Sulodexide   中文名称: 舒洛地特

Antithrombotic; antithrombin III (AT III); heparin cofactor II (HC II)

舒洛地特降低肝素酶III诱导的MLMECs中SDC1脱落[1]
SDC1是主要表达于细胞表面的跨膜蛋白聚糖小家族成员，也是内皮糖萼降解的主要标志物。为减少LPS刺激对内皮细胞炎症反应的影响，我们使用肝素酶III作为糖萼特异性水解剂来探究糖萼脱落对内皮细胞的作用。虽然根据肝素酶III在硫酸乙酰肝素分子上的预期作用位点推测其不会引起SDC1脱落，但通过添加细菌肝素酶III减少硫酸乙酰肝素含量可显著增加SDC1脱落。舒洛地特是由具有抗炎特性的硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素组成的糖胺聚糖，能减少巨噬细胞释放LPS刺激的炎症介质。作为舒洛地特主要成分的肝素及其衍生物，被认为可结合急性期蛋白、补体蛋白、细胞因子和生长因子。此外，舒洛地特通过调节丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶以及参与糖萼脱落的基质金属蛋白酶发挥多种抗蛋白水解作用。

为测试舒洛地特对内皮糖萼层的影响，我们在肝素酶III存在条件下培养MLMECs和HUVECs。如预期所示，肝素酶III去除了内皮表面的硫酸乙酰肝素（图S2A,B）。值得注意的是，肝素酶III给药还诱导了MLMECs膜上SDC1的脱落，而补充舒洛地特在不同时间点均呈现显著挽救效果（图2A-C）。在HUVECs中也发现相同结果（图S2C,D）。随后我们评估舒洛地特是否通过上调SDC1基因表达来增加MLMECs中SDC1水平。因此在这些条件下测量了SDC1 mRNA表达，但发现不同处理组间SDC1 mRNA表达无差异（图S2E）。这些数据表明舒洛地特能改善肝素酶III诱导的SDC1表达，但不是通过增加SDC1基因表达实现。

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舒洛地特通过增强ZO-1表达防止内皮通透性增加[1]
使用Transwell系统评估舒洛地特对内皮细胞（EC）屏障功能的影响（图3A）。发现SDX可降低肝素酶III诱导的内皮通透性（图3B）。舒洛地特同样能预防肝素酶诱导的HUVECs内皮通透性增加（图S3A）。值得注意的是，与对照组相比SDX组的通透性有所改善。VE-cadherin和ZO-1是维持EC屏障功能的重要组分（24,25）。我们旨在确定SDC1脱落导致的内皮屏障功能障碍是否与ZO-1和VE-cadherin相关。Western blot分析显示，肝素酶III处理2h或4h后VE-cadherin和ZO-1水平显著降低（图3C,D）。有趣的是，补充舒洛地特给药上调了肝素酶III诱导的ZO-1水平而非VE-cadherin水平（图3C,D；S3B,C）。这些数据共同表明舒洛地特可通过增加ZO-1表达来预防糖萼脱落诱导的内皮通透性增加。

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舒洛地特通过阻断NF-κB信号激活改善通透性[1]
在不同病理生理条件下，NF-κB作为内皮细胞中的转录因子在炎症表型变化中起重要作用。糖萼破坏后，剪切应力导致ICAM-1蛋白表达上调和NF-κB激活增强。但尚不清楚肝素酶III降解糖萼时ZO-1的表达是否由NF-κB通路介导。为此我们评估了NF-κB/p-p65和总NF-κB/p65水平。在MLMECs/HUVECs中，磷酸化p65水平在肝素酶处理15/30分钟内显著增加，而添加舒洛地特后降低（图S4A,B）。舒洛地特给药使MLMECs/HUVECs中肝素酶处理后的磷酸化p65减少（图4A,B）。同样，NF-κB抑制剂Bay 11-7082给药显著减弱肝素酶III诱导的磷酸化p65增加，并提升ZO-1表达（图4C-F）。这些结果共同揭示：当肝素酶III降解MLMECs/HUVECs中糖萼时，NF-κB信号激活参与调控ZO-1表达。值得注意的是，舒洛地特可通过阻止NF-κB/ZO-1信号过度激活来促进糖萼重塑并改善通透性（图4G）。

