Rat Brain PKC (IC50 = 158 nM); PKC-α (IC50 = 53 nM); PKC-βI (IC50 = 195 nM); PKC-βII (IC50 = 163 nM); PKC-γ (IC50 = 213 nM); PKC-ε (IC50 = 175 nM)

双吲哚基马来酰亚胺VIII（Bis VIII）先前已被证明通过蛋白激酶C非依赖性机制增强Fas介导的凋亡。在本研究中，我们使用激动性抗人DR5单克隆抗体TRA-8检测了Bis VIII对DR5（TRAIL-R2）诱导的细胞凋亡的影响。我们的结果表明，Bis VIII能够在体外和体内增强TRA-8的凋亡诱导活性。TRA-8和Bis VIII的组合导致c-Jun N-末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶的协同和持续激活，这是由MAPK激酶4介导的，并且是胱天蛋白酶-8依赖性的。线粒体途径参与Bis VIII和TRA-8协同诱导细胞凋亡。Bis VIII单独诱导线粒体膜电位以半胱天冬酶非依赖性的方式丧失，随后不释放细胞色素c。然而，在Bis VIII存在的情况下，TRA-8诱导线粒体膜电势的更深刻丧失和细胞色素c的释放。这些结果表明，JNK/p38的增强和持续激活以及线粒体膜电位的降低在BisⅧ协同诱导死亡受体介导的凋亡中起着至关重要的作用。Bis VIII增强DR5介导的细胞凋亡信号转导的独特能力揭示了该化合物与抗DR5抗体组合在癌症治疗中的潜在用途。[2]

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以时间依赖性和 TRA-8 剂量依赖性方式，双吲哚基马来酰亚胺 VIII 醋酸盐（Ro 31-7549 醋酸盐；5 μM；8、12 小时）显着加速 TRA-8 诱导的细胞死亡[2]。同时使用 TRA-8 处理后，procaspase-8 在 4 小时内大幅减少，并在使用双吲哚基马来酰亚胺 VIII 醋酸盐（5 μM；6 小时）后 6 小时完全消失 [2]。

当双吲哚基马来酰亚胺 VIII 醋酸盐（Ro 31-7549 醋酸盐；100 μg；腹膜内注射；每隔一天三剂）与 TRA-8 联合使用时，肿瘤几乎完全消退。单独使用双吲哚基马来酰亚胺 VIII 醋酸盐治疗并不能实现显着的肿瘤消退[2]。
由于TRA-8在体内1321N1细胞中具有杀瘤活性，我们进一步研究了双吲哚基马来酰亚胺VIII/Bis VIII与TRA-8联合给药对肿瘤生长的体内影响。与对照组治疗的小鼠相比，单独使用Bis VIII治疗没有诱导显著的肿瘤消退（图1D）。尽管TRA-8单独显著抑制了肿瘤生长，但从未实现肿瘤的完全消退。然而，TRA-8和Bis VIII联合治疗导致肿瘤几乎完全消退。这些结果表明，与对Fas诱导的细胞死亡的影响相似，Bis VIII在体外和体内对DR5介导的细胞死亡具有协同作用[2]。

PKC活性测定[1]
测定混合物含有0.2 mg/ml肽基、10、M MgCl2、0.6 mM CaCl2、10升M[y-32P]ATP、1.25 mg/ml磷脂酰丝氨酸和1.25 ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯，溶于20 mM Hepes（pH 7.5）、2 mM EDTA、1 mM二硫苏糖醇和0.02%（w/v）Triton X-100中。肽-y是一种合成肽，GPRPLFCRKGSLRQKW，类似于PKC-y假底物位点，除了丝氨酸残基取代假底物丙氨酸，将肽从抑制剂转化为底物。通过添加2.5 m单位的酶开始测定，在30°C下孵育10分钟，最后点在P81纸上，然后在75 mM正磷酸中广泛洗涤。然后将纸张在乙醇中洗涤，干燥，并通过液体闪烁光谱法测定掺入的放射性[1]。

