/kg；口服；单剂量）以剂量依赖性方式减少小鼠血浆中脂多糖 诱导的 TNF-α 释放[2]。 nerandomilast（二水合物）（0.1、0.3 和 1.0 mg/kg；口服；单剂量）可防止雄性 Suncus Murinus 和 Wistar 大鼠的支气管肺泡灌洗液被脂多糖诱导的中性粒细胞入口侵入 [2]。 Nerandomilast（二水合物）（口服；每天两次，持续六天；2.5 mg/kg 和 12.5 mg/kg）显着增强博莱霉素 对小鼠的损伤 [2]。

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BI 1015550/Nerandomilast抑制小鼠离体全血中脂多糖诱导的肿瘤坏死因子-α释放 [2]
在初步实验中，3 mg/kg剂量的BI 1015550对TNF-α抑制率达93%（数据未显示）。后续实验显示，当小鼠分别接受0.01、0.1和1 mg/kg BI 1015550处理时，呈现剂量效应关系。计算得出抑制LPS诱导TNF-α释放半数有效量（ED50）为0.04 mg/kg（图3）。

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BI 1015550/Nerandomilast抑制脂多糖诱导的中性粒细胞浸润雄性树鼩和Wistar大鼠支气管肺泡灌洗液 [2]
为直接比较疗效与耐受性，在暴露于雾化LPS的树鼩BALF中评估了BI 1015550的体内活性。
未接触LPS的空白对照组动物BALF中仅存在极少量中性粒细胞。LPS暴露导致中性粒细胞大量浸润BALF。使用0.1、0.3和1 mg/kg剂量的Nerandomilast/BI 1015550处理动物后，对LPS诱导的中性粒细胞浸润呈现剂量依赖性抑制，计算ED50为0.6 mg/kg（图4）。罗氟司特（0.3、1和3 mg/kg）作为参照（ED50=1 mg/kg）。
BI 1015550/奈拉多米司特（0.01、0.1和1 mg/kg）与罗氟司特（0.3、1和3 mg/kg）在雄性Wistar大鼠中抑制LPS诱导的肺中性粒细胞浸润，ED50分别为0.1 mg/kg和1 mg/kg（数据未显示）。

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BI 1015550/Nerandomilast/奈拉多米司特在雄性树鼩中致吐潜能较低 [2]
给予0.5 mg/kg（接近中性粒细胞浸润模型确定的ED50）剂量的奈拉多米司特/BI 1015550后，24只实验动物中有3只出现呕吐，平均每只动物呕吐0.1次（数据未显示）。当剂量提升至6 mg/kg BI 1015550（约中性粒细胞浸润实验ED50的10倍）时，24只动物中有5只（21%）出现呕吐，平均每只0.3次（表2）。而10 mg/kg罗氟司特（10倍ED50）导致10/24只动物（42%）呕吐，平均每只0.7次。BI 1015550的致吐潜能与空白对照组（24只中2只呕吐，平均0.1次/只）及溶媒对照组（0.5% Natrosol）（24只中3只呕吐，平均0.1次/只）相当。

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BI 1015550/奈拉多米司特在小鼠治疗性博来霉素模型中具有活性 [2]
该模型典型表现为：动物在博来霉素给药后约第3天出现体重下降，但从第8天起恢复正常增重。奈拉多米司特/BI 1015550治疗对体重增长无显著影响（数据未显示）。
博来霉素攻击后用力肺活量（FVC）下降。低剂量奈拉多米司特/BI 1015550（2.5 mg/kg）仅产生数值上微小但无统计学意义的改善。而高剂量BI 1015550（12.5 mg/kg，每日两次）使FVC显著提升41%（p < 0.05）（图5A；表3）。
博来霉素攻击导致肺压力-容积（PV）环受损。低剂量奈拉多米司特/BI 1015550对PV环仅有数值上微小改善。高剂量BI 1015550则使PV环显著改善40%（p < 0.05）（图5B）。30 cm/H2O压力下计算的静态顺应性（Cstat）同样获得改善（图5C；表3）。
博来霉素给药显著增加µCT评估的肺组织密度，而高剂量BI 1015550使致密纤维化组织与全肺体积比数值上降低39%（表3），但与未治疗组相比未达统计学显著性。