舒洛地特抑制SDC1脱落改善脓毒症小鼠肺损伤并防止死亡[2]
我们采用CLP和LPS建立脓毒症模型（图5A）。首先检测了脓毒症小鼠血浆中SDC1水平，发现SDC1在脓毒症小鼠中表达上调。使用舒洛地特后，SDC1水平下调且脓毒症小鼠存活率提高（图5B-E）。但舒洛地特治疗未降低脓毒症期间IL-6水平（图5B,D）。这些数据表明舒洛地特能恢复存活率并降低脓毒症小鼠血浆中SDC1表达。
我们评估了小鼠肺部组织学特征。值得注意的是，LPS/CLP组的肺组织出现显著损伤，与对照组差异明显。相比LPS/CLP组，LPS+SDX/CLP+SDX组的形态学特征有显著改善（图5F,S5A）。通过测量肺组织湿干重比（W/D）评估肺血管通透性。结果显示舒洛地特显著抑制了LPS/CLP引起的肺组织W/D比升高（图5G,S5B）。最后通过肺组织荧光标记检测SDC1表达来评估糖萼损伤。脓毒症模型中SDC1表达低于对照组，而舒洛地特帮助维持了脓毒症模型肺组织中SDC1表达（图5H,I,S5C）。这些数据共同表明舒洛地特能预防小鼠肺损伤和脓毒症诱导的内皮糖萼脱落。

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DN小鼠随时间进展出现进行性蛋白尿和肾功能恶化，伴随系膜扩张、PKC与ERK激活、肾脏TGF-β1/纤连蛋白/I/III/IV型胶原表达增加，但glomerular perlecan表达降低。舒洛地特治疗显著减少蛋白尿、改善肾功能、增加glomerular perlecan表达并降低I/IV型胶原表达及ERK激活。肾小球内PKC-α激活不受舒洛地特影响，而纤连蛋白和III型胶原表达增加。30mM D-葡萄糖刺激的MMC显示PKC和ERK介导的纤连蛋白/III型胶原合成增加。单独使用舒洛地特可剂量依赖性显著增加MMC中纤连蛋白/III型胶原合成，且在30mM D-葡萄糖存在时增强此效应。舒洛地特对30mM D-葡萄糖诱导的PKC-βII和ERK磷酸化呈剂量依赖性抑制，但不影响PKC-α或PKC-βI磷酸化。
结论：数据显示虽然舒洛地特治疗能减少蛋白尿并改善肾功能，但对DN模型C57BL/6小鼠肾脏信号通路和基质蛋白合成产生差异调节[3]。

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舒洛地特是由肝素和硫酸皮肤素组成的混合糖胺聚糖。本研究采用氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型评估其抗血管生成效应。假注射OIR小鼠（P17）视网膜存在特征性中央无灌注区，而舒洛地特注射组该区域显著减小。通过SWIFT_NV测量的新生血管簇数量和平均新生血管管腔数在舒洛地特组显著降低。高压氧暴露导致VEGF、MMP-2和MMP-9水平升高，而舒洛地特治疗呈剂量依赖性降低这些因子水平。结果明确证实舒洛地特的抗血管生成作用，提示其可作为涉及新生血管形成的眼部病变辅助治疗候选药物[4]。

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舒洛地特是具有广泛药理活性的类肝素化合物，但其对肝纤维化的作用尚未见报道。本研究旨在评估舒洛地特对肝纤维化小鼠模型的治疗潜力并探索其抗纤维化机制。发现舒洛地特显著减轻TAA和DDC诱导的小鼠肝纤维化。转录组分析显示舒洛地特下调纤维化相关基因和肝窦内皮细胞（LSECs）毛细血管化相关基因。免疫组化证实纤维化肝组织中LSEC毛细血管化相关基因（CD34/CD31/Laminin）的表达升高被舒洛地特降低。扫描电镜显示舒洛地特能维持LSECs窗孔结构。qPCR和免疫荧光显示间充质标志物表达被舒洛地特下调，提示其抑制肝纤维化中LSECs的内皮-间质转化。体外实验证实舒洛地特保护原代LSECs免受内皮功能障碍。综上，舒洛地特通过恢复LSECs分化表型减轻小鼠肝纤维化，表明其可能成为肝纤维化患者的潜在疗法[5]。

细胞处理条件[2]
MLMECs被分为四组：（i）对照组；用无血清培养基处理细胞2小时；（ii）肝素酶III组；细胞用15mU/mL肝素酶III处理2小时、4小时或8小时，（III）SDX/Sulodexide组；细胞用30LSU/mL SDX处理2小时和（iv）肝素酶III+SDX组；用30 LSU/mL SDX预处理细胞2小时，然后用15 mU/mL肝素酶III预处理2小时、4小时或8小时。

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内皮屏障通透性评价[2]
使用Transwell系统（0.4μm孔径的聚酯膜插入物）培养MLMECs。通过测量内皮上的FD40来评估内皮屏障的通透性。MLMEC用或不用肝素酶III（15 mU/mL）或SDX/Sulodexide（30 LSU/mL）处理。我们向上部插入物中加入0.1 mg/mL的FD40，并向Transwell系统的下部隔室中加入等量的无血清培养基60分钟。分别在490和520 nm的激发和发射波长下测量上部插入物的荧光。

