T-0156 free base

PDE5/phosphodiesterase type 5 (IC50 = 0.23 nM)

10 和 100 nM 的 T-0156 可提高 cGMP 水平，导致兔海绵体组织松弛[1]。

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T-0156对多种磷酸二酯酶同工酶的抑制作用[1]
T-0156对磷酸二酯酶5型的cGMP水解活性表现出强烈的抑制作用（图2A），IC50为0.23 nM（表1）。T-0156还抑制了磷酸二酯酶6型，IC50值为56nM，比抑制磷酸二酯酶5型高240倍。T-0156对磷酸二酯酶4型的cAMP水解活性抑制较弱，IC50值为63μM。T-0156对磷酸二酯酶1型和2型的cGMP水解活性以及磷酸二酯酶3型的cAMP水解活性表现出弱抑制作用（IC50>100μM）。

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T-0156对磷酸二酯酶5型作用的动力学分析[1]
为了阐明T-0156抑制作用的机制，在0.51至6.01μM cGMP底物的浓度下构建了Lineweaver–Burk图（图2B）。从犬肺部分纯化的5型磷酸二酯酶的cGMP Km值为6.2μM，T-0156以竞争方式抑制5型磷酸二酯酶的活性。T-0156对磷酸二酯酶5型的抑制常数（Ki值），通过药物浓度与斜率重置计算，为0.22±0.08 nM。

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T-0156对放射性配体结合和酶活性的影响[1]
T-0156在10μM的高浓度下抑制了[3H]CGP-39653与谷氨酸NMDA受体的结合和钙蛋白酶（一种Ca2+激活的中性蛋白酶）的活性（抑制率分别为32%和24%）。如表2所示，10或100μM的T-0156既不抑制几种放射性配体的结合，也不抑制几种酶的活性。

T-0156对苯肾上腺素预收缩兔海绵体等长张力和环核苷酸水平的影响[1]
10或100 nM的T-0156导致cGMP水平升高。海绵体的等长张力随着cGMP的升高而降低（图3）。T-0156在100 nM浓度下的cGMP水平增加约为载体的五倍（T-0156处理：6.0±1.5 pmol/mg蛋白质，载体处理：1.1±0.4 pmol/mg蛋白质，P<0.05）。相比之下，T-0156没有改变cAMP水平（100 nM T-0156处理：25.0±8.7 pmol/mg蛋白质，赋形剂处理：13.3±3.7 pmol/mg蛋白质，P=0.48）。

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T-0156增强电场刺激诱导的兔海绵体松弛作用[1]
图4显示了T-0156对电场刺激诱导的兔海绵体松弛的影响的典型轨迹。1至100 nM的T-0156产生了电场刺激诱导的弛豫的浓度依赖性增强（图5）。T-0156在100 nM浓度下的增强作用具有统计学意义（T-0156处理：76.9±19.8%，赋形剂处理：12.3±10.1%，P<0.05）。

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T-0156在麻醉犬中增强盆腔神经刺激诱导的肿胀[1]
十二指肠内注射100至1000μg/kg的T-0156以剂量依赖的方式增强了盆神经刺激诱导的肿胀，300和1000μg/kg时的增强具有统计学意义（图6）。在十二指肠内给药后10至30分钟观察到T-0156的最大增强作用，增强作用持续至少90分钟。

受体结合和酶测定[1]
MDS Pharma Services评估了T-0156（10或100μM）对放射性配体结合和除磷酸二酯酶外的酶活性的影响。

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磷酸二酯酶测定[1]
磷酸二酯酶测定是通过放射性标记的核苷酸法进行的（Thompson等人，1979）。检测缓冲液含有50 mM Tris-HCl，pH 8.0，5 mM MgCl2，4 mM 2-巯基乙醇，0.33 mg/ml牛血清白蛋白，0.1至30μl酶溶液，未标记的cGMP或cAMP，以及12.5 nM[3H]cGMP或4.88 nM[3H]cAMP。通过将底物混合到500μl的测定缓冲液中开始反应，并将试管在37°C下孵育30分钟。煮沸1.5分钟后，将混合物加入100μl的1 mg/ml克罗塔罗蛇毒溶液中，并在37°℃下孵育三十分钟。通过加入500μl甲醇停止反应，将所得溶液加入Dowex（1×8-400）柱（体积0.25 ml）。向每种洗脱液中加入闪烁液，并测量放射性。为了研究磷酸二酯酶活性的抑制作用，将抑制剂加入到含有酶的测定缓冲液中，并在加入底物引发反应之前预孵育5分钟。

