Natural trichothecene; mycotoxin

真菌毒素的真菌生产者能够合成一种以上的毒素。Alternariol （AOH）是一种真菌毒素，由许多种alternnaria产生，最常见的是alternnaria alternata。毒素3-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌醇（3-ADON）和15-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌醇（15-ADON）是镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）的乙酰化形式。在本研究中，通过MTT试验（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基溴化四唑）确定并评估了AOH、3- adon和15-ADON二元和三级联合处理HepG2细胞的毒性作用，随后应用等线图方法并阐明这些真菌毒素的混合物是否产生协同作用、拮抗作用或加性作用；最后，利用液相色谱-质谱（LC-MS/MS）设备分析HepG2细胞在应用处理条件后产生和释放的真菌毒素转化为代谢物的情况，并从培养基中提取真菌毒素。不同浓度处理HepG2细胞24、48、72h。在所有时间检测到的IC50值，在二进制组合中范围从0.8到>25μM；而第三纪则在7.5 ~ 12μM之间。在不同浓度的真菌毒素混合物中检测到的增效、拮抗或加性作用不同。在所有四种真菌毒素组合中，15-ADON+3-ADON表现出最高的毒性潜能。在所有的测定时间，回收率值随时间和组合而波动。[1]

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通过研究毛霉毒素脱氧雪腐镰刀菌醇（DON）及其乙酰化衍生物3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌醇(3ADON)和15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌醇（15ADON）对人肠道细胞Caco-2的影响，探讨其经上皮转运、基因表达和细胞因子分泌的影响。通过运输研究评估Caco-2细胞单层的通透性。在根尖-基底侧方向上，转运速率依次为DON、3ADON<15ADON。15ADON表现出最高的通透性，诱导最大的上皮电阻（TEER）下降，并促进显著的路西法黄通透性。这些结果表明，15ADON对细胞旁屏障功能影响极大。此外，利用DNA芯片技术筛选毒素诱导的基因表达，研究毒素对Caco-2细胞的影响。DON和15ADON诱导的最显著基因是炎症趋化因子IL-8，因此采用PCR和ELISA分析IL-8的mRNA表达和分泌情况。DON和乙酰化DON均可诱导mRNA的表达和IL-8的产生。特别的是，ELISA检测显示产生IL-8的能力排序为3ADON - 在人肝癌HepG2细胞中，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynivalenol）呈浓度依赖性细胞毒性。1 μM、5 μM、10 μM浓度处理24小时后，细胞活力分别下降10%、22%、35%（MTT法）。它诱导活性氧（ROS）生成：10 μM时细胞内ROS水平增加40%（DCFH-DA荧光法）；还造成DNA损伤：10 μM时彗星实验尾矩增加2.8倍 [1]
- 在人肠道上皮Caco-2细胞（分化为单层）中，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynivalenol）（5-20 μM，处理48小时）破坏肠道屏障完整性：跨上皮电阻（TEER）分别下降20%（5 μM）、32%（10 μM）、45%（20 μM）。它刺激白细胞介素-8（IL-8）分泌：20 μM时培养上清中IL-8水平增加3.2倍（ELISA法）。其肠道转运率约15%（放射性标记法），低于脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，约25%） [2]
- 在人血脑屏障（BBB）模型（hCMEC/D3内皮细胞）中，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynivalenol）（2.5-10 μM，处理24小时）破坏BBB完整性：TEER分别下降15%（2.5 μM）、22%（5 μM）、30%（10 μM）。它可透过BBB，表观渗透系数（Papp）约1.2×10⁻⁶ cm/s（HPLC检测）；还诱导白细胞介素-6（IL-6）分泌：10 μM时IL-6水平增加2.5倍（ELISA法） [3]

为了确定代谢物或降解产物AOH和DON的代谢物（3-ADON和15-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌醇(15-ADON)），在细胞毒性试验后，从96孔板上收集1.6 mL含死细胞的培养基，在暴露24、48和72小时进行提取程序，如上所述。试验阳性对照，AOH、3-ADON和15-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌醇(15-ADON)与不含HepG2细胞的培养基在同一时间孵育，各3次。在试验中，对照细胞用不含霉菌毒素的培养基（含≤1%甲醇或DMSO）在同一时间内暴露三次。[1]

