EGFR (IC50 = 4 nM); ErbB2 (IC50 = 4 nM); HER3 (IC50 = 4 nM)

体外活性：AZD8931 对 NSCLC 和 SCCHN 细胞系显示出不同的效力。 AZD8931 对 PC-9 细胞（EGFR 激活突变）具有高敏感性，GI50 为 0.1 nM，对 NCI-1437 细胞具有低活性，GI50 高于 10 μM。在 PE/CA-PJ41、PE/CA-PJ49、DOK 和 FaDu 细胞中，AZD8931 对磷酸化 EGFR、磷酸化 erbB2 和磷酸化 erbB3 表现出比拉帕替尼或吉非替尼更强的效力。激酶测定：在杆状病毒/Sf21系统中克隆并表达人EGFR和erbB2的胞内激酶结构域。使用 ELISA 方法，用 Km 浓度（erbB2 为 0.4 mM，EGFR 为 2 mM）的 ATP 测定 AZD8931 的抑制活性。细胞测定：为了确定对体外生长的细胞系的抗增殖活性，在一组 NSCLC 和 SCCHN 细胞系中测试了 AZD8931。将细胞与 AZD8931 (0.001-10 μM) 一起孵育 96 小时。通过与 MTS 比色测定试剂一起孵育 4 小时并在分光光度计上测量 490 nm 处的吸光度来确定活细胞数。头颈肿瘤细胞系（KYSE-30、OE21、PE/CA-PJ15、PE/CA-PJ34（克隆 C12）、PE/CA-PJ41（克隆 D2）、PE/CA-PJ49、DOK、Detroit562、RPMI2650 、SCC-4、SCC-9、SCC-25、CAL 27、SW579、FaDu、Hs 840.T、KB、KYSE-450 和 HEp-2、HN5) 和 NSCLC 细胞系 (PC-9)。

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AZD8931显示出对EGFR和erbB2酪氨酸激酶的有效体外抑制作用。 AZD8931对细胞中配体刺激的EGFR磷酸化的抑制作用比吉非替尼或拉帕替尼更强。 AZD8931在体外也能有效抑制erbB2和erbB3介导的信号传导。 AZD8931在NSCLC和头颈部鳞状细胞癌细胞组中显示出明显的肿瘤细胞生长抑制模式。[1]

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AZD8931抑制EGFR通路活性。 AZD8931抑制人IBC细胞的增殖并诱导其凋亡。[2]

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作为替代方案，使用泛HER抑制剂AZD8931阻断CRC细胞中的HER3。因为我们确定其他HER受体不参与CRC细胞中EC CM对HER3的激活，所以泛HER抑制剂对EC CM诱导的细胞存活的影响主要是由于HER3的抑制。AZD8931几乎完全抑制了CRC细胞中的HER3磷酸化（图4C）。 此外，我们使用MTT法测定了AZD8931与LPEC CM和5-FU一起培养时对CRC细胞存活率的影响（图5A、C、E）。与CRC CM相比，LPEC-1 CM显著增加了活CRC细胞的相对数量，正如预期的那样。5-FU或AZD8931单药治疗降低了CRC CM和LPEC-1 CM中CRC细胞的存活率。当CRC细胞与5-FU和AZD8931联合治疗时，存活细胞的相对数量低至单药治疗的一半。然后，我们使用AZD8931来确定阻断HER3对CRC细胞化疗耐药性的影响（图5B，D，F）。单独使用AZD8931会导致在CRC或LPEC-1 CM中孵育的CRC细胞凋亡发生微小变化。单独使用5-FU会诱导CRC细胞凋亡，但在LPEC-1 CM中的诱导程度低于CRC-CM。相比之下，用5-FU和AZD8931处理的细胞的凋亡水平明显高于单独使用5-FU的细胞，即使在用LPEC-1 CM孵育的细胞中也是如此。这些数据表明，AZD8931抑制HER3可以阻断LPEC-1 ECM诱导的CRC细胞的化疗耐药性[4]。

AZD8931 在 BT474c、Calu-3、LoVo、FaDu 和 PC-9 异种移植物中显示出抗肿瘤活性。急性治疗后，AZD8931 可以减少 BT474c 异种移植物中的 p-Akt、Ki67 表达和 p-ERK。 AZD8931 还会诱导 M30 细胞凋亡标记物。此外，与吉非替尼和拉帕替尼相比，AZD8931 在 LoVo 异种移植物中显示出更强的促凋亡作用。