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BI 1015550/奈拉多米司特在二氧化硅颗粒诱导的进行性肺纤维化治疗性小鼠模型中具有活性 [2]
单次鼻腔滴注二氧化硅引发强烈肺部炎症，表现为BALF中总细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞显著增加，以及MPO、KC等促炎介质升高。采用治疗性给药方案（第10-30天）口服0.25、0.75和2.5 mg/kg剂量的奈拉多米司特/BI 1015550，结果总结见表4。BI 1015550呈剂量依赖性改善肉芽肿形成、纤维化和炎症的显微评分，但未达统计学显著性。在BALF检测细胞中，最高剂量BI 1015550（2.5 mg/kg）显著抑制巨噬细胞和中性粒细胞（p < 0.5）。其他BALF参数（MPO和KC）在较高剂量（0.75和2.5 mg/kg）时也大幅抑制，但同样未达统计学显著性。BI 1015550减轻肺重量，但该效应无剂量依赖性。

用闪烁接近法测定重组磷酸二酯酶体外活性[2]
将质粒转化为DH10Bac细菌，用bacmid DNA转染SF9昆虫细胞，将得到的杆状病毒储存起来，用于进一步的感染。为了生产蛋白质，SF9细胞被感染，直到出现细胞病变效应（大约72小时后），SF9细胞被收获并通过3个冷冻/解冻循环破碎，并用注射器通过0.1 mm套管剪切10次。细胞质细胞提取物经离心（10 min, 14000 × g, 4℃）分离。测定蛋白质含量，加入等体积87% （v/v）的甘油，在- 20℃冷冻。磷酸二酯酶闪烁接近试验（TRKQ7090用于[3H]cAMP， TRKQ7100用于[3H]cGMP）基本上按照说明书进行。简单地说，连续稀释Nerandomilast/BI 1015550（终二甲基亚砜（DMSO）浓度为1.1% (v/v)）。实验溶液中含有重组杆状病毒表达的PDE（活性为5.000-20.000 cpm，相当于添加总活性的5-20%）、50 mmol/L Tris/HCl pH 7.5、8.3 mmol/L MgCl2、1.7 mmol/L EGTA和10 μL放射性标记底物（0.05 μ Ci in H2O），在30℃（终体积100 μL）下孵育1小时。加入50µL硅酸钇闪烁邻近测定珠（17.8 mg/mL， 18 mM硫酸锌in H2O）停止反应，使用Wallac Microbeta闪烁计数器测定生成的[3H]AMP/[3H]GMP相关量。

人外周血单个核细胞肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-2的释放[2]
制备外周血单核细胞（PBMCs）时，将健康供者新鲜抽取的200 mL人血与50 mL酸-柠檬酸-葡萄糖溶液（38 mmol/L柠檬酸、75 mmol/L三柠檬酸钠和121 mmol/L葡萄糖）和50 mL Hanks缓冲生理盐水混合，覆盖在Ficoll上，300 × g离心30 min。PBMCs在含有6% （v/v）自体血浆的rmi -1640培养基中稀释至浓度为5 × 106个细胞/mL。PBMCs在37°C， 5% CO2, 95%湿度条件下，在Nerandomilast/BI 1015550存在或不存在的条件下，用100 ng/mL LPS（血清型055:B5） 刺激4小时（TNF-α测定），或用10µg/mL植物血凝素P 刺激20小时（IL-2测定）。取上清液，酶联免疫吸附法测定细胞因子。 <人力资源> 人和大鼠全血中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的释放[2]
取WI（汉族）雄性大鼠腹主动脉和健康男性供血者肝素化全血，分别用1µL（大鼠）或2.5µL（人）Nerandomilast/BI 1015550或载药[终DMSO浓度0.5% (v/v)]处理。最终测定量为200 μL（大鼠）和500 μL（人）。在37°C、95%湿度和5% CO2条件下孵育30分钟后，用LPS[终浓度10µg/mL（大鼠），0.1µg/mL（人）]或生理盐水处理培养物。7 h后，4℃下3.200 × g离心10 min，血浆检测细胞因子。Meso Scale Discovery （MSD）大鼠和人促炎面板用于检测大鼠血浆[稀释1:2 (v/v)]和人血浆[阴性对照未稀释，其他样品稀释1:200 (v/v)]中的TNF-α和IL-6。 <人力资源> 人成纤维细胞功能[2]
来自IPF供体的成纤维细胞（IPF- lf）在补充了FGM-2单试剂盒和生长因子的成纤维细胞基础培养基中生长。细胞在37°C和5% CO2的加湿培养箱中生长。所有的测定都在第7或第8代进行。为了进行实验设置，将细胞播种在成纤维细胞生长培养基中，并添加与实验相关密度的补充剂。对于TGF-β刺激的实验，细胞以每孔4500个细胞的速度在96孔板中接种。在96孔板上进行增殖试验，第0天初始播种细胞密度为每孔2000个细胞。24h后，将细胞培养基改为饥饿培养基（不添加成纤维细胞基础培养基）。饥饿24小时后，将细胞与不同浓度Nerandomilast/BI 1015550加/减不同浓度的尼达尼布和/或1 nmol/L PGE2预孵育30分钟，并在化合物存在的情况下用实验相关刺激刺激30分钟。