兔阴茎海绵体舒张及环核苷酸水平[1]
\n将兔阴茎海绵体置于器官浴槽中，用去氧肾上腺素（5 μM）诱导收缩。然后向制备物中加入T-0156（10 或 100 nM）。待T-0156达到最大舒张反应后，立即用液氮冷冻制备物。将冷冻的制备物在1 ml含EDTA（1 mM）的6%三氯乙酸溶液中匀浆。离心（5000 rpm，15 min，4 °C）后，用饱和水的乙醚萃取上清液，取水相冻干至干，然后用1 ml 50 mM乙酸钠缓冲液（pH 6.2）复溶。将沉淀物溶解于 0.5 ml 2 N NaOH 溶液中，用于测定蛋白质含量。分别使用市售的 cGMP 和 cAMP 免疫测定试剂盒以及 BCA 蛋白测定试剂盒测定各溶液中的环核苷酸和蛋白质含量。T-0156 诱导的标本舒张程度以苯肾上腺素诱导收缩幅度的百分比表示。环核苷酸水平以 pmol/mg 蛋白表示。\n

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\n\n电场刺激诱导舒张 [1]
\n根据 Takagi 等 (2001) 的方法，对兔阴茎海绵体标本进行电场刺激诱导舒张。在加入苯肾上腺素 (5 μM) 诱导标本收缩之前，向每个器官浴槽中加入阿托品和胍乙啶（分别为 1 μM 和 5 μM）。待去氧肾上腺素收缩反应稳定后，每隔10分钟对组织进行电场刺激（20 V，脉冲宽度0.2 ms，持续40 s），以诱导组织松弛。通过改变刺激频率（1至16 Hz）来选择合适的刺激条件，以使去氧肾上腺素预收缩的组织达到约10%的松弛。电场刺激使用铂电极，电极设置在组织条两侧，并由电刺激器和功率放大器（PB 401；Physio-Tech；东京，日本）进行。待每隔10分钟的电场刺激诱导的松弛稳定后，每隔30分钟向组织中加入T-0156（1至100 nM）或溶剂。实验结束时，向每个器官浴槽中加入罂粟碱（100 μM），以确认组织达到最大松弛程度。增强作用以T-0156或载体处理前松弛反应幅度的百分比表示。\n

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\n\n麻醉犬盆神经刺激诱导勃起[1]
\n麻醉犬盆神经刺激诱导勃起实验按照Noto等人(2000)的方法进行。体重11.4至18.7 kg的犬用戊巴比妥钠麻醉（30 mg/kg静脉推注，随后4.5 mg/kg/h静脉输注）。置入气管插管，用空气通气（15 ml/kg/次，20次/分钟）。通过腹部正中切口打开腹腔。将聚乙烯导管插入十二指肠，并用结扎线固定。左侧盆神经位于前列腺上方和外侧，被仔细分离并置于双极电极上。一根21号静脉针置入左侧阴茎海绵体，用于记录海绵体内压。盆神经受到电刺激，刺激参数为方波脉冲（10 V，脉冲宽度0.2 ms，持续40 s），频率范围为2.5至20 Hz，刺激间隔为20分钟。所有实验均在亚最大刺激诱发稳定反应后开始。T-0156或溶剂（100、300或1000 mg/kg）经十二指肠内给药，并在T-0156给药后10、30、50、70和90分钟评估T-0156对盆神经刺激诱导的阴茎勃起的影响。为了定量测定勃起程度，我们测量了曲线下面积，并以毫米汞柱乘以分钟表示。增强作用以T-0156或载体处理前盆神经刺激诱导的勃起程度的百分比表示。\n\n

[1]. Enzymological and pharmacological profile of T-0156, a potent and selective phosphodiesterase type 5 inhibitor. Eur J Pharmacol. 2002 Dec 5;456(1-3):91-8.