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沙皮替尼（AZD-8931）抑制EGFR敏感和erbB2敏感的人肿瘤异种移植物模型的生长[1]
在多种对靶向EGFR或erbB2的药物具有不同敏感性的模型中测试了AZD8931抑制小鼠体内人类肿瘤异种移植物生长的能力。口服AZD8931显著抑制了BT474c（乳腺）、Calu-3（NSCLC）、LoVo（结直肠）、FaDu（SCCHN）和PC-9（NSCLC）肿瘤异种移植物的生长（图4A、B、C、D和E），表明AZD8931在单独对EGFR抑制（LoVo和PC-9）或EGFR或erbB2抑制（BT474c、Calu-3和FaDu）有反应的异种移植物肿瘤模型中具有活性。没有选择性依赖单独erbB2的异种移植物模型。此外，我们发现拉帕替尼在LoVo中没有显著活性（补充表S1），即使在最大耐受剂量下，在EGFR突变模型PC-9中也只有适度活性（图4E）。相比之下，AZD8931在6.25 mg/kg bid的剂量下抑制了PC-9肿瘤体积145%，远低于其最大耐受剂量（50 mg/kg bid；补充表S1；图4E）。拉帕替尼在EGFR和erbB2抑制剂敏感的异种移植物模型BT474c、Calu-3和FaDu中具有显著活性，这与erbB2选择性作用模式一致。这五种模型产生的所有抗肿瘤数据的总结见补充表S1。

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Sapitinib（AZD-8931）在人类肿瘤异种移植物模型中引起增殖和凋亡标志物的药效学变化[1]
在确定了这些化合物的抗肿瘤活性特征后，我们使用特定的EGFR或EGFR和erbB2驱动的模型评估了它们的体内作用机制。使用BT474c异种移植物模型作为高erbB2表达的例子，IHC的药效学分析显示，与对照组相比，AZD8931显著抑制了EGFR（P=0.04）、erbB2（P=0.024）和erbB3（P<0.001）磷酸化（图5A）。此外，通过IHC离体分析，AZD8931的下游信号生物标志物p-AKT显著降低（p=0.002），Ki67表达显著降低（p<0.001）（图5A）。与载体对照异种移植物相比，AZD8931也检测到p-ERK表达的减少，但这没有达到统计学意义

通过M30评估评估细胞凋亡。M30抗体识别细胞角蛋白（CK）18内的特定胱天蛋白酶切割位点，该位点在正常细胞的天然CK18中无法检测到，是早期凋亡事件的衡量标准。与载体对照异种移植物相比，AZD8931在四剂后1小时显著诱导了M30凋亡标志物（P=0.002），在第四剂后4小时恢复到接近对照水平（图5B）。

还使用不过表达erbB2的FaDu（图5C）和LoVo（图5D）异种移植物模型比较了AZD8931、吉非替尼和拉帕替尼的药效学活性。在FaDu异种移植物模型中，AZD8931、吉非替尼和拉帕替尼均显示出对EGFR和erbB2磷酸化的显著抑制作用（P<0.001；图5C）。AZD8931（P<0.0003）和吉非替尼（P=0.03）也能显著抑制erbB3磷酸化。相比之下，拉帕替尼在该模型中没有显著抑制erbB3的磷酸化。然后在LoVo模型中评估细胞凋亡，与对照组相比，AZD8931通过切割的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3水平显示出显著的细胞凋亡诱导作用（P<0.001；图5D）。此外，与吉非替尼（P=0.003）和拉帕替尼（P<0.001）相比，AZD8931还显示出明显更大的促凋亡作用。使用LoVo异种移植物模型评估AZD8931的药代动力学和药效学关系（图5E）。AZD8931的总血浆水平与观察到的EGFR磷酸化抑制之间存在直接关系。