内毒素血症模型[2]
小鼠被随机分为四组（每组n=5）：LPS+SDX组、LPS组、舒洛地特/SDX组和对照组。各组小鼠分别腹腔注射LPS（30 mg/kg体重/只）和/或灌胃给予舒洛地特（40 mg/kg体重/只）。对照组和SDX组小鼠分别灌胃给予等量的生理盐水或舒洛地特。在生存实验中，LPS注射后120小时内，每天记录各组小鼠的死亡率三次。采用1%三溴乙醇进行全身麻醉，12小时后处死小鼠。从存活的小鼠中采集血液和肺组织样本。CLP诱导的多微生物脓毒症模型[2]
我们将小鼠随机分为四组（每组n=5）：对照组、CLP组、SDX/舒洛地特组和CLP+SDX组。CLP诱导的脓毒症模型是根据既往文献建立的。简而言之，在用1%三溴乙醇麻醉后，进行剖腹手术。用4-0丝线结扎盲肠1厘米，并用22号针头穿刺。拔出针头后，从穿刺孔挤出少量粪便。用6-0丝线缝合腹膜，并用4-0丝线间断缝合皮肤。对对照组小鼠进行相同的手术，但不进行结扎和穿刺。 CLP小鼠接受胃内灌注（ig.）舒洛地特（40 mg/kg）治疗。对照组小鼠注射等体积生理盐水（NS）。术后，所有小鼠均皮下注射40 mL/kg生理盐水进行复苏。24小时后处死所有小鼠。从存活小鼠中采集眼眶后静脉丛血和肺组织样本。

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雄性C57BL/6小鼠用链脲佐菌素诱导糖尿病。蛋白尿出现后，将小鼠随机分为两组，分别接受舒洛地特（1 mg/kg/天）或生理盐水治疗，持续12周，并检测肾功能、组织学和纤维化情况。同时，研究了舒洛地特对小鼠系膜细胞（MMC）纤维化的影响。
6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠在腹腔注射链脲佐菌素（STZ，50 mg/kg，溶于pH 4.5的10 mM柠檬酸缓冲液）前禁食6小时，连续5天给药。通过尾静脉采血检测血糖浓度（使用Accu-Chek Advantage II Glucostix血糖试纸）来确认糖尿病。每周使用QuantiChrom白蛋白检测试剂盒检测尿白蛋白，直至处死。在间隔两天的两次不同检测中，血糖水平升高（>10 mM）且尿白蛋白水平升高（>100 mg/dl）的小鼠（在动物实验中定义为“基线”）被随机分为两组，分别接受生理盐水（载体对照）或舒洛地特（1 mg/kg/天）灌胃治疗，疗程分别为2、4、8或12周（每组每个时间点6只小鼠）。治疗2、4、8和12周后，处死小鼠，通过心脏穿刺采集血样，取出肾脏，去除肾包膜并称重。左肾沿长轴垂直切开，一半肾组织用OCT包埋剂速冻后浸入液氮中，另一半肾组织用10%中性缓冲福尔马林固定后进行石蜡包埋。右肾的肾皮质组织与肾髓质分离，并冷冻于-80℃直至提取mRNA。另处死6只刚刚出现蛋白尿的糖尿病小鼠，以获得临床、组织学和形态计量学参数的基线值。阴性对照组包括用生理盐水或舒洛地特治疗12周的非糖尿病雄性C57BL/6小鼠。分别使用QuantiChrom肌酐和尿素检测试剂盒测定血清肌酐和尿素水平。 [3]

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小鼠氧诱导视网膜病变[4]
ICR幼鼠被随机分为三组：常氧组（对照组）、氧暴露组（OIR组）和舒洛地特组；每组包含一只哺乳母鼠和5-7只幼鼠。氧诱导视网膜病变的诱导方法如前所述。对于OIR模型，新生幼鼠在出生后第7天（P7）与其母鼠一起转移到氧气浓度为75±2%的氧气舱中，并使用ProOx 110氧气控制器持续监测120小时。在P12，将小鼠放回室温空气中，并每日腹腔注射（IP）生理盐水或溶于生理盐水的5-15 mg/kg舒洛地特。常氧组小鼠从出生到出生后第17天（P17）均在正常空气中饲养。

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肝纤维化小鼠模型[5]
采用硫代乙酰胺（TAA）或3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡啶（DDC）饮食诱导肝纤维化。TAA模型中，小鼠饮用水中添加400 mg/L TAA，持续16周，以建立肝纤维化小鼠模型。舒洛地特（商品名：Vessel Due F）通过灌胃法给予小鼠。小鼠随机分为三组（每组六只）：（a）对照组，（b）TAA+载体组，（c）TAA+舒洛地特（SDX）组。所有动物均自由摄取食物和水。对于DDC模型，小鼠饲喂含0.12%（w/w）DDC的饲料四周，以诱导肝纤维化和胆管炎。

[1]. Andreozzi GM. Sulodexide in the treatment of chronic venous disease. Am J Cardiovasc Drugs. 2012 Apr 1;12(2):73-81.

