Phospholipase D

静息人中性粒细胞用花生四烯酸（AA）特异性酰化1-O-烷基-2-赖氨酸-sn-甘油-3-磷酸胆碱（1-O-烷基-2-lyso-GPC；Lyso-PAF）；然而，在刺激后，特异性丧失，并添加了其他脂肪酸残基。本研究的主要目的是比较细胞中存在的各种酰化反应，并确定刺激后特异性丧失的原因。CoA非依赖性转酰酶在中性粒细胞匀浆中具有活性，被发现对AA具有高度特异性和立体特异性，需要1-O-烷基-2-赖氨酸-GPC才能发挥活性。匀浆还含有酰基辅酶A:1-芳基-2-赖氨酸-sn-甘油-3-磷酸胆碱酰基转移酶活性，该活性将酰基链从油酰基、亚麻酰基或亚麻酰基辅酶A转移到1-烷基和1-酰基受体，但在使用花生四烯酸辅酶A时，更优选1-酰基受体。辅酶a依赖性和非依赖性活性在含有质膜和可能的其他膜的单个带中不连续的Percoll梯度上共同沉积。CoA单独促进匀浆中的非特异性酰化。在离子载体刺激的细胞的声波处理中，AA特异性酰化减弱了80%，而辅酶A依赖性酰基转移酶保持不变。在受刺激的细胞中，转酰酶的潜在磷脂AA供体基本耗尽，但不能解释酰化的大幅减少。1-O-烷基-1'-苯基-2-赖氨酸-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（烯基-2-赖氨酰-GPE）的积累，作为竞争底物，似乎是受刺激制剂中观察到赖氨酸-PAF AA特异性酰化减少的主要原因。去除烯基-2-赖氨酸-GPE恢复了活性，而向静息膜制剂中添加烯基-2-lyso-GPE（2微M）导致赖氨酸-PAF的转酰化显著降低[1]。

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结核分枝杆菌感染每年导致约130万人死亡。结核分枝杆菌主要存在于巨噬细胞内，并保持持续感染。为了应对感染和炎症，血小板活化因子C-16（PAF C-16）是一种磷脂化合物，由包括中性粒细胞和单核细胞在内的各种细胞释放。我们最近发现，PAF C-16可以通过破坏细菌细胞膜直接抑制两种代表性的非致病分枝杆菌，即牛型分枝杆菌BCG和耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）的生长。在这里，我们研究了PAF C-16对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的影响，并确定了其生长抑制功能的机制。我们的结果表明，外源性PAF C-16抑制了单核细胞系THP-1吞噬细胞内耻垢分枝杆菌的生长；这种作用被PAF受体拮抗剂部分阻断，表明PAF受体介导的信号通路参与其中。花生四烯酸是PAF C-16信号通路的下游代谢产物，在体外直接抑制耻垢分枝杆菌的生长。此外，抑制参与PAF C-16信号通路的磷脂酶C和磷脂酶A2活性，增加了细胞内耻垢分枝杆菌的存活率。有趣的是，我们还观察到，抑制诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和抗体介导的TNF-α中和部分减轻了PAF C-16的细胞内生长抑制作用。使用许多PAF C-16结构类似物，包括Lyso PAF、2-O-甲基PAF、PAF C-18和己醇氨基PAF，表明PAF甘油骨架sn-2位置存在乙酰基（CH3CO）对耻垢分枝杆菌的细胞内生长抑制活性很重要。综上所述，这些结果表明，外源性PAF C-16治疗以一氧化氮和TNF-α依赖的方式至少部分抑制了耻垢分枝杆菌的细胞内生长[3]。

利用新发现的溶血磷脂特异性磷脂酶D（溶血磷脂D（LysoPLD））的底物特异性。Lp-PLA2将1-O-十六烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（C16 PAF）水解为1-O-十六酰基-2-羟基-sn-甘油3-磷酸胆碱（LysoPAF）。LysoPLD作用于LysoPAF，胆碱氧化酶检测到水解释放的胆碱[2]。

使用THP-1细胞对耻垢分枝杆菌进行细胞内生长抑制试验[3]
进行细胞内细菌生长抑制试验，以研究不同试验化合物（包括PAF C-16和PAF结构类似物）对THP-1细胞内吞噬耻垢分枝杆菌生长的影响。THP-1细胞以0.5-0.75×106/ml的密度生长，用普通RPMI培养基洗涤两次，并在不含抗生素的cRPMI中调节至约0.25×106/ml。将1ml这种细胞悬浮液加入到单独的Eppendorf管中。然后将约1.25×106 M.耻垢菌（细菌与THP1的比例为5:1）加入到每个试管中。这些试管在37°C的CO2培养箱中孵育2小时，并间歇性摇晃，以允许细菌吞噬。