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沙皮替尼（AZD-8931）抑制人类IBC模型的肿瘤生长[2]
先前的研究表明，在多种模型中，AZD8931抑制人肿瘤异种移植物生长，对靶向EGFR或HER2的药物具有不同的敏感性，包括一种表达ER/PgR、高水平HER2和中等水平EGFR的人乳腺癌症细胞系BT-474。在这里，我们确定了AZD8931单独或与紫杉醇联合对SCID小鼠体内人IBC细胞生长的影响。为了实现这一目标，肿瘤在SCID小鼠的乳腺脂肪垫中原位生长，并每周两次通过卡尺测量进行监测。SUM149和FC-IBC-02细胞系在不同治疗后的肿瘤体积变化如图4A和C所示。肿瘤生长曲线表示SUM149异种移植物33天和FC-IBC-32异种移植物26天的组平均值。AZD8931单独使用显著抑制了SUM149的异种移植物肿瘤生长（P=0.002；图4A）和FC-IBC-02（P<0.001；图4C）细胞与对照组的比较。AZD8931的剂量为25mg/kg，是根据之前的研究选择的。在两种异种移植物人IBC模型中，与对照组相比，单独使用紫杉醇也会延迟治疗后的肿瘤生长，但抑制效果远低于单独使用AZD8931组。在两种异种移植IBC模型中，紫杉醇+AZD8931的组合在延缓肿瘤生长方面比对照组和其他治疗组更有效。紫杉醇+AZD8931与单独紫杉醇在SUM149中的差异显著（P=0.01；图4A）和FC-IBC-02（P<0.01；图4C）。然而，与单独使用AZD8931相比，差异没有统计学意义。

此外，我们还在研究结束时检查了异种移植肿瘤的重量。不同治疗后肿瘤大小的抑制模式与两种IBC模型中的肿瘤生长曲线非常相似。紫杉醇+AZD8931的组合在减小肿瘤大小方面比所有其他治疗组更有效。紫杉醇+AZD8931与单独紫杉醇在SUM149中的差异也很显著（P = 0.008; 图4B）和FC-IBC-02（P=0.001；图4D）模型。与单独使用AZD8931相比，SUM149肿瘤（P=0.056）和FC-IBC-02肿瘤（P = 0.07).最后，我们通过免疫组织化学检测了SUM149异种移植物肿瘤中总EGFR、HER2、HER3、磷酸化EGFR、磷酸化HER2和磷酸化HER3的表达。正如预期的那样，在AZD8931治疗和对照肿瘤中均观察到EGFR的高水平表达和HER2和HER3的低水平表达。与对照肿瘤相比，AZD8931治疗的肿瘤中磷酸化EGFR、HER2和HER3的表达受到抑制（图5A）。病理学家对膜和细胞质染色的H评分平均值如图5B所示。总之，我们得出结论，AZD8931通过抑制EGFR、HER2和HER3磷酸化，显著抑制HER2非扩增IBC异种移植物模型中的肿瘤生长。紫杉醇+AZD8931的组合在延缓肿瘤生长方面比单一药物紫杉醇或单独使用AZD8931更有效。

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Sapitinib（AZD-8931）在各种异种移植物模型中显示出强烈的肿瘤生长抑制作用，这是由单独的EGFR（LoVo、PC9）或EGFR和HER2（BT474C、Calu3和FaDu）驱动的，同时伴随着药效学变化（例如磷酸化的EGFR、HER2和/或HER3）。8 在LoVo小鼠异种移植物模型中，化合物2/Sapitinib（AZD-8931）与1和7进行了正面比较：基于对EGFR的高效力、小鼠更好的暴露和更好的未结合血浆分数，它显示出更好的肿瘤生长抑制作用（每天一次口服100mg/kg剂量时抑制率为76%，而相同剂量下1和7的抑制率分别为36%和28%，图4）。

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HER3抑制在体内阻断了EC-CM诱导的CRC肿瘤[4]
为了验证EC-CM对CRC细胞体内生长的影响，我们使用了一种具有萤光素酶标记HCP-1细胞的subQ异种移植物肿瘤模型。HCP-1细胞用CRC或LPEC-1 CM预处理，然后在浓缩CM和Matrigel的接种混合物中注射subQ。因此，与注射CRC CM的对照组相比，注射LPEC-1 CM的HCP-1肿瘤随着时间的推移具有明显更大的肿瘤负荷和体积（补充图6A-C）。在肿瘤收获后，用LPEC-1 CMs治疗的HCP-1瘤明显比用HCP-1对照CM治疗的肿瘤更大、更重（补充图6D-F）。 阻断HER3对CRC肿瘤生长的影响通过经HER3抑制剂Sapitinib（AZD-8931）治疗的subQ异种移植物肿瘤模型进一步确定。在如上所述将HCP-1细胞注射到CM和Matrigel的混合物中的subQ后，然后通过强饲法用载体或AZD8931治疗小鼠，并随时间监测肿瘤生长（图6）。我们的研究结果表明，LPEC-1 CM治疗的肿瘤如预期的那样导致了明显更大的肿瘤生长。更重要的是，与未经AZD8931治疗的肿瘤相比，AZD8931显著抑制了CRC CM和LPEC-1 CM治疗的CRC肿瘤的生长（图6B）。此外，与未经AZD8931治疗的肿瘤相比，经AZD8931治疗的CRC肿瘤的肿瘤重量显著降低，与经CRC CM治疗的肿瘤相比较，肿瘤重量降低了约2倍，与经LPEC-1 CM治疗的癌症相比，肿瘤重量下降了4倍以上（图6C）。