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蛋白激酶C（PKC）家族的同工酶被认为在许多不同的细胞类型中介导广泛的信号转导途径。一系列双吲哚酰亚胺已被评估为传统PKC家族成员（PKCsα，-β，-γ）的抑制剂和新的、Ca（2+）非依赖性的PKC家族的代表性PKCε的抑制剂。与吲哚卡巴唑星形孢菌素相比，所研究的所有双吲哚酰亚胺对PKCα的选择性都略高于所研究的其他同工酶。此外，具有构象受限侧链的双吲哚酰亚胺作为PKCε的抑制剂活性较低。其中最引人注目的是Ro 32-0432，其对PKCα的选择性是PKCε的10倍，对PKCβI的选择性是4倍。[1]

细胞凋亡分析 [2]
细胞类型： 1321N1 细胞
测试浓度： 5 μM
孵育时间： 8， 12小时
实验结果：TRA-8诱导的细胞死亡以时间依赖性和TRA-8剂量依赖性方式显着增加。

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蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： 1321N1 细胞
测试浓度： 5 μM
孵育时间：6小时
实验结果：procaspase-8在4小时时急剧减少，并在6小时时完全消失。

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细胞活力测定[2]
为了进行细胞存活率测定，将细胞（1-2×103个细胞/孔）以50μl的体积接种到96孔板上。胱天蛋白酶抑制剂在添加刺激物前1小时添加。在将细胞孵育指定时间后，根据制造商的说明 使用ATPLite试剂盒测定细胞存活率。对于台盼蓝染料排除试验，去除培养基，在室温下用磷酸缓冲盐水中的10mm EDTA分离贴壁细胞2分钟。将培养基和贴壁细胞放入试管中，通过离心收集细胞。将重新悬浮在培养基中的细胞等分试样与0.4%染料以1:1的比例混合。用血细胞计数器对活细胞和死细胞进行定量。

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蛋白质印迹分析[2]
在所需的处理后，用磷酸缓冲盐水洗涤细胞（1-3×106）一次，并在样品缓冲液（100-120μl）中裂解以进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），并立即煮沸4分钟。为了测量线粒体中细胞色素c的释放，按照所述制备了细胞质和线粒体组分。对每个样品进行7.5%、10%或12.5%的SDS-PAGE，随后将凝胶中分离的蛋白质电转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下，用TBS-T中的5%脱脂奶粉（20 mm Tris-HCl（pH 7.4）、8 g/l NaCl和0.1%吐温20）封闭膜1-2小时。然后将膜与含有5%脱脂奶粉或5%牛血清白蛋白的TBS-T中指定的一抗在4°C下孵育过夜。用TBS-T洗涤膜三次，并在室温下用过氧化物酶偶联的二抗探测1.5-2小时。用TBS-T洗涤四次后，根据制造商的说明，使用ECL Plus蛋白质印迹检测系统对蛋白质进行可视化。使用Quantify One程序通过密度分析对蛋白质进行定量。分别使用SAPK/JNK和p38 MAPK检测试剂盒测定细胞提取物中JNK和p38的激酶活性。

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半胱天冬酶活性测定[2]
经过所需的处理后，收获细胞（2.5×106），并将其重新悬浮在100μl的裂解缓冲液中（10 mm HEPES，pH 7.4，150 mm NaCl，1 mm EDTA，1 mm二硫苏糖醇和0.2%Nonidet P-40）。将细胞在冰上裂解20分钟，然后剧烈混合。在4°C下以14000 rpm离心15分钟后，使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度。为了测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的活化，将20μg的每种细胞提取物在37°C下在含有200μmAc-DEVD-p-硝基苯胺底物的测定缓冲液（20 mm HEPES，pH 7.4，100 mm NaCl，10 mm二硫苏糖醇，1 mmEDTA，0.1%CHAPS和10%蔗糖）中孵育。使用平板读数器在405nm下测量了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3介导的Ac-DEVD-p-硝基苯胺裂解为对硝基苯胺。

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DNA片段化和核染色分析[2]
在对细胞进行所需的处理（1×106）后，如上所述收集贴壁和分离的细胞，用磷酸缓冲盐水洗涤一次，并在100μl含有10 mm Tris-HCl（pH 7.4）、10 mm EDTA和0.5%Triton X-100的TE-T缓冲液中裂解。将裂解物在4°C下以14000 rpm离心5分钟，然后用核糖核酸酶A（0.2 mg/ml）在37°C下消化上清液1小时，然后用蛋白酶K（0.2 mg/ml）在37℃下孵育1小时。在-20°C下用50%异丙醇和0.5m NaCl处理过夜后，在4°C下以14000 rpm离心15分钟，使样品中的DNA沉淀。将DNA重新悬浮在30μl TE缓冲液中，在0.2μg/ml溴化乙锭的存在下，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。对于凋亡细胞的荧光显微镜分析，在培养基中加入Hoechst 33342（300 ng/ml），在显微镜观察前将细胞在室温下孵育20分钟。