本研究在体外和体内考察了一种新型磷酸二酯酶5型抑制剂——2-(2-甲基吡啶-4-基)甲基-4-(3,4,5-三甲氧基苯基)-8-(嘧啶-2-基)甲氧基-1,2-二氢-1-氧代-2,7-萘啶-3-羧酸甲酯盐酸盐（T-0156）的酶学和药理学特性。研究了T-0156对从犬组织中分离的六种磷酸二酯酶同工酶的抑制作用。结果表明，T-0156以竞争性方式，在低浓度（IC50=0.23 nM）下特异性抑制磷酸二酯酶5型对环磷酸鸟苷（cGMP）的水解。 T-0156 对 6 型磷酸二酯酶的抑制作用也很强，IC50 值为 56 nM，比对 5 型磷酸二酯酶的抑制作用高 240 倍。T-0156 对 1、2、3 和 4 型磷酸二酯酶的抑制活性较低（IC50>10 μM）。在离体兔阴茎海绵体中，10 nM 和 100 nM 的 T-0156 可提高 cGMP 水平（100 nM T-0156 处理组：6.0±1.5 pmol/mg 蛋白，溶剂对照组：1.1±0.4 pmol/mg 蛋白，P<0.05），从而导致组织松弛。浓度为 1 至 100 nM 的 T-0156 可浓度依赖性地增强离体兔阴茎海绵体电场刺激诱导的舒张作用（100 nM T-0156 处理组：76.9±19.8%，溶剂对照组：12.3±10.1%，P<0.05）。十二指肠内给予 100 至 1000 μg/kg 的 T-0156 可增强麻醉犬盆神经刺激诱导的阴茎勃起（1000 μg/kg T-0156 处理组：279.0±38.4%，溶剂对照组：9.8±4.5%，P<0.05）。这些结果表明，T-0156 可能通过阻断 5 型磷酸二酯酶，在体外和体内实验条件下增强一氧化氮 (NO)/cGMP 通路。本研究清楚地表明，T-0156 是一种高效且高选择性的 5 型磷酸二酯酶抑制剂，是体外和体内药理学研究的有效工具。[1]