动物/疾病模型： 大鼠[1]。
剂量： 0、0.3、1.0 和 3.0 mg/kg。
给药途径： 灌胃（po）；单次给药。
实验结果： 对大鼠的肠胃毒性和副作用极小，表明其具有生物安全性。

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动物/疾病模型： 雄性鲎（Suncus Murinus）和Wistar大鼠；小鼠[2]。
剂量： 0.01、0.1、0.3、1.0、2.5 或 12.5 mg/kg。
给药途径： 灌胃（po）；单次给药或每日两次，连续6天。
实验结果：有效改善肺组织炎症，并降低促炎因子TNF-α的释放。\n

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\n\n脂多糖诱导雄性鼯猴和Wistar大鼠支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞浸润[2]
\n鼯猴在系统发育上更接近灵长类动物而非啮齿类动物，并且已被证明对典型的PDE4抑制剂（如罗利普兰和地布芬林）的催吐作用非常敏感（Sawanishi等，1997）。与其他用于研究PDE4抑制剂催吐作用的动物物种（如雪貂、狗、小型猪或猴子）相比，鼯猴可以进行足够数量的动物试验，从而提供较高的统计效力。将Nerandomilast/BI 1015550或罗氟司特悬浮于0.5% Natrosol（羟乙基纤维素）溶液中。实验采用雄性Suncus murinus大鼠（体重50-55 g）或雄性Wistar大鼠（体重200-250 g），每组8只。在LPS暴露前30分钟，分别口服Nerandomilast/BI 1015550（剂量分别为0.1、0.3和1.0 mg/kg）或罗氟司特（剂量分别为0.3、1和3 mg/kg）。具体操作为：将阳性对照组和治疗组的动物置于一个圆形有机玻璃腔室中，该腔室分为16个扇形隔间，每个隔间放置一只动物，然后依次暴露于雾化LPS 30分钟。用于雾化治疗的LPS溶液为1 mg/mL LPS的磷酸盐缓冲液（PBS）。雾化治疗使用市售的PARI Master®雾化器及PARI Master® LL适配器进行。LPS暴露4小时后，对动物进行麻醉，并通过颈椎脱臼处死。处死后，对气管进行插管，并进行支气管肺泡灌洗，方法是注入并重复抽吸两次1 mL或5 mL（大鼠）灌洗液（PBS + 2%牛血清白蛋白）。手动记录BALF的体积。使用血细胞计数器测定支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中的中性粒细胞数量。\n