激酶测定[1]
人EGFR和erbB2细胞内激酶结构域已被克隆并在杆状病毒/Sf21系统中表达。使用ELISA方法，用Km浓度的ATP（erbB2为0.4 mM，EGFR为2 mM）评估Sapitinib（AZD-8931）的抑制活性。[1]

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体外EGFR磷酸化研究[1]
KB细胞在含有10%FCS的RPMI 1640中生长72小时，血清饥饿（0%FCS）24小时，然后与Sapitinib（AZD-8931）、吉非替尼或拉帕替尼一起孵育90分钟，然后用15ng/mL重组EGF刺激5分钟，以将EGFR磷酸化增加到最大值的90%（ED90），从而进行批间比较。细胞在RIRA缓冲液[50 mmol/L tris（pH 7.4）、1%NP40、0.25%脱氧胆酸盐、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L原香草酸钠、1 mmol/L EDTA和罗氏蛋白酶抑制剂混合物]中裂解，并通过夹心ELISA测量EGFR磷酸化。

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体外药物敏感性试验——细胞活力测定[1]
为了确定它们对体外生长的细胞系的抗增殖活性，在一组NSCLC和SCCHN细胞系中测试了Sapitinib (AZD-8931)、吉非替尼和拉帕替尼。将细胞与适当浓度的药物一起孵育96小时，以确保准确估计产生50%生长抑制所需的抑制剂浓度（GI50；通常在0.001-10μmol/L之间）。通过用MTS比色测定试剂孵育4小时来确定活细胞数，并在分光光度计上在490nm处测量吸光度。每个实验针对每种药物浓度进行三次，数据以几何平均值表示。GI50数据的敏感性分组为<1μmol/L（归类为敏感）、1至7μmol/L（分类为中等）和>7μmol/L的（归类为耐药）。

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受体酪氨酸激酶（RTK）阵列[4]
使用RTK阵列试剂盒，并根据制造商的说明进行分析。简而言之，将0.5×106个HCP-1细胞在1%FBA培养基中孵育过夜，然后用对照或LPEC-1 CM处理30分钟。用试剂盒中的裂解缓冲液制备细胞裂解物，并将每组300μg总蛋白装载到膜上。通过ImageJ 1.47版测量同一胶片上P-EGFR、P-MET和P-HER3斑点的强度，并将其与参考斑点进行比较。

AZD8931 在一组 NSCLC 和 SCCHN 细胞系中进行测试，以确定其对体外生长的细胞系的抗增殖活性。将 AZD8931 (0.001-10 μM) 添加到细胞中并孵育 96 小时。将 MTS 比色测定试剂孵育 4 小时后，使用分光光度计测量 490 nm 处的吸光度，以确定活细胞计数。

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细胞增殖和凋亡测定[2]
将SUM149和FC-IBC-02细胞（2×103）接种在96孔板中，一式三份，培养过夜。细胞用指定浓度的Sapitinib（AZD-8931）处理72小时。在指定时间监测细胞增殖，根据制造商的说明，使用MTS测定法使用微孔板读数器测量490 nm处的吸光度。 通过Annexin V染色测量凋亡细胞。将细胞（1×105）用1μMSapitinib（AZD-8931）处理48和72小时。根据制造商的说明，收获细胞并用Annexin V-PE和7-氨基-放线菌素D（7-AAD）标记。然后在GuavaPC个人流式细胞仪上通过Guava系统分析样品。

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MTT法[4]
将CRC细胞以3000个细胞/孔的速度接种在96孔板中，在1%FBS中培养过夜，然后用CM处理指定时间。当使用HER3抑制剂Sapitinib (AZD-8931)（2μM）、HER3抗体MM-121（125μg/ml）或5-FU（2μg/ml）时，细胞在1%FBS培养基中用AZD8931或MM-121预处理过夜，然后在CM中与5-FU和AZD8931或者MM-121一起或一起培养72小时。通过在37°C下向细胞中加入生长培养基（1:5稀释）中的MTT底物（0.25%的PBS，Sigma）1小时来评估细胞存活率。用PBS洗涤细胞，加入50μl DMSO。在570nm处测量光密度，并将相对MTT表示为对照的%。