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线粒体膜电位的测定[2]
通过使用JC-1（一种可以选择性进入线粒体的亲脂性阳离子）评估线粒体膜电位。将JC-1溶解在二甲亚砜中，得到1mg/ml的溶液。在含有5%FCS和0.1%NaN3的磷酸盐缓冲盐水荧光激活细胞分选缓冲液中进一步稀释至20μg/ml，并使用0.45-μm过滤器过滤。在对细胞进行所需的处理（2×105）后，如上所述收集贴壁和分离的细胞，并将其重新悬浮在125μl荧光激活的细胞分选缓冲液中。将细胞悬浮液与250μl过滤的JC-1工作溶液在室温下孵育20分钟。用流式细胞仪分析红色和绿色荧光发射。以列表模式采集每个样本至少10000个细胞，并使用Winmdi软件进行分析。线粒体膜电位的降低是由红色与绿色荧光强度之比的降低决定的。

动物/疾病模型： 6-8周龄雌性NOD/SCID（重症联合免疫缺陷）小鼠[2]。
剂量： 100 μg
给药途径： 腹腔注射；隔日一次，共三次
实验结果： 与TRA-8联合使用时，肿瘤几乎完全消退。

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体内肿瘤杀伤活性分析[2]
将6-8周龄雌性NOD/SCID小鼠皮下接种1321N1细胞（1 × 10⁷）。接种7天后，每隔一天腹腔注射100 μg TRA-8和/或100 μg双吲哚马来酰亚胺VIII/Bis VIII，共三次。治疗七天后，通过肿瘤重量来确定 1321N1 细胞的生长情况。

[1]. Isoenzyme specificity of bisindolylmaleimides, selective inhibitors of protein kinase C. Biochem J. 1993 Sep 1;294 ( Pt 2):335-7.

[2]. Bisindolylmaleimide VIII enhances DR5-mediated apoptosis through the MKK4/JNK/p38 kinase and the mitochondrial pathways. J Biol Chem. 2002 Aug 9;277(32):29294-303.

蛋白激酶C (PKC) 同工酶家族被认为介导多种不同细胞类型中的广泛信号转导通路。一系列双吲哚基马来酰亚胺已被评估为传统PKC家族成员（PKC-α、-β、-γ）以及新型钙离子非依赖性PKC家族代表成员PKC-ε的抑制剂。与吲哚咔唑类化合物星形孢菌素不同，所有研究的双吲哚基马来酰亚胺均对PKC-α表现出轻微的选择性，而对其他同工酶则无明显选择性。此外，具有构象受限侧链的双吲哚基马来酰亚胺作为PKC-ε抑制剂的活性较低。其中最引人注目的是化合物 Ro 32-0432，它对 PKC-α 的选择性是 PKC-ε 的 10 倍，对 PKC-β I 的选择性是 PKC-ε 的 4 倍。[1]

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双吲哚基马来酰亚胺 VIII (Bis VIII) 此前已被证实可通过一种不依赖于蛋白激酶 C 的机制增强 Fas 介导的细胞凋亡。在本研究中，我们使用激动型抗人 DR5 单克隆抗体 TRA-8，检测了 Bis VIII 对 DR5 (TRAIL-R2) 诱导的细胞凋亡的影响。我们的结果表明，Bis VIII 能够在体外和体内增强 TRA-8 的促细胞凋亡活性。 TRA-8 与 Bis VIII 的联合作用导致 c-Jun N 端激酶 (JNK) 和 p38 丝裂原活化蛋白激酶的协同且持续激活，该过程由 MAPK 激酶 4 介导，并依赖于 caspase-8。线粒体途径参与了 Bis VIII 和 TRA-8 协同诱导的细胞凋亡。Bis VIII 单独作用即可诱导线粒体膜电位丧失，且不依赖于 caspase，也不会释放细胞色素 c。然而，在 Bis VIII 存在的情况下，TRA-8 可诱导更显著的线粒体膜电位丧失和细胞色素 c 的释放。这些结果表明，JNK/p38 的增强和持续激活以及线粒体膜电位的降低在 Bis VIII 协同诱导死亡受体介导的细胞凋亡中起着关键作用。 Bis VIII 增强 DR5 介导的细胞凋亡信号转导的独特能力揭示了该化合物与抗 DR5 抗体联合用于癌症治疗的潜在应用价值。[2]

