(E/Z)-THZ1 dihydrochloride   中文名称: THZ1 Dihydrochloride

CDK7 (IC50 = 3.2 nM)

肿瘤癌基因包括选择一般转录机制来维持致癌状态的转录因子，但迄今为止，直接药理学抑制转录因子已被证明是困难的。然而，转录机制包含各种酶辅因子，可以靶向开发新的治疗候选物，包括细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）。在这里，我们介绍了共价CDK7抑制剂THZ1的发现和表征，THZ1具有前所未有的靶向位于规范激酶结构域外的远程半胱氨酸残基的能力，为CDK7的选择性提供了一种意想不到的方法。癌症细胞系图谱表明，癌症细胞系的一个子集，包括人类T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL），对THZ1具有异常的敏感性。Jurkat T-ALL细胞的全基因组分析表明，THZ1不成比例地影响RUNX1的转录，并表明对THZ1的敏感性可能是由于RUNX1超增强子赋予的脆弱性以及RUNX1在这些肿瘤细胞的核心转录调控回路中的关键作用。因此，CDK7激酶活性的药理学调节可能为鉴定和治疗依赖于转录维持致癌状态的肿瘤类型提供一种方法[1]。

抑制剂处理实验[1]
进行了扩展数据图5a中描述的时间过程实验，以确定CDK7完全失活所需的最短时间。用THZ1、THZ1-R或DMSO处理细胞0-6小时，以评估时间对THZ1介导的RNAPII CTD磷酸化抑制的影响。对于后续实验，除非另有说明，否则用上述时间过程实验确定的化合物处理细胞4小时。对于抑制剂洗脱实验（图2e，f；扩展数据图5），用THZ1、THZ1-R或DMSO处理细胞4小时。随后去除含有抑制剂的培养基以有效“洗脱”化合物，并允许细胞在没有抑制剂的情况下生长。对于每个实验，检测裂解物的RNAPII CTD磷酸化和其他特定蛋白质。

高通量细胞系平板活性测定[1]
将细胞接种在384孔微孔板中，在含有5%FBS和青霉素/链霉抗生物素的培养基中以约15%的融合率接种。用THZ1或DMSO处理细胞72小时，并用刃天青测定细胞存活率。

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细胞增殖试验[2]
在病毒感染和嘌呤霉素选择后，将细胞接种在1ml培养基中的12孔板（密度为5×103）中。14天后，细胞用1%甲醛固定15分钟，用结晶紫（0.05%，wt/vol）染色15分钟，这是一种染色质结合细胞化学染色。这些板在大量去离子水中广泛清洗，在滤纸上倒置干燥，并用爱普生扫描仪成像。 对于96孔板中的3天细胞增殖试验，细胞以每孔6000至10000个细胞的密度铺板，并在第二天用不同浓度的THZ1或YKL-116处理。孵育72小时后，将CellTiter-Glo试剂直接加入细胞中，并在平板阅读器上读取发光信号。

[1].Targeting transcription regulation in cancer with a covalent CDK7 inhibitor. Nature. 2014;511(7511):616-620.

[2].THZ1 Reveals Roles for Cdk7 in Co-transcriptional Capping and Pausing. Mol Cell. 2015;59(4):576-587.

THZ1 属于吲哚类化合物，其结构为 1H-吲哚，在 3 位被 5-氯-2-[3-(4-{[(2E)-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰基]氨基}苯甲酰胺基)苯胺基]嘧啶-4-基取代。它是一种选择性强效的 CDK7 共价抑制剂，在癌细胞系中表现出抗增殖作用。它可作为 EC 2.7.11.22（细胞周期蛋白依赖性激酶）抑制剂和抗肿瘤药物发挥作用。THZ1 属于吲哚类、氨基嘧啶类、苯甲酰胺类、有机氯化合物、烯酰胺类和仲羧酰胺类化合物。肿瘤癌基因包括一些转录因子，它们利用通用转录机制来维持肿瘤发生状态，但迄今为止，直接药理学抑制这些转录因子仍然十分困难。然而，转录机制包含多种酶促辅助因子，例如细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），这些因子可作为开发新型治疗候选药物的靶点。本文报道了一种共价 CDK7 抑制剂 THZ1 的发现和表征。THZ1 具有前所未有的能力，能够靶向位于经典激酶结构域之外的远端半胱氨酸残基，从而为实现 CDK7 的选择性提供了一种意想不到的途径。癌细胞系分析表明，包括人 T 细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）在内的部分癌细胞系对 THZ1 具有异常的敏感性。Jurkat T-ALL 细胞的全基因组分析显示，THZ1 对 RUNX1 的转录具有不成比例的影响，提示对 THZ1 的敏感性可能源于 RUNX1 超级增强子赋予的脆弱性以及 RUNX1 在这些肿瘤细胞核心转录调控回路中的关键作用。因此，通过药理学手段调控 CDK7 激酶活性可能为识别和治疗依赖转录维持致癌状态的肿瘤类型提供一种途径。[1]