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细胞凋亡[4]
将CRC细胞在1%FBS中培养过夜，然后在有或没有5-FU的情况下与CM一起培养48小时（HCP-1细胞）或72小时（HT29和SW480）。当使用HER3抑制剂Sapitinib (AZD-8931)时，用AZD8931在1%FBS培养基中预处理细胞过夜，然后在CM中与5-FU和AZD8931一起或一起培养。如前所述，使用FITC-Annexin V凋亡检测试剂盒I测定细胞凋亡。简而言之，用FITC-Annexin V和碘化丙啶对单个悬浮细胞进行双重染色，并通过荧光激活细胞分选进行分析。双阳性细胞被计数为凋亡细胞，并以总群体的百分比表示。

本研究使用的小鼠为重症联合免疫缺陷小鼠和瑞士裸鼠（nu/nu基因型）。将Sapitinib (AZD-8931)、GW572016和ZD1839悬浮于1% (v/v)的聚氧乙烯山梨醇单油酸酯（Tween 80）去离子水中。每日一次（qd）或两次（bid）通过灌胃给予小鼠Sapitinib (AZD-8931)（6.25-50 mg/kg）、GW572016（100 mg/kg）、ZD1839（100-150 mg/kg）或溶剂对照。肿瘤生长情况决定每项研究的持续时间，当肿瘤体积小于1 cm³时，研究结束。测定肿瘤体积和肿瘤生长抑制率，并使用标准t检验对肿瘤体积的任何变化进行统计分析（P值小于0.05被认为具有统计学意义）。所有人类肿瘤异种移植模型均通过皮下注射0.1 mL肿瘤细胞悬液（4 × 10⁶至9 × 10⁷个细胞）与Matrigel按1:1比例混合建立，但LoVo模型未添加Matrigel，Calu-3模型使用30% Matrigel。BT474c细胞系是从人乳腺癌细胞系BT474亚克隆而来。对于BT474c模型，在植入肿瘤细胞前24小时，将雌二醇0.36 mg 60天缓释颗粒（Innovative Research）植入裸鼠体内。在所有模型中，均按照先前描述的方法，每周两次监测动物体重和肿瘤体积（使用双侧游标卡尺测量）。每个异种移植模型的组数（n = 8-17/组）通过功效分析确定，当肿瘤达到预定大小（>0.2 cm³）时进行随机分组。Sapitinib (AZD-8931)、拉帕替尼和吉非替尼悬浮于1% (v/v) 的聚氧乙烯山梨醇单油酸酯（Tween 80）去离子水溶液中。动物分别通过灌胃给予Sapitinib (AZD-8931)（6.25-50 mg/kg）、拉帕替尼（100 mg/kg）、吉非替尼（100-150 mg/kg）或溶剂对照，每日一次（qd）或两次（bid）。每项研究的持续时间根据肿瘤生长特征确定，当肿瘤达到约1 cm³时研究结束。肿瘤体积和肿瘤生长抑制率的计算方法如前所述，肿瘤体积变化的统计分析采用标准t检验（P值小于0.05被认为具有统计学意义）。

\n\n为了确定Sapitinib (AZD-8931)、拉帕替尼或吉非替尼治疗的药效学作用，将荷瘤小鼠分组（通常每组n=5），给药后处死小鼠，并取出血液和肿瘤组织。使用Polytron匀浆器，在6倍体积/重量的RIRA缓冲液（含1%磷酸酶抑制剂1和2以及蛋白酶抑制剂）中裂解冷冻的肿瘤样本。使用与去污剂兼容的蛋白质测定试剂盒评估所有肿瘤裂解液的蛋白质含量。使用多重 MesoScale Discovery 试剂盒或如上所述的 ELISA 方法分析肿瘤样本中的磷酸化 EGFR、磷酸化 erbB2 和磷酸化 erbB3 水平。此外，还通过免疫组织化学 (IHC) 检测了药效学效应。对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切片进行抗原修复。

\n\n对于药代动力学研究，处理血浆样本，并通过高效液相色谱串联质谱法测定 Sapitinib (AZD-8931) 浓度。有关异种移植模型、治疗和 IHC 方案、药效学采样、图像分析详情和统计方法的完整概述，请参见补充材料和方法。 [1]