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\n\n博来霉素小鼠模型 [2]
\n本研究使用查尔斯河实验室 (Charles River) 提供的 10-12 周龄、未经试验的成年雄性 C57BL6/6J 小鼠（体重 25-27 g）。该模型基本按照 Ackermann 等人 (2017) 描述的方法建立。简而言之，将博来霉素 1 mg/kg 经气管内给药，给药体积为 2 mL/kg 体重。每日称量动物体重。体重下降 20% 或以上即实施安乐死。从第 8 天到第 13 天，每天两次（bid）以 10 mL/kg 的剂量通过灌胃法给予 Nerandomilast/BI 1015550（最终剂量分别为 2.5 和 12.5 mg/kg）。第 12 天，使用 3-4% 异氟烷麻醉动物，并使用配备心脏门控（无呼吸门控）的 Quantum FX µCT 系统进行微型计算机断层扫描 (µCT) 分析，以评估肺密度。使用 MicroView 2.0 软件分析图像。将分割像素的 HU 直方图峰值对应的亨氏单位 (HU) 值作为纤维化的指标。µCT 分析后，让动物从麻醉中苏醒。第 14 天，使用 FlexiVent 系统测量肺功能[压力-容积环、用力肺活量 (FVC) 和静态肺顺应性 (Cstat)]。肺功能测定后，动物被注射过量纳可林处死，并用0.8 mL PBS进行两次肺灌洗。支气管肺泡灌洗液（BALF）用于测定细胞分类计数和单核细胞数量。左肺叶用4%多聚甲醛固定，并在20 cm水压下充气20分钟。样本经石蜡包埋、切片（3 μm厚）后，按照标准组织病理学操作规程进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色，以评估其一般形态和纤维化改变。使用配备AxioVision软件的AxioCam MRm显微镜相机采集图像。Masson三色染色的肺组织切片采用Ashcroft评分评估肺纤维化的严重程度。所用方案为治疗性方案，即在肺纤维化应该已经出现时开始治疗，符合美国胸科协会特发性肺纤维化（IPF）模型专家组的建议（Jenkins 等，2017）。\n

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\n\n二氧化硅诱导小鼠肺部炎症和纤维化[2]
\n从二氧化硅滴注后第10天开始，至第30天（治疗方案），分别给予小鼠0.25、0.75和2.5 mg/kg剂量的BI 1015550/Nerandomilast，每日两次，溶于0.5% Natrosol溶液（10 mL/kg）中。实验采用8周龄BL6小鼠。实验方法的详细信息已在其他文献中描述（Lo Re 等，2010）。简而言之，小鼠通过鼻内滴注接受2.5 mg/只的二氧化硅颗粒。对照组小鼠经鼻内滴注给予相应的生理盐水。小鼠在二氧化硅给药30天后处死，并在尸检时记录宏观变化。测量肺重，采集支气管肺泡灌洗液（BALF）进行总细胞计数和细胞分类计数，并测定髓过氧化物酶（MPO）活性和角质形成细胞衍生细胞因子（KC，人GRO蛋白的对应物）的含量。此外，还进行了肺组织学检查（HE染色和铬变苯胺蓝染色），并采用半定量分析评估炎症、肉芽肿和纤维化评分。

BI 1015550 在疾病模型中的疗效和效力将取决于其他病理生理学方面，以及该化合物在 24 小时内的药代动力学和可用性，由于该化合物的半衰期较短，24 小时内的血浆浓度将低于最大血浆浓度。[2]

Jascayd最常见的副作用（≥5%）包括腹泻、COVID-19、上呼吸道感染、抑郁、体重下降、食欲减退、恶心、疲劳、头痛、呕吐、背痛和头晕。
腹泻是导致治疗中断的最常见不良反应，在接受18 mg奈兰多司特（4%）或9 mg奈兰多司特（3%）联合抗纤维化治疗的患者中发生率最高，而接受安慰剂联合抗纤维化治疗的患者中发生率较低（1%）。值得注意的是，在未同时接受尼达尼布治疗的患者中，1%接受18 mg奈兰多司特治疗的患者因腹泻而中断治疗，而接受9 mg奈兰多司特或安慰剂治疗的患者均未出现因腹泻而中断治疗的情况。

[1]. Piperidino-dihydrothienopyrimidine sulfoxides and their use for treating COPD and asthma. United States. US9150586.

[2]. BI 1015550 is a PDE4B Inhibitor and a Clinical Drug Candidate for the Oral Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Front Pharmacol. 2022 Apr 20:13:838449.