制备与小鼠泛抗人MHC I类（HLA A、B和C）抗体W6/32结合的泛抗小鼠IgG包被的Dynabeads磁珠，以去除未吞噬的耻垢分枝杆菌。对于每个样品，将106个Dynabeads与1μg W6/32在冰上孵育90分钟，以使珠子与W6/32抗体结合。随后，通过施加Dynal®磁铁，用普通RPMI洗涤珠子两次，并将该试剂（Dynabeads-W6/32）重新悬浮在25μl RPMI中。然后将“Dynabeads-W6/32”加入到预先制备的试管中，试管中装有带有耻垢分枝杆菌的THP-1细胞（珠子与细胞的比例为4:1）。然后将Eppendorf管置于冰上45分钟，间歇性摇晃，使“Dynabeads-W6/32”的W6/32组分与THP-1细胞上存在的MHC I类分子结合。孵育后，通过施加Dynal®磁铁并用普通RPMI洗涤细胞两次，去除细胞外耻垢分枝杆菌。随后将细胞重新悬浮在不含抗生素的1ml cRPMI中。对于每个实验，都包括溶剂对照和测试化合物处理的样品，并将试管在37°C的CO2培养箱中再培养24小时。培养后，将Dynal®磁铁施加到Eppendorf试管上。附着在THP-1细胞上的“Dynabeads-W6/32”迁移到Eppendorf管一侧。去除上清液并储存在15ml猎鹰管中，以收集垂死细胞释放的任何细胞外细菌。通过加入1ml 1%w/v皂苷水溶液并涡旋混合物15分钟来裂解留在Eppendorf管中的THP-1细胞。将每种情况的细胞裂解物转移到之前收集的已含有1ml细菌上清液的15ml猎鹰中。将每个猎鹰管的内容物通过涡旋混合10秒，并在无菌PBS中制备连续稀释液（10-1、10-2和10-3）。

最后，将稀释度为10-2和10-3的细菌悬浮液用于电镀。使用LB琼脂平板为每种实验条件接种200μl细菌悬浮液，一式三份。将培养板在37°C下孵育72小时，然后计数细菌CFU的数量。对受试化合物处理的平板和溶剂对照之间的CFU进行比较，以确定受试化合物对THP-1细胞内耻垢分枝杆菌生长的影响。

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评估PAF受体拮抗剂对PAF C-16诱导的细胞内耻垢分枝杆菌生长抑制的影响[3]
使用两种PAFR拮抗剂ABT-491和WEB-2086来研究它们对PAF C-16诱导的耻垢分枝杆菌细胞内生长抑制的影响。根据上述细胞内生长抑制试验进行试验，不同之处在于，感染耻垢分枝杆菌的THP-1细胞最初用PAFR拮抗剂（ABT-491或WEB-2086，每种2μg/ml）处理1小时，然后向细胞培养物中加入PAF C-16（1μg/ml），样品在37°C的CO2培养箱中进一步培养24小时。实验设计中还包括溶剂对照以及仅用PAFR拮抗剂处理的耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞的额外对照。

PLC、PLA2和iNOS化学抑制剂以及抗TNF-α抗体对PAF C-16诱导的耻垢分枝杆菌细胞内生长抑制的影响评估 使用PLC（U-73122）、cPLA2（苯磺酰胺）和iNOS（氨基胍半硫酸盐）抑制剂的检测也与细胞内生长抑制检测类似。唯一的区别是在治疗步骤中，首先用U-73122（2μM）（Macmillan和McCarron，2010）、苯磺酰胺（56 nM）（Faroqui等人，2006）或氨基胍半硫酸盐（1 mM）（Nascimento等人，2002）处理感染耻垢分枝杆菌的THP-1细胞1小时。随后，加入PAF C-16（1μg/ml），在37°C的CO2培养箱中进一步培养含有吞噬耻垢分枝菌的THP-1电池24小时。在相应的实验设计中还包括了一个额外的对照组，该对照组由用U-73122（2μM）、苯磺酰胺（56 nM）或氨基胍半硫酸盐（1 mM）处理的耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞组成。