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\n\n将 UM149 和 FC-IBC-02 (3 × 10⁶) 细胞悬浮于 200 μL 1:1 比例的磷酸盐缓冲液/基质胶混合液中，并原位注射到 6 周龄雌性 CB-17 重症联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠的乳腺脂肪垫中。肿瘤体积根据公式 TV = L*W*H*0.5236 计算，其中 L、W 和 H 为使用游标卡尺测量的肿瘤三个垂直方向的尺寸。当 SUM149 细胞的肿瘤体积约为 50 mm³ 或 FC-IBC-02 细胞的肿瘤体积约为 80 mm³ 时，将小鼠随机分为四组（每组 5 只），并开始治疗。将Sapitinib (AZD-8931)悬浮于1% (v/v)聚氧乙烯山梨醇单油酸酯(Tween 80)去离子水溶液中，每日一次灌胃给药，剂量为25 mg/kg，持续4周。紫杉醇溶液用生理盐水稀释，每周两次皮下注射，剂量为10 mg/kg。对照组接受1% Tween 80溶剂处理。分别于治疗后33天（SUM149）或26天（FC-IBC-02）处死小鼠。手术切除肿瘤并称重。[2]

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\n\n荷瘤小鼠接受Sapitinib (AZD-8931)治疗，剂量为50 mg/kg/天，持续4天。第四次给药后4小时切除肿瘤并固定。将福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织切片贴于载玻片上，并按先前所述方法进行免疫组织化学（IHC）染色。简而言之，对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切片进行抗原修复。使用聚合物检测系统（DAKO Envision + K4007）进行二抗检测，切片用Carazzi苏木素复染。由病理学家（CW）通过光镜对免疫组织化学棕色染色进行半定量评分，评分采用四级评分标准（0+，无；1+，弱；2+，中等；3+，强），并计算染色百分比（%）分布，以得出H评分（1+%、2+%和3+%之和）。记录细胞质和细胞膜染色情况。 [2]

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\n\n用CMV驱动的荧光素酶报告基因标记的HCP-1细胞用条件培养基（CM）预处理24小时，然后悬浮于接种基质（生长因子减少的Matrigel与浓缩的HCP-1或LPEC-1 CM以1:1的比例混合）中，并皮下注射到无胸腺/裸鼠的右侧腹部（每次注射1×10⁶个细胞，100 μl，每组10只小鼠）。注射后，使用活体成像系统（IVIS）和D-荧光素底物，按照制造商的说明，通过生物发光法评估肿瘤负荷。使用游标卡尺测量肿瘤体积。由于飓风哈维的影响，我们只能在注射后第4天和第15天使用IVIS测量生物发光，并在注射后第4天、第11天和第15天使用游标卡尺测量肿瘤体积。将Sapitinib (AZD-8931)悬浮于1% (v/v)聚氧乙烯山梨醇单油酸酯（Tween 80）去离子水溶液中，从第1天开始，每天灌胃一次，剂量为25mg/kg/只小鼠，每次100μl。对照组仅灌胃1% Tween 80溶液。当任何一组中有3只小鼠的肿瘤体积达到1000mm³时，处死所有小鼠，并取出肿瘤进行称重。[4]

Sapitinib (AZD-8931)未表现出CYP P450抑制作用（对1A2、2C9、2C19、2D6和3A4的IC50 > 10 μM）。它在大鼠和人血浆中均显示出较高的游离分数（高于1或7）。与4-氟-3-氯苯胺7相比，2-氟-3-氯苯胺2/Sapitinib (AZD-8931)的游离分数更高，这可能与该苯胺的亲脂性降低有关（表4），并且在更广泛的匹配对中也观察到了这种模式。此外，化合物 2/Sapitinib (AZD-8931) 的水溶性表现出 pH 依赖性，这归因于其两个可电离位点（哌啶 pKa 6.7，喹唑啉 pKa 5.0；pH 6.8（磷酸盐缓冲液）下的水溶性：17 μM），并且在 CaCo-2 细胞中测得其具有良好的渗透性（10 μM 时 Papp,A 至 B 为 15.9 × 10–6 cm·s–1）。化合物 2 在大鼠和犬中显示出良好的口服药代动力学（清除率低，生物利用度高，见表 5），并且在人肝细胞中周转率低（Clint < 4.5 μL/min/106 个细胞）。在裸鼠中，口服 50 mg/kg 后，化合物 2 的暴露量（AUC：66 μM·h）高于化合物 7 和 1（二者的 AUC 均为 19 μM·h）。[3]

[1]. AZD8931, an equipotent, reversible inhibitor of signaling by epidermal growth factor receptor, ERBB2 (HER2), and ERBB3: a unique agent for simultaneous ERBB receptor blockade in cancer. Clin Cancer Res. 2010 Feb 15;16(4):1159-69.