口服选择性磷酸二酯酶4 (PDE4) 抑制剂的抗炎和免疫调节作用使其分别获批用于治疗慢性阻塞性肺疾病和银屑病/银屑病关节炎。然而，PDE4抑制剂的抗纤维化潜力尚未在临床上得到探索。Nerandomilast/BI 1015550 是一种新型PDE4抑制剂，对PDE4B具有优先的酶抑制作用。体外实验表明，BI 1015550 可抑制人外周血单核细胞中脂多糖 (LPS) 诱导的肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和植物血凝素诱导的白细胞介素-2的合成，以及人全血和鼠全血中LPS诱导的TNF-α合成。体内实验表明，口服BI 1015550可通过抑制LPS诱导的小鼠体外TNF-α合成，以及通过抑制雾化LPS刺激的中性粒细胞流入鳐鱼支气管肺泡灌洗液，展现出强效的抗炎活性。在鳐鱼中，PDE4抑制剂会引起呕吐，这是限制PDE4抑制剂在人体应用的常见胃肠道副作用，而BI 1015550的治疗指数似乎比罗氟司特显著提高。此外，在两种常用的肺纤维化小鼠模型（分别由博来霉素或二氧化硅诱导）中，口服BI 1015550在治疗条件下也表现出疗效，其作用机制是通过调节多种模型特异性参数。为了更好地了解BI 1015550在体内的抗纤维化潜力，我们体外研究了其对特发性肺纤维化（IPF）患者人成纤维细胞的直接作用。BI 1015550抑制了转化生长因子-β刺激的肌成纤维细胞转化和多种细胞外基质蛋白的mRNA表达，以及碱性成纤维细胞生长因子和白细胞介素-1β诱导的细胞增殖。在这些实验中，尼达尼布总体上表现平平，但有趣的是，当其与BI 1015550联合使用时，对细胞增殖的抑制作用表现出协同效应，导致浓度-反应曲线向左移动约10倍。总之，BI 1015550 对 PDE4B 的独特优先抑制作用及其在人体中预期的良好耐受性，以及其抗炎和抗纤维化的潜力，表明 BI 1015550 是一种有希望的口服临床候选药物，可用于治疗 IPF 和其他纤维增生性疾病。 [2]本文描述了新型口服PDE4抑制剂Nerandomilast/BI 1015550的临床前药理学特性，该抑制剂优先抑制PDE4B。在庞大的PDE同工酶超家族中，Nerandomilast/BI 1015550选择性抑制PDE4，并且在针对一系列酶和受体的筛选中（Cerep高通量筛选和Cerep非激酶酶筛选，Euriofins Cerep，法国Celle L'Escevault），迄今为止未显示任何其他脱靶效应。与目前市面上唯一用于治疗肺部疾病的口服PDE4抑制剂罗氟司特相比，BI 1015550通过优先抑制PDE4B，展现出独特的PDE4亚型抑制特性（表1）。早期PDE4抑制剂，包括罗氟司特和阿普米司特，因其在人体中引起的恶心、呕吐和/或腹泻等胃肠道副作用而受到限制。尽管尚未证实，但有证据表明这些副作用与PDE4D亚型的抑制有关（Giembycz，2002）。就此而言，BI 1015550对PDE4B的抑制选择性比PDE4D高约10倍，可能具有临床意义。这也可能解释了为什么在鳐鱼（Suncus murinus）中，BI 1015550的治疗比（抑制LPS诱导的中性粒细胞浸润肺部与诱导呕吐的比值）优于罗氟司特（图4；表2）。更重要的是，正在进行的BI 1015550 I期临床试验支持该化合物在人体中具有良好的胃肠道耐受性和安全性（数据未显示）。BI 1015550在人体应用的另一个方面与动物研究中观察到的毒性有关。PDE4抑制剂的主要毒性，尤其是在大鼠中，是诱发不同组织中的血管病变（血管炎、动脉炎），这在某种程度上是自相矛盾的，因为PDE4抑制与抗炎疗效密切相关（见下文）。尽管两种口服PDE4抑制剂罗氟司特和阿普米司特已上市多年，但尚未有患者报告诱发血管炎，但对于新型PDE4抑制剂的引入，这种潜在的严重副作用仍然令人担忧。Dietsch等人。 Dietsch等人（2006）率先报道了PDE4抑制剂IC542可刺激大鼠体内IL-6的表达。由于IL-6可能是诱发大鼠血管炎的候选因子，而BI 1015550在人体中未观察到对IL-6的刺激作用（图2B），这可能表明，与大鼠相比，BI 1015550在人体中诱发血管炎的风险可能很低。此外，值得注意的是，有报道称阿普米司特对白塞氏病（一种以血管炎症为特征的血管炎）具有临床活性，其最常见的症状之一——口腔溃疡——得以缓解（Hatemi 等，2015）。