MTT试验[1]
采用MTT法检测细胞毒性，按照Ruiz等人（2006年）的描述，进行了少量修改。该分析包括通过测定细胞中黄色可溶性四氮唑盐的还原量来测量细胞的活力，这些细胞通过线粒体反应对不溶性紫色甲酸晶体产生代谢活性。细胞以2 × 104个/孔的速度接种于96孔培养板中，并在添加霉菌毒素前粘附18-24小时。AOH、3-ADON和 15-Acetyl-deoxynivalenol (15-ADON) 的组合测试浓度分别为16:1或16:1:1，按2.3节所述1:2稀释（另见表1）。用补充培养基配制连续稀释液，加入设计的板中。以不含霉菌毒素且甲醇或DMSO浓度< 1%的培养基为对照。两种溶剂的组合对HepG2细胞没有任何影响（详见图2）。处理后，取出培养基，每个孔中加入200 μL新鲜培养基，其中含有50 μL MTT溶液(5 mg/ml；MTT粉末溶解在磷酸盐缓冲盐水中)。在37°C黑暗条件下孵育4小时后，去除含MTT的培养基，每孔加入200 μl DMSO和25 μl Soerensen溶液，然后使用ELISA板读仪Multiskan EX在570 nm处读取光密度。重复包括每种霉菌毒素组合加上在三个独立实验中测试的对照。根据全剂量-反应曲线计算平均抑制浓度（IC50）值。

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- HepG2细胞实验（[1]）：将HepG2细胞接种于96孔板（5×10³细胞/孔）和6孔板（2×10⁵细胞/孔），过夜培养后，用3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynivalenol）（1-10 μM）处理24小时。细胞活力检测：加入MTT试剂，测定570 nm处吸光度；ROS检测：细胞负载DCFH-DA，流式细胞术测荧光强度；DNA损伤检测：细胞进行彗星实验，荧光显微镜下分析尾矩 [1]
- Caco-2细胞实验（[2]）：将Caco-2细胞接种于Transwell小室（1×10⁵细胞/小室），培养21天形成融合单层（每日测TEER确认完整性）。用3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynivalenol）（5-20 μM）处理48小时：测TEER，收集上清ELISA法测IL-8；转运实验：顶侧加 14 C标记的药物，120分钟时测基底侧放射性，计算转运率和Papp [2]
- hCMEC/D3细胞BBB实验（[3]）：将hCMEC/D3细胞接种于Transwell小室（5×10⁴细胞/小室），培养7天形成BBB模型（测TEER确认完整性）。用3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynivalenol）（2.5-10 μM）处理24小时：测TEER，收集上清ELISA法测IL-6；BBB通透性实验：顶侧加药物，30-180分钟收集基底侧样品，HPLC测浓度并计算Papp [3]

在 Caco-2 单层细胞模型中，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3-Acetyldeoxynivalenol) 的肠道吸收程度中等：在 20 μM 浓度下，120 分钟时跨单层细胞的转运率约为 15%，表观扩散系数 (Papp) 约为 1.0×10⁻⁶ cm/s（低于脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)：转运率约为 25%，Papp 约为 1.8×10⁻⁶ cm/s）[2]
- 在 hCMEC/D3 血脑屏障模型中，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3-Acetyldeoxynivalenol) 可穿过血脑屏障：Papp 约为 1.2×10⁻⁶ cm/s，在 180 分钟时，基底外侧（模拟脑组织）的浓度达到顶端侧浓度的约 12% [3]

在 HepG2 细胞中，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（1-10 μM，处理 24 小时）引起剂量依赖性细胞毒性（10 μM 时细胞活力降低高达 35%），增加细胞内活性氧（ROS）（10 μM 时增加高达 40%），并诱导 DNA 损伤（彗星试验尾矩在 10 μM 时增加 2.8 倍）[1]
- 在 Caco-2 细胞中，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（5-20 μM，处理 48 小时）破坏单层细胞完整性（20 μM 时跨上皮电阻降低高达 45%）并引发肠道炎症（20 μM 时 IL-8 分泌增加高达 3.2 倍）[2]
- 在 hCMEC/D3 细胞中， 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（2.5-10 μM，24 小时处理）会损害血脑屏障的完整性（10 μM 时跨上皮电阻降低高达 30%），并诱发神经炎症（10 μM 时白细胞介素-6 分泌增加高达 2.5 倍）[3]

[1]. Binary and tertiary combination of alternariol, 3-acetyl-deoxynivalenol and 15-acetyl-deoxynivalenol on HepG2 cells: Toxic effects and evaluation of degradation products. Toxicol In Vitro. 2016 Aug;34:264-273.