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总之，我们提出了一种模型，其中 JNK/p38 通路与 caspase-8 之间的正向相互作用导致细胞凋亡信号转导增强。这一发现表明，任何通过 JNK/p38 通路对癌细胞的应激攻击都可能增强 TRA-8 或 TRAIL 的肿瘤杀伤活性。双吲哚基马来酰亚胺VIII（Bis VIII）通过靶向JNK/p38通路和线粒体通路增强DR5介导的细胞凋亡，这一独特特性的发现可能有助于设计和筛选更有效的化疗药物，以协同诱导癌细胞死亡受体介导的细胞凋亡。[2] PKC-o、-/?1、-/3w、-y、-8、-E和-C均已在大鼠脑组织中被发现，但每种同工酶的相对含量尚不明确。双吲哚基马来酰亚胺对PKC-&以及更值得关注的非典型PKC家族成员PKC-C的影响仍有待研究。[1] 此外，大鼠脑组织中可能还存在其他尚未鉴定的PKC同工酶。这些额外同工酶的存在或许可以解释为何将针对单个同工酶获得的IC50结果与针对大鼠脑PKC获得的IC50结果进行比较时，并非总能得到恒定的比值。然而，应避免从这些数据中得出过多结论，因为这些差异可能很大程度上是由测量值的标准偏差造成的。这些化合物对所检测的有限范围的同工酶选择性很低，因此不适合作为研究特定同工酶在细胞功能中作用的工具。然而，不同同工酶之间IC50值的微小差异或许可以解释Ro 31-7549对一系列佛波酯诱导的细胞反应的效力差异，尽管这些差异可能不足以转化到细胞系统中。如果不同的过程是由不同的同工酶介导的，那么IC50值预计会有所不同。据报道，吲哚咔唑类化合物K252a对传统的PKC同工酶（PKC-a、-3、-y）具有高度选择性，而对PKC4和PKC-e的选择性较低。尽管与本文所述的双吲哚基马来酰亚胺类化合物不同，K252a对PKC的选择性不如其他丝氨酸/苏氨酸激酶，但这一观察结果表明，设计高选择性的双吲哚基马来酰亚胺类蛋白激酶C抑制剂具有潜力，这些抑制剂也将对特定的PKC同工酶表现出高度选择性。

C26H28N4O5

476.53

458.195

125313-65-7

138516-31-1

2403

Typically exists as solid at room temperature

1.36 g/cm3

693ºC at 760 mmHg

372.9ºC

4.7E-19mmHg at 25°C

1.712

4.169

119.35

2

3

5

30

735

0

NCCCN1C=C(C2C(=O)NC(=O)C=2C2=CN(C)C3=CC=CC=C23)C2=CC=CC=C12

UQHKJRCFSLMWIA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H22N4O2/c1-27-13-17(15-7-2-4-9-19(15)27)21-22(24(30)26-23(21)29)18-14-28(12-6-11-25)20-10-5-3-8-16(18)20/h2-5,7-10,13-14H,6,11-12,25H2,1H3,(H,26,29,30)

3-[1-(3-aminopropyl)indol-3-yl]-4-(1-methylindol-3-yl)pyrrole-2,5-dione

Ro 31-7549 Monohydrate; Bisindolylmaleimide VIII; Ro-317549 Monohydrate; bisindolylmaleimide viii; 125313-65-7; Ro 31 7549; Ro-31 7549; Y6197FQK8I; DTXSID00154734; 1H-Pyrrole-2,5-dione, 3-(1-(3-aminopropyl)-1H-indol-3-yl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-; 1H-Pyrrole-2,5-dione, 3-[1-(3-aminopropyl)-1H-indol-3-yl]-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-; Ro317549 Monohydrate;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。