尽管对 PDE4D 亚型的抑制作用有所减弱，但 PDE4 抑制剂众所周知的抗炎和免疫调节特性在 Nerandomilast/BI 1015550 中仍然明显。与罗氟司特（Hatzelmann 和 Schudt，2001）在性质上相似，BI 1015550 似乎是人外周血单核细胞 (PBMC) 中 TNF-α 和 IL-2 的强效抑制剂（图 1），这很可能反映了 BI 1015550 分别对单核细胞和 T 淋巴细胞的影响。在全血中也观察到了对TNF-α的有效抑制（图2），这一点非常重要，因为这种检测方法（离体）可作为临床研究中的药效学生物标志物，正如Timmer等人首次在罗氟司特中证实的那样（Timmer等人，2002）。尽管BI 1015550在人全血中对TNF-α的IC50值（670 nmol/L）高于人外周血单核细胞（PBMC）（35 nmol/L），这可能部分归因于该化合物中等的血浆蛋白结合率（77%），但其效力损失仍高于预期。为了模拟临床情况，本研究在小鼠模型中证实了该化合物在离体全血中对LPS刺激的TNF-α具有强效抑制作用（图3）。显然，在本小鼠模型中，口服BI 1015550（0.04 mg/kg）的ED50值远低于下文讨论的小鼠肺纤维化疾病模型（博来霉素、二氧化硅）。然而，在前述的离体模型中，血液样本是在接近化合物血浆浓度峰值时采集的，虽然TNF-α作为药理学指标可能与肺纤维化病理有关，但它并非唯一的相关介质。 BI 1015550 在疾病模型中的疗效和效力将取决于其他病理生理因素，以及该化合物在 24 小时内的药代动力学和生物利用度。由于该化合物的半衰期较短，其 24 小时内的血药浓度将低于最大血浆浓度。
肺纤维化中异常的伤口愈合过程会经历一个炎症期，炎症细胞（特别是巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和 T 淋巴细胞）参与其中，细胞因子（例如 TNF-α 和 IL-1β）和生长因子（例如 TGF-β 和 CTGF）水平升高，从而形成一个有利于慢性组织重塑和纤维化的生化环境。基于肺纤维化病理生理学的工作假设，BI 1015550/Nerandomilast 的抗炎（抑制 TNF-α、抑制单核细胞、抑制中性粒细胞浸润肺部）和免疫调节（抑制 IL-2、抑制 T 细胞）特性有望在一定程度上改善纤维化。因此，我们感兴趣的是 BI 1015550 是否在不同的动物模型中发挥抗纤维化作用，以及该化合物是否对成纤维细胞和肌成纤维细胞有直接作用。
博来霉素已被广泛用于啮齿动物肺纤维化模型，以了解纤维化发生的机制并评估潜在的新疗法。然而，值得注意的是，尽管博来霉素诱导的肺纤维化模拟了人类疾病的许多特征，但啮齿动物的纤维化可以消退，而人类的纤维化通常是不可逆的。此外，人类肺纤维化主要影响外周气道，而啮齿动物的纤维化则更常见于中央气道周围。尽管存在这些局限性，博来霉素模型仍然是评估潜在化合物疗效的良好工具，可用于验证其原理（Moeller等，2008；Jenkins等，2017）。Nerandomilast/BI 1015550的治疗方案减轻了疾病病理的一些重要方面，包括FVC和Cstat的下降（图5）。这些治疗效果在最高BI 1015550剂量下具有统计学意义。此外，肺组织密度也得到了同等程度的改善，尽管这种改善未达到统计学意义（表3）。就Ashcroft评分而言，BI 1015550仅显示出不显著的抑制趋势。对于其他研究的实验参数（支气管肺泡灌洗液蛋白和单核细胞、气道顺应性），未检测到BI 1015550的影响。本研究中BI 1015550对支气管肺泡灌洗液中炎症介质无影响，且对组织学评估的肺纤维化影响甚微，这与其他人报道的博来霉素小鼠研究结果相反（Cortijo等，2009；Udalov等，2010）。我们只能推测，在我们实验条件下建立的博来霉素小鼠模型中出现的纤维化变化，并未被我们最初设计用于评估人类肺纤维化的评分系统所捕捉到。组织体积的变化可能不仅反映纤维化改变，还可能与模型中的其他重塑方面（例如新生血管形成）相关，正如Ackermann等人（Ackermann et al., 2017）所示。与既往研究的差异也可能源于治疗持续时间和数据收集时间的不同。无论这些变化的性质如何，肺功能等功能参数的改善表明BI 1015550对肺组织重塑具有积极作用。这一假设得到了BI 1015550在小鼠二氧化硅诱导肺纤维化模型中积极结果的支持。与诱导可逆性肺纤维化的博来霉素不同，二氧化硅颗粒诱导的是一种进行性肺纤维化，类似于人类进行性纤维化间质性肺病（ILD）。据我们所知，此前尚未在该动物模型中评估过优先抑制PDE4B的PDE4抑制剂。如表4所示，BI 1015550在治疗方案中实现了肉芽肿形成、炎症和纤维化半定量评分的剂量依赖性改善，尽管这些效果未达到统计学意义。在支气管肺泡灌洗液（BALF）中，最高剂量组的巨噬细胞和中性粒细胞显著受到抑制，而髓过氧化物酶（MPO）和枯否细胞（KC）的抑制未达到统计学意义。