抗TNF-α中和抗体用于研究TNF-α在PAF C-16诱导的细胞内耻垢分枝杆菌生长抑制中的作用。在用1μg/ml PAF C-16处理之前，用10μg/ml的小鼠抗人TNF-α抗体、同种型抗体对照（10μg/ml小鼠IgG）或乙醇（PAF C-15溶剂）处理感染耻垢分枝杆菌的THP-1细胞1小时，并在细胞裂解和平板前将细胞再温育24小时。

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直接生长抑制试验[3]
该测定如前所述进行（Riaz等人，2018），以研究花生四烯酸对耻垢分枝杆菌生长的直接影响。简而言之，将1ml LB肉汤悬浮液中稀释的耻垢分枝杆菌（2.5×104）在37°C下暴露于不同浓度的花生四烯酸中2小时，每15分钟混合一次。包括对试验化合物进行适当的溶剂控制（10μl/ml）。孵育后，将200μl来自试验管和对照管的细菌悬浮液接种在LB琼脂平板上，一式三份，平板在37°C下孵育72小时。使用菌落计数法检测试验化合物的直接生长抑制作用。

[1]. Enzymatic studies of lyso platelet-activating factor acylation in human neutrophils and changes upon stimulation. J Biol Chem. 1993 Apr 15;268(11):7965-75.
[2]. Novel enzymatic method for assaying Lp-PLA2 in serum. Clin Chim Acta. 2018 Jun;481:184-188.
[3]. Dissecting the Mechanism of Intracellular Mycobacterium smegmatis Growth Inhibition by Platelet Activating Factor C-16. Front Microbiol. 2020 Jun 10:11:1046.

溶血磷脂酰胆碱 O-16:0/0:0 是一种溶血磷脂酰胆碱 O-16:0e，其中 C-1 位的十六烷基含有 16 个碳原子，且均非不饱和。它是一种代谢产物。它是一种溶血磷脂酰胆碱 O-16:0 和 1-烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。

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背景：脂蛋白相关磷脂酶 A2 (Lp-PLA2) 的测定可作为传统心血管危险因素的辅助手段，用于识别心血管事件高风险人群。这可以通过使用 ELISA 平台定量蛋白质浓度或使用血小板激活因子 (PAF) 类似物作为底物来测定 Lp-PLA2 活性来实现。本文建立了一种利用1-O-十六烷基-2-乙酰基-rac-甘油-3-磷酸胆碱（rac C16 PAF）的酶法Lp-PLA2活性测定方法。
方法：利用了溶血磷脂酶D（溶血磷脂酶D，LysoPLD）新发现的底物特异性。Lp-PLA2水解1-O-十六烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（C16 PAF）生成1-O-十六烷基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（LysoPAF）。LysoPLD作用于LysoPAF，水解释放的胆碱通过胆碱氧化酶进行检测。
结果：对酶法Lp-PLA2活性测定与两种化学法Lp-PLA2活性测定（即LpPLA2 FS和PLAC®试验）以及ELISA测定的Lp-PLA2活性进行回归分析，得出相关系数分别为0.990、0.893和0.785（n = 30）。
结论：与化学法Lp-PLA2活性测定相比，该酶法Lp-PLA2活性测定具有以下优势：（i）仅需两种试剂，即可采用简单的两点线性校准方法，并使用一个校准品；（ii）无需添加血清中酯酶样活性的抑制剂。[2]

C24H52NO6P

481.6548

481.353

C, 59.85; H, 10.88; N, 2.91; O, 19.93; P, 6.43

52691-62-0

Lyso-PAF C-16-d4;201216-37-7

162126

White to off-white solid powder

3.23

97.86

1

6

24

32

450

1

CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@H](COP(=O)([O-])OCC[N+](C)(C)C)O

VLBPIWYTPAXCFJ-XMMPIXPASA-N

InChI=1S/C24H52NO6P/c1-5-6-7-8-9-10-11-12-13-14-15-16-17-18-20-29-22-24(26)23-31-32(27,28)30-21-19-25(2,3)4/h24,26H,5-23H2,1-4H3/t24-/m1/s1

3,5,9-Trioxa-4-phosphapentacosan-1-aminium, 4,7-dihydroxy-N,N,N-trimethyl-, inner salt, 4-oxide, (R)-

LPC O-16; 52691-62-0; 1-O-Hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine; Lyso-PAF C-16; 1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine; 1-O-Hexadecyl-2-lyso-glycero-3-phosphorylcholine; lyso-Platelet-activating factor; 1-O-Palmityl-sn-glycero-3-phosphocholine; FSF9VMH5MK;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~50 mg/mL (~103.81 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。