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T-0156 是我们实验室近期发现的一种新型 5 型磷酸二酯酶抑制剂（Kikkawa 等，2001）。本研究旨在探讨 T-0156 在体外和体内的酶学和药理学特性。
在利用从犬组织中获得的六种磷酸二酯酶同工酶进行的酶活性测定中，T-0156 仅对 5 型磷酸二酯酶表现出强效抑制作用，IC50 值为 0.23 nM。 T-0156 对 5 型磷酸二酯酶的抑制效力比对 6 型磷酸二酯酶的抑制效力高 240 倍，比对 4 型磷酸二酯酶的抑制效力高 290,000 倍。T-0156 对 1、2 和 3 型磷酸二酯酶的抑制效力较低（IC50>100 μM）。T-0156 对 5 型磷酸二酯酶的抑制效力和选择性均高于西地那非（一种治疗勃起功能障碍的药物）（Goldstein 等，1998）。因此，T-0156 是一种高效且高选择性的 5 型磷酸二酯酶抑制剂。
T-0156 的结构与 cGMP 的结构截然不同，而其他 5 型磷酸二酯酶抑制剂（如扎普司特和西地那非）的结构则与 cGMP 相关。然而，动力学分析表明，T-0156 是一种竞争性抑制剂，这与扎普司特（Turko 等，1998）和西地那非（Ballard 等，1998）的情况类似。据报道，位于 5 型磷酸二酯酶催化结构域的残基，例如 Tyr602、His607、His643 和 Asp754，可能与西地那非形成重要的相互作用（Turko 等，1999）。阐明T-0156的5型磷酸二酯酶结合位点将具有重要意义。
5型磷酸二酯酶是阴茎海绵体中主要的cGMP水解酶（Boolell等，1996），抑制该酶可导致该组织中cGMP水平升高（Jeremy等，1997）。在本研究中，T-0156可提高兔阴茎海绵体中cGMP水平，但不影响cAMP水平，表明T-0156具有特异性5型磷酸二酯酶抑制剂的药理学特性。T-0156还能使该组织松弛。据报道，一氧化氮（NO）由含有NO合酶（NOS）的神经元或小动脉和血窦内皮细胞释放，可通过激活鸟苷酸环化酶导致细胞内cGMP水平升高，进而引起阴茎海绵体平滑肌舒张（Trigo-Rocha等，1993a）。在本研究中，T-0156导致cGMP积累，并使不含NO的NOS神经来源的制备物发生舒张，表明T-0156的作用依赖于预先存在的NO激活鸟苷酸环化酶，而该NO可能来源于阴茎海绵体内皮细胞。
我们还检测了T-0156对离体兔阴茎海绵体电场刺激诱导舒张的影响，这是一种评估NO/cGMP通路影响的替代生物测定方法。在我们之前的研究中，用河豚毒素或一氧化氮合酶（NOS）抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）预处理可减弱电场刺激诱导的舒张作用，而过量的L-精氨酸可恢复L-NAME抑制的舒张作用，这表明电场刺激诱导的舒张作用与含NOS神经产生的NO有关（Takagi等，2001）。T-0156以浓度依赖的方式增强了电场刺激诱导的舒张作用。该结果表明，T-0156在体外可有效抑制5型磷酸二酯酶，并通过增强NO/cGMP通路发挥其药理作用。此外，还观察到，尽管浓度为 10 nM 的 T-0156 能 100% 抑制 5 型磷酸二酯酶的活性，但其对离体兔阴茎海绵体中 NO/cGMP 通路的增强作用并未达到饱和。对此的一种可能解释是，T-0156 的细胞膜通透性可能较低，因此需要更高浓度的 T-0156 才能抑制离体组织中的 5 型磷酸二酯酶。需要进一步研究来阐明这些现象的确切机制。
直接电刺激盆神经可诱导犬阴茎勃起，该过程由 NO/cGMP 通路介导（Trigo-Rocha 等，1993b）。这种盆神经刺激诱导的勃起已被用作 5 型磷酸二酯酶抑制剂药理学评价的模型。据报道，在该模型中，十二指肠内给予西地那非可剂量依赖性地增强肠道肿胀，表明西地那非是一种口服有效的5型磷酸二酯酶抑制剂（Noto等，2000）。当十二指肠内给予T-0156时，也观察到了剂量依赖性的肠道肿胀增强。该结果表明，T-0156是犬类口服有效的5型磷酸二酯酶抑制剂。尽管T-0156作为PDE5抑制剂的效力是西地那非的16倍，但其在300 μg/kg剂量下的疗效与西地那非几乎相同（Noto等，2000）。口服或十二指肠给药的药物疗效通常受其生物利用度、血清蛋白结合率、细胞膜通透性等因素调控。T-0156 与西地那非在体内疗效相当，可能是由于 T-0156 的生物利用度较低（约 9%；我们的初步数据）。由于T-0156达到最大勃起增强作用所需的时间（10至30分钟）比西地那非（30分钟）短，因此T-0156的吸收速度可能比西地那非更快（Noto等人，2000）。
如表2所示，10 μM的T-0156对放射性配体与几种受体的结合没有显著影响，也没有影响几种酶的活性，表明其对5型磷酸二酯酶的抑制选择性超过40000倍。结果支持T-0156作为选择性磷酸二酯酶5型抑制剂的实用性。
总之，T-0156被认为是一种在酶学和药理学研究中作为强效选择性磷酸二酯酶5型抑制剂的有用工具。[1]

C31H29N5O7

583.59

324572-92-1

Typically exists as solids at room temperature

779.1ºC at 760 mmHg

425ºC

4.799

136.78

CC1=NC=CC(=C1)CN2C(=C(C3=C(C2=O)C(=NC=C3)OCC4=NC=CC=N4)C5=CC(=C(C(=C5)OC)OC)OC)C(=O)OC

methyl 2-[(2-methylpyridin-4-yl)methyl]-1-oxo-8-(pyrimidin-2-ylmethoxy)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,7-naphthyridine-3-carboxylate

t-0156; T0156; methyl 2-[(2-methylpyridin-4-yl)methyl]-1-oxo-8-(pyrimidin-2-ylmethoxy)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1,2-dihydro-2,7-naphthyridine-3-carboxylate; Methyl 2-((2-methylpyridin-4-yl)methyl)-1-oxo-8-(pyrimidin-2-ylmethoxy)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1,2-dihydro-2,7-naphthyridine-3-carboxylate; 324572-92-1; 1,2-Dihydro-2-[(2-methyl-4-pyridinyl)methyl]-1-oxo-8-(2-pyrimidinylmethoxy)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,7-naphthyridine-3-carboxylic acid methyl ester hydrochloride; methyl 2-[(2-methylpyridin-4-yl)methyl]-1-oxo-8-(pyrimidin-2-ylmethoxy)-4-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-2,7-naphthyridine-3-carboxylate; CHEMBL540294;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。