总体而言，Nerandomilast/BI 1015550在两种肺纤维化模型中的有益作用与文献中的临床前数据相符，即选择性PDE4抑制剂不仅在肺纤维化中可能具有临床疗效，而且根据动物实验数据，可能对其他器官（例如肝脏、肾脏、结肠和/或皮肤）的纤维化也有效。多项研究支持这一假设，这些研究表明，选择性PDE4抑制剂除了能够靶向炎症细胞和免疫活性细胞外，还能直接靶向成纤维细胞。通过使用相关细胞，即来自特发性肺纤维化（IPF）患者的人肺成纤维细胞，我们证实了BI 1015550能够抑制TGF-β刺激的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化（图6A）。这表明BI 1015550的作用机制与尼达尼布不同，尼达尼布在这些条件下无效，且不能增强BI 1015550的疗效。此外，BI 1015550减弱了TGF-β诱导的Col1、Col3和FN基因表达（图6B-D），这些分子是纤维化细胞外基质的重要组成部分。当BI 1015550与100 nmol/L的尼达尼布联用时，对Col3表达的抑制作用具有叠加效应。此外，BI 1015550还抑制了bFGF和IL-1β诱导的细胞增殖。单独使用尼达尼布，在相关浓度（100 nmol/L）下，仅能抑制15%的细胞增殖。但最显著的是，BI 1015550与尼达尼布联用产生了协同抑制作用，并使浓度-效应曲线左移约10倍（图6E）。体外抑制人肺成纤维细胞增殖和肌成纤维细胞转化可能有助于解释BI 1015550在特发性肺纤维化（IPF）中的潜在临床疗效。此外，BI 1015550与尼达尼布联用可能对IPF及其他纤维化肺疾病患者产生协同治疗作用。这种优先抑制PDE4B的PDE4抑制剂与尼达尼布之间的协同作用此前尚未见报道。
总之，BI 1015550/Nerandomilast是一种口服优先抑制PDE4B的抑制剂，与市售的选择性口服PDE4抑制剂相比，其在人体中的耐受性似乎更好；临床前研究结果表明，该化合物有望成为治疗特发性肺纤维化（IPF）和其他间质性肺病（ILD）的口服候选药物。目前正在进行一项BI 1015550与安慰剂对照的IPF患者II期临床试验（NCT04419506）。未来的临床研究将揭示BI 1015550能否单独发挥显著疗效，或者是否需要与尼达尼布等IPF标准疗法联合使用才能充分发挥BI 1015550的治疗潜力。[2]

C20H29CLN6O4S

485.00

484.16595

Nerandomilast;1423719-30-5

170902251

Typically exists as solid at room temperature

125 Ų

4

11

5

32

624

0

C1CC(C1)(CO)NC2=NC(=NC3=C2S(=O)CC3)N4CCC(CC4)C5=NC=C(C=N5)Cl.O.O

HNNFNSBDBHISSY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H25ClN6O2S.2H2O/c21-14-10-22-17(23-11-14)13-2-7-27(8-3-13)19-24-15-4-9-30(29)16(15)18(25-19)26-20(12-28)5-1-6-20;;/h10-11,13,28H,1-9,12H2,(H,24,25,26);2*1H2

[1-[[2-[4-(5-chloropyrimidin-2-yl)piperidin-1-yl]-5-oxo-6,7-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-4-yl]amino]cyclobutyl]methanol;dihydrate

Nerandomilast dihydrate; BI1015550; BI-1015550

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。