[2]. Comparative study of deoxynivalenol, 3-acetyldeoxynivalenol, and 15-acetyldeoxynivalenolon intestinal transport and IL-8 secretion in the human cell line Caco-2. Toxicol In Vitro. 2013 Sep;27(6):1888-95.

[3]. Blood-Brain Barrier Effects of the Fusarium Mycotoxins Deoxynivalenol, 3Acetyldeoxynivalenol, and Moniliformin and Their Transfer to the Brain. PLoS One. 2015 Nov 23;10(11):e0143640.

3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇）是一种单端孢霉烯族毒素，是脱氧雪腐镰刀菌烯醇在C-3位氧原子上乙酰化的产物。它对皮肤和眼睛有刺激性，与其15-乙酰区域异构体和母体脱氧雪腐镰刀菌烯醇一起，被认为是谷物中最常见和分布最广泛的污染物之一。它既是一种表位，也是一种霉菌毒素。它在功能上与脱氧雪腐镰刀菌烯醇相关。
已有报道称，在禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和腐霉镰刀菌（Fusarium culmorum）中检测到了3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，并有相关数据。

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总之，在HepG2细胞系上进行的二元和三元霉菌毒素组合试验结果表明，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON）+ 15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ADON）的二元组合对增殖的HepG2细胞的毒性高于任何其他组合，这由它们的IC50值所证实。当单独研究3-ADON时，这一事实与上述结果相符，3-ADON在三种化合物（AOH、15-ADON和3-ADON）中表现出最高的毒理学效力。所有组合中检测到的主要效应是协同作用。本研究中观察到的潜在相互作用效应难以解释，可能与研究的浓度范围、每种混合物中的比例、测定的暴露时间和所研究的细胞系有关。一些假设被提出以解释所观察到的不同行为，例如：将霉菌毒素视为细胞转运系统的底物、代谢过程以及某些霉菌毒素的功能基团和/或其空间分布。培养基中残留的霉菌毒素含量最高的是AOH，高于任何DON代谢物。细胞培养基中获得的代谢物种类繁多，需要进一步研究以阐明它们是否可能产生细胞毒性效应。总之，很难阐明霉菌毒素组合产生细胞毒性效应的潜在机制。因此，应开展更多检测，以探究生化过程可能存在的紊乱，从而解释毒性差异。[1]

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背景：镰刀菌产生的次生代谢产物经常污染食品和饲料，并对人类和动物健康产生不利影响。镰刀菌毒素具有广泛的结构和生物合成多样性，导致不同的毒代动力学和毒效学特征。一些研究调查了真菌毒素的毒性，重点关注大脑等特定靶点。然而，真菌毒素到达大脑的速度以及它们是否会破坏血脑屏障的完整性仍然不清楚。本研究调查并比较了镰刀菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和莫尼利福明对血脑屏障的影响。此外，还分析了它们向大脑的转运特性，这对于风险评估（包括潜在的神经毒性作用）至关重要。方法：培养原代猪脑毛细血管内皮细胞，研究所检测的真菌毒素对体外血脑屏障的影响。采用细胞阻抗谱和¹⁴C放射性标记蔗糖渗透性测定法监测屏障完整性。利用高效液相色谱-质谱联用技术分析所施加毒素在细胞单层血液和脑组织之间的分布，以计算转运速率和渗透系数。结果：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）在10 μM浓度下降低了屏障完整性并产生细胞毒性作用。3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-acetyl deoxynivalenol）也观察到轻微的屏障完整性改变。后者能迅速穿过屏障，并进一步裂解为DON。DON和莫尼利福明（moniliformin）的转运速度较慢，但明显高于阴性对照组的渗透性。所有化合物均未在任何一个隔室中富集，表明没有外排转运蛋白参与其转运。[3]