[2]. AZD8931, an equipotent, reversible inhibitor of signaling by epidermal growth factor receptor (EGFR), HER2, and HER3: preclinical activity in HER2 non-amplified inflammatory breast cancer models. J Exp Clin Cancer Res. 2014 May 30;33:47.

[3]. Discovery of AZD8931, an Equipotent, Reversible Inhibitor of Signaling by EGFR, HER2, and HER3 Receptors. ACS Med Chem Lett. 2013 May 31;4(8):742-6.

[4]. Endothelial Cells Promote Colorectal Cancer Cell Survival by Activating the HER3-AKT Pathway in a Paracrine Fashion. Mol Cancer Res. 2019 Jan;17(1):20-29.

沙匹替尼属于喹唑啉类化合物，其化学名称为4-氨基-7-甲氧基喹唑啉，其中氨基被3-氯-2-氟苯基取代，喹啉环的6位被{1-[2-(甲氨基)-2-氧代乙基]哌啶-4-基}氧基取代。沙匹替尼是一种双重酪氨酸激酶抑制剂（TKI），可抑制表皮生长因子受体（EGFR）HER2和HER3。它既是表皮生长因子受体拮抗剂，也是EC 2.7.10.1（受体蛋白酪氨酸激酶）抑制剂。它属于喹唑啉类、哌啶类、单氟苯类、单氯苯类、芳香醚类、仲胺类和叔胺类化合物。
Sapitinib 已用于肿瘤、乳腺癌、乳腺肿瘤、转移性癌症和转移性乳腺癌等疾病的治疗和基础科学研究的临床试验中。
Sapitinib 是一种 erbB 受体酪氨酸激酶抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。erbB 激酶抑制剂 AZD8931 可与 erbB 酪氨酸受体激酶结合并抑制其活性，从而抑制表达 erbB 的肿瘤细胞增殖和血管生成。 erbB蛋白家族，也称为表皮生长因子受体（EGFR）家族，在肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成中发挥重要作用。

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目的：验证以下假设：使用新型小分子抑制剂AZD8931同时等效抑制表皮生长因子受体（EGFR；erbB1）、erbB2（人表皮生长因子受体2）和erbB3受体信号传导，可在体外和体内产生广泛的抗肿瘤活性。实验设计：采用一系列检测方法来模拟erbB家族受体在同源二聚体和异源二聚体中的信号传导，包括体外评估erbB激酶活性、erbB受体磷酸化、细胞增殖，以及在人肿瘤异种移植模型中进行体内测试，并进行离体评估erbB磷酸化和下游生物标志物。本研究使用吉非替尼和拉帕替尼来比较AZD8931与其他erbB家族抑制剂的药理学特性。结果：体外实验表明，AZD8931对细胞内EGFR（IC50为4 nmol/L）、erbB2（IC50为3 nmol/L）和erbB3（IC50为4 nmol/L）的磷酸化具有等效的可逆抑制作用。在增殖实验中，AZD8931在特定的头颈部鳞状细胞癌和非小细胞肺癌细胞系中表现出显著优于吉非替尼或拉帕替尼的活性。在体内，AZD8931 在多种模型中抑制了异种移植瘤的生长，同时显著影响 EGFR、erbB2 和 erbB3 的磷酸化及其下游信号通路、细胞凋亡和增殖。结论：AZD8931 具有独特的药理学特征，能够等效地抑制 EGFR、erbB2 和 erbB3 信号通路，并且在特定的临床前模型中显示出比 erbB 受体抑制谱更窄的药物更强的抗肿瘤活性。AZD8931 为研究同时抑制 erbB 受体信号通路是否具有临床应用价值提供了契机，尤其是在大多数不过表达 erbB2 的实体瘤中。[1]