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高级别浆液性卵巢癌的特征是广泛的拷贝数变异，其中 MYC 癌基因扩增发生在近一半的肿瘤中。我们证实，卵巢癌细胞高度依赖 MYC 来维持其致癌生长，这表明 MYC 是治疗这种难治性恶性肿瘤的潜在靶点。然而，直接靶向 MYC 已被证明十分困难。我们筛选了靶向转录和表观遗传调控的小分子，发现 THZ1（一种 CDK7、CDK12 和 CDK13 抑制剂）能显著下调 MYC 的表达。值得注意的是，仅靶向 CDK7 无法完全抑制 MYC 的表达，而需要联合抑制 CDK7、CDK12 和 CDK13。在11个源自接受过大量预处理的卵巢癌患者的异种移植模型中，THZ1的给药可显著抑制肿瘤生长，同时抑制MYC的表达。我们的研究表明，使用THZ1等药物靶向这些转录CDK可能是治疗MYC依赖性卵巢恶性肿瘤的有效方法。[2]

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小细胞肺癌（SCLC）是一种侵袭性强、死亡率高的疾病，因此迫切需要寻找有效的药物策略来靶向SCLC的生物学特性。我们利用高通量细胞筛选方法，对多种化合物库进行筛选，发现SCLC对转录靶向药物敏感，尤其是对THZ1——一种新近发现的细胞周期蛋白依赖性激酶7（CDK7）共价抑制剂。我们发现，包括MYC家族原癌基因和神经内分泌谱系特异性因子在内的超级增强子相关转录因子基因的表达对THZ1治疗高度敏感。我们提出，这些转录因子的下调在一定程度上导致了小细胞肺癌（SCLC）对转录抑制剂的敏感性，而THZ1代表了一种针对SCLC的靶向治疗原型药物。[3]

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MYC癌蛋白被认为通过扩增基因转录来刺激肿瘤细胞的生长和增殖，这种机制阻碍了大多数以抑制MYC功能作为潜在癌症疗法的尝试。我们使用细胞周期蛋白依赖性激酶7 (CDK7) 的共价抑制剂来破坏神经母细胞瘤细胞中扩增的MYCN的转录，结果表明该癌蛋白下调，从而导致MYCN驱动的整体转录扩增被大幅抑制。这种反应转化为高危神经母细胞瘤小鼠模型中肿瘤的显著消退，且未出现全身毒性。MYCN过表达细胞的显著治疗选择性与超级增强子相关基因（包括MYCN和神经母细胞瘤中其他已知的致癌驱动基因）的优先下调相关。这些结果表明，通过选择性靶向促进肿瘤细胞整体转录扩增的机制，CDK7抑制剂可能对由MYC家族癌蛋白驱动的癌症具有治疗价值。目的：食管鳞状细胞癌（OSCC）是一种侵袭性恶性肿瘤，也是食管癌的主要组织学亚型。尽管近年来大规模基因组分析提高了对OSCC遗传异常的认识，但目前已发现的可靶向基因组病变仍然很少，且尚无分子靶向治疗方法。本研究旨在寻找该肿瘤中的潜在药物靶点。设计：采用高通量小分子抑制剂筛选方法，筛选出有效的抗OSCC化合物。通过全转录组测序（RNA-Seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）来解析CDK7抑制剂在OSCC中的作用机制。我们进行了多种体外和体内细胞实验，以确定候选基因对口腔鳞状细胞癌（OSCC）恶性表型的影响。[4]

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结果：通过无偏倚的高通量小分子抑制剂筛选，我们发现了一种高效的抗OSCC化合物THZ1，它是一种特异性的CDK7抑制剂。RNA测序结果显示，低剂量THZ1处理可选择性抑制多种致癌转录本。值得注意的是，对这些THZ1敏感转录本的基因组特征进行进一步分析表明，它们通常与超级增强子（SE）相关。此外，仅SE分析就揭示了许多OSCC谱系特异性的主调控因子。最后，对THZ1敏感转录本和SE相关转录本的整合分析鉴定出多个新的OSCC癌基因，包括PAK4、RUNX1、DNAJB1、SREBF2和YAP1，其中PAK4是一种潜在的药物靶向激酶。结论：我们的整合方法构建了一个SE相关主调控因子和致癌转录本的目录，这可能显著促进对OSCC生物学的理解以及更具创新性的疗法的开发。[5]

C31H30CL3N7O2

638.97

637.152

2095433-94-4

129896819

Typically exists as solid at room temperature

115

6

6

9

43

896

0

CN(C)C/C=C/C(=O)NC1=CC=C(C=C1)C(=O)NC2=CC=CC(=C2)NC3=NC=C(C(=N3)C4=CNC5=CC=CC=C54)Cl.Cl.Cl

AJTGQOACYBCREM-QVLKBJGCSA-N

InChI=1S/C31H28ClN7O2.2ClH/c1-39(2)16-6-11-28(40)35-21-14-12-20(13-15-21)30(41)36-22-7-5-8-23(17-22)37-31-34-19-26(32)29(38-31)25-18-33-27-10-4-3-9-24(25)27;;/h3-15,17-19,33H,16H2,1-2H3,(H,35,40)(H,36,41)(H,34,37,38);2*1H/b11-6+;;

N-[3-[[5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl]amino]phenyl]-4-[[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]amino]benzamide;dihydrochloride

THZ1 Dihydrochloride; 2095433-94-4; THZ1 2HCl; (E/Z)-THZ1 (dihydrochloride); N-[3-[[5-chloro-4-(1H-indol-3-yl)pyrimidin-2-yl]amino]phenyl]-4-[[(E)-4-(dimethylamino)but-2-enoyl]amino]benzamide;dihydrochloride; THZ1Dihydrochloride; 1604810-83-4(free base);

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Typically soluble in DMSO (e.g. 10 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。