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本研究提供了真菌毒素对血脑屏障 (BBB) 影响的数据。PBCEC 是研究这些影响的成熟体外模型。尽管研究结果可能无法直接推广到体内复杂且动态的人脑，但它们为研究真菌毒素潜在神经毒性提供了宝贵的信息。综上所述，单端孢霉烯族化合物（尤其是脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)）可能对血脑屏障产生细胞毒性作用并降低其完整性。体外研究表明，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3-AcDON) 和单端孢霉烯醇 (MON) 对血脑屏障的毒性作用较弱或几乎没有。就其转运特性而言，这通常取决于真菌毒素的极性和分子大小。DON 是一种中等大小的亲水性分子，而 MON 分子很小，但极性很强。与阴性对照¹⁴C蔗糖相比，DON和MON穿过PBCEC单层细胞的速度快3至4倍，其渗透性与吗啡相当，吗啡是一种中枢神经系统活性且可透过血脑屏障的药物[48]。这与其极性和分子大小相符。总之，本研究结果表明，DON和MON是可透过血脑屏障的霉菌毒素，尽管渗透程度有限。最后，3-AcDON的转运速度约为DON和MON的4倍。尽管3-AcDON的分子略大于DON，但乙酰化作用显著提高了其亲脂性，使其具有较高的血脑屏障渗透性。3-AcDON很可能穿过血脑屏障，并通过酯水解释放毒性更强的DON。因此，在毒性评估和风险评价中不应忽视3-AcDON。鉴于不同真菌毒素对血脑屏障的影响存在显著差异，未来的研究应进一步探究其他真菌毒素对血脑屏障的影响，以更全面地了解其对脑组织的影响。此外，镰刀菌毒素在食品和饲料中的普遍共存可能导致其产生联合效应。对于血脑屏障（BBB）而言，单端孢霉烯族毒素可能破坏其完整性，使其他无法以单一化合物形式穿过血脑屏障的真菌毒素进入大脑。

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- 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynivalenol，DON）是由镰刀菌属真菌产生的真菌毒素，常见于谷类作物（例如小麦、玉米）[1][2][3]
- 其毒性通过诱导氧化应激、破坏上皮/内皮屏障完整性以及触发炎症反应而发挥作用[1][2][3]
- 与DON（其母体化合物）相比，3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的肠道吸收率和血脑屏障通透性较低，但在相同浓度下具有相似的促炎和细胞毒性作用[2][3]

C17H22O7

338.35238

322.141

C, 60.35; H, 6.55; O, 33.10

50722-38-8

3-Acetyldeoxynivalenol-13C17;1217476-81-7

5458510

Typically exists as solid at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

529.8±50.0 °C at 760 mmHg

185.75°C

195.2±23.6 °C

0.0±3.2 mmHg at 25°C

1.598

-0.85

96.36

2

7

3

24

657

7

CC1=C[C@@H]2[C@](CO)([C@@H](C1=O)O)[C@@]3(C)C[C@H]([C@H]([C@]43CO4)O2)OC(=O)C

ADFIQZBYNGPCGY-HTJQZXIKSA-N

InChI=1S/C17H22O7/c1-8-4-11-16(6-18,13(21)12(8)20)15(3)5-10(23-9(2)19)14(24-11)17(15)7-22-17/h4,10-11,13-14,18,21H,5-7H2,1-3H3/t10-,11-,13-,14-,15-,16-,17+/m1/s1

[(1R,2R,3S,7R,9R,10R,12S)-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-1,5-dimethyl-4-oxospiro[8-oxatricyclo[7.2.1.02,7]dodec-5-ene-12,2'-oxirane]-10-yl] acetate

3-Acetyl Deoxynivalenol; 3-Acetyldeoxynivalenol; 50722-38-8; 3-Acetyl-deoxynivalenol; 3-acetyl-DON; 3-Acetyl don; deoxynivalenol 3-acetate; Deoxynivalenol monoacetate;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。