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引言：表皮生长因子受体 (EGFR) 过表达与炎性乳腺癌 (IBC) 的预后和预测价值相关。与非炎症性乳腺癌相比，炎性乳腺癌 (IBC) 中表皮生长因子受体 2 (HER2) 的过表达率更高。目前临床可用的抗 HER2 疗法仅对 HER2 扩增的乳腺癌患者有效，包括 IBC。AZD8931 是一种新型小分子等效抑制剂，可抑制 EGFR、HER2 和 HER3 信号通路。本研究利用 EGFR 过表达和 HER2 非扩增的 IBC 细胞的临床前模型，探讨了 AZD8931 单独使用或与紫杉醇联合使用时的抗肿瘤活性。方法：本研究使用了两种 IBC 细胞系 SUM149 和 FC-IBC-02，这两种细胞系均来源于 IBC 患者的胸腔积液。在体外检测了细胞生长和凋亡情况。在体内肿瘤生长研究中，将 IBC 细胞原位移植到免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪垫中。 AZD8931 以 25 mg/kg 的剂量每日灌胃给药，每周 5 天，持续 4 周。紫杉醇每周皮下注射两次。结果：AZD8931 显著抑制了 IBC 细胞的生长，并在体外诱导了人 IBC 细胞的凋亡。值得注意的是，我们发现 AZD8931 单药治疗抑制了异种移植瘤的生长，并且在原位 IBC 模型中，紫杉醇联合 AZD8931 治疗在延缓肿瘤生长方面明显优于紫杉醇或 AZD8931 单药治疗。结论：AZD8931 单药治疗以及与紫杉醇联合治疗在 EGFR 过表达和 HER2 非扩增的 IBC 模型中均显示出信号抑制和抗肿瘤活性。这些结果表明，AZD8931 可能为治疗 HER2 非扩增型 IBC 患者提供一种新的治疗策略。[2]

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HER 家族信号通路失调可促进肿瘤细胞增殖和存活，这在多种人类癌症中均有报道。在选择性 EGFR 或 HER2 治疗药物无效或活性较弱的癌症治疗中，同时且等效地抑制 EGFR、HER2 和 HER3 介导的信号通路可能具有临床应用价值。我们描述了 AZD8931 (2) 的发现，AZD8931 是一种等效的、可逆的 EGFR、HER2 和 HER3 介导的信号通路抑制剂，并阐述了该系列化合物的构效关系。基于 HER2 激酶结构域模型的分子对接研究有助于解释 AZD8931 中甲基乙酰胺侧链增强 HER2 活性的原因。 AZD8931在临床前动物模型中表现出良好的药代动力学特性，并且在LoVo肿瘤生长疗效模型中显示出优于其类似物的活性。AZD8931目前正在进行人体临床试验，用于治疗癌症。[3]

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结直肠癌细胞存活通路的调控机制仍有待阐明。此前研究表明，肝脏内皮细胞（肝实质内皮细胞或LPEC）——结直肠癌最常见的转移部位——会在条件培养基（CM）中分泌可溶性因子，这些因子反过来会增强结直肠癌细胞的癌干细胞表型。然而，LPEC对其他结直肠癌细胞功能的旁分泌效应尚未得到研究。本研究结果表明，LPEC的条件培养基可通过激活体外培养的结直肠癌细胞中的AKT通路，促进细胞生长并增强化疗耐药性。利用无偏倚受体酪氨酸激酶芯片，我们发现肝内皮细胞条件培养基（LPEC）可激活人表皮生长因子受体3（ERBB3/HER3），并介导结直肠癌细胞中AKT的激活、细胞增殖和化疗耐药。使用抑制剂AZD8931或抗体MM-121抑制HER3可阻断LPEC诱导的HER3-AKT激活和结直肠癌细胞的存活。此外，LPEC条件培养基在异种移植小鼠模型中促进了体内肿瘤的生长。进一步研究发现，使用AZD8931抑制HER3可显著抑制肝内皮细胞条件培养基诱导的肿瘤生长。这些结果表明，肝内皮细胞通过激活HER3-AKT通路，在结直肠癌细胞中发挥旁分泌作用，促进细胞增殖和化疗耐药。意义：本研究表明，HER3 抗体/抑制剂有可能用于治疗转移性结直肠癌患者，目前这些抗体/抑制剂正在针对各种癌症类型进行临床试验评估。[4]

C31H33CLFN5O11

706.07

705.184912

C, 52.73; H, 4.71; Cl, 5.02; F, 2.69; N, 9.92; O, 24.92

1196531-39-1

848942-61-0; 1196531-39-1 (fumurate)

44470103

Typically exists as solids at room temperature

6

16

11

49

760

0

ClC1=CC=CC(=C1F)NC1=C2C(C=C(C(=C2)OC2CCN(CC(NC)=O)CC2)OC)=NC=N1.OC(/C=C/C(=O)O)=O.OC(/C=C/C(=O)O)=O

AZD-8931 fumarate; Sapitinib difumurate; 1196531-39-1; AZD8931 diFuMaric acid; AZD8931 difumaricacid; diFuMaric acid; AZD-8931 difumaricacid; RD1QAE9R4N; UNII-RD1QAE9R4N;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。