[2]. Sulodexide improves vascular permeability via glycocalyx remodelling in endothelial cells during sepsis. Frontiers in immunology, 2023, 14: 1172892.

[3]. Sulodexide decreases albuminuria and regulates matrix protein accumulation in C57BL/6 mice with streptozotocin-induced type I diabetic nephropathy. PLoS One. 2013;8(1):e54501.

[4]. Sulodexide inhibits retinal neovascularization in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. BMB reports, 2014, 47(11): 637.

[5]. Sulodexide attenuates liver fibrosis in mice by restoration of differentiated liver sinusoidal endothelial cell. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2023, 160: 114396.

背景：内皮糖萼的降解是脓毒症相关性肺损伤和肺血管通透性增加的关键因素。我们研究了糖胺聚糖合成前体舒洛地特是否在糖萼重塑中发挥生物学作用，并改善脓毒症中的内皮屏障功能障碍。方法：本研究纳入了28例因脓毒性休克入住复旦大学附属儿童医院儿科重症监护室（PICU）的患儿。分别于入组后第1天和第3天采集静脉血样本，并检测血浆中硫酸乙酰肝素和聚糖蛋白-1（SDC1）的水平。我们建立了肝素酶III诱导糖萼脱落的细胞模型，并通过脂多糖（LPS）注射和盲肠结扎穿刺术（CLP）在小鼠模型中诱导脓毒症。本研究使用舒洛地特（Sulodexide）预防内皮糖萼损伤。采用通透性试验、蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测内皮屏障功能和内皮相关蛋白的表达。同时评估了生存率、肺组织病理学以及肺湿重/干重比。总之，本研究揭示了SDC1在脓毒性休克患儿预后中一个此前未知的作用，即通过诱导内皮细胞中NF-κB依赖性信号通路介导的ZO-1破坏来促进血管通透性。因此，舒洛地特可能通过减弱糖萼脱落和下游内皮细胞信号通路（从而减少血管渗漏）来辅助治疗脓毒症。 [2]舒洛地特是一种糖胺聚糖混合物，可能降低糖尿病肾病 (DN) 的蛋白尿，但其作用机制和对肾脏组织学的影响尚不清楚。我们研究了舒洛地特对 I 型 DN 小鼠模型疾病表现的影响。总之，我们证实舒洛地特治疗可降低白蛋白尿，改善血清尿素水平，恢复蛋白聚糖表达，并改善雄性 C57BL/6 DN 小鼠的选择性肾脏组织病理学改变，包括减少 I 型和 IV 型胶原沉积以及 ERK 和 PKC-βII 的激活。相反，舒洛地特对 PKC-α 或 PKC-βI 的激活没有影响，但增加了肾小球而非肾小管间质中纤维连接蛋白和 III 型胶原的沉积。肾小球基质蛋白表达增加以及疾病进展过程中PKC-α或PKC-βI活化抑制能力下降，可能至少部分解释了舒洛地特在近期临床研究中未显示出疗效的原因，但仍需进一步研究证实。舒洛地特是否能对具有特定组织病理学特征的糖尿病肾病（DN）患者亚群提供肾脏保护作用，仍有待确定。[3] 总之，舒洛地特在小鼠视网膜病变模型中显示出抑制视网膜新生血管形成的作用，至少部分有效。舒洛地特通过抑制包括VEGF、MMP-1和MMP-9在内的促血管生成蛋白发挥作用。由于视网膜缺血后的病理性血管生成是导致失明的主要原因之一，因此迫切需要低毒性且具有强效抗血管生成活性的药物。我们的研究结果表明，舒洛地特符合这些标准，可作为眼部病理性血管生成治疗的辅助药物。该物质在眼内的药代动力学细节仍需进一步研究。[4]

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总之，我们提供了舒洛地特治疗两种小鼠肝纤维化模型疗效的证据；舒洛地特治疗可改善TAA和DDC诱导的小鼠肝纤维化模型。机制研究表明，舒洛地特可下调纤维化相关信号通路和肝窦内皮细胞（LSEC）毛细血管化相关基因。此外，舒洛地特治疗可保护LSEC窗孔，并抑制纤维化肝脏中的毛细血管化和内皮间质转化（EndMT）。与体内研究结果一致，体外实验表明，舒洛地特给药可最大限度地减少原代LSEC的毛细血管化和EndMT进展。这表明舒洛地特的抗纤维化活性是通过恢复分化的LSEC实现的。我们的研究结果首次揭示了口服舒洛地特治疗肝纤维化的潜在作用机制。[5]

57821-29-1

Colorless to light yellow Solid-Liquid Mixture

114.55

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。