Microbial Metabolite; Production of norsolorinic acid (NA，a precursor of aflatoxin)

根据物理化学方法，纯化的抑制物质被鉴定为环（l-Leu-l-Pro）。通过尖端培养法测定，寄生曲霉SYS-4（=NRRL2999）产生黄曲霉毒素的50%抑制浓度为0.20 mg ml（-1）。高浓度（超过6.0 mg ml（-1））的环（l-Leu-l-Pro）进一步抑制了真菌的生长。环（D-亮氨酰基-D-脯氨酰基）和环（L-缬氨酸-L-脯氨酰）也观察到类似的抑制活性，而环（D-脯氨酰基-L-亮氨酰基）与环（L-脯氨酰-D-亮氨酰）的抑制活性较弱。逆转录PCR分析表明，环（L-亮氨酸-L-脯氨酰）抑制黄曲霉毒素相关基因aflR、hexB、pksL1和dmtA的转录。这是首次报道一种影响黄曲霉毒素产生的环二肽。[1]

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抑制活性的特征。[1]
我们使用微量滴定琼脂平板法研究了市售的环（l-Leu-l-Pro）对寄生A.NFRI-95突变体NA积累的抑制活性（表1）。发现这种浓度大于3.5 mg ml-1的物质可以完全抑制a.parasiticus NFRI-95对NA的积累。在1.0 mg ml-1的浓度下，它也部分抑制了NA的积累，这表明该浓度可能接近50%的抑制浓度。Cyclo（d-Leu-d-Pro）是Cyclo（l-Leu-l-Pro）的立体异构体，其活性与Cyclo（l-Leu-l-Prro）相似（图1D）。l-亮氨酸、d-亮氨酸、l-脯氨酸或d-脯氨酸或这些氨基酸的组合没有显示出任何抑制活性，表明这种抑制作用是针对环二肽的。还检测了其他四种含有环（l-Leu-l-Pro）氨基酸之一的环二肽（表1）。Cyclo（l-Leu-l-Gly）在浓度达到3.5 mg ml−1之前没有表现出任何活性，在6.0 mg ml−着1的浓度下，它对真菌的NA产生有微弱的抑制作用。另外两种环二肽，环（l-Gly-l-Pro）和环（d-Ala-l-Pro。相比之下，即使在0.3 mg ml-1的浓度下，环（l-Pro-l-Val）也能抑制NA的积累，这低于环（Leu-Pro）显示出抑制作用的浓度。这些结果表明，由一个疏水性氨基酸和脯氨酸组成的环二肽结构可能有助于抑制活性

我们更详细地比较了四种异构体的影响，即环（l-Leu-l-Pro）、环（d-Leu-d-Pro）、环（l-亮氨酸-d-Pro）和环（d-亮氨酸-l-Pro）（图1D和表1）cyclo（l-Leu-l-Pro）在3.5 mg ml-1的浓度下完全抑制了寄生A.NFRI-95对NA的积累，也抑制了孢子的形成。Cyclo（d-Leu-d-Pro）在相同浓度下也显示出对NA积累的完全抑制作用，而对孢子形成的影响似乎较弱，因为即使在6 mg ml-1的浓度下，真菌也能产生孢子。相比之下，其他两种异构体，环（l-Leu-d-Pro）和环（d-Leu-l-Pro）的活性要低得多。Cyclo（l-Leu-d-Pro）在12.0 mg ml−1的浓度下可以完全抑制NA积累，而Cyclo（d-Leu-l-Pro）即使在最高浓度下也不能完全抑制NA的积累（表1和图1D）。有趣的是，这些异构体影响了孢子的颜色，更高的浓度使孢子颜色从浅绿色变为深绿色。。[1]

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cyclo(l-Leu-l-Pro)对黄曲霉毒素产生的影响。[1]
A.寄生虫SYS-4（=NRRL2999）在尖端培养物中与不同浓度的环（l-Leu-l-Pro）或环（d-Leu-d-Pro）一起孵育。通过这种方法确定，浓度为3.5 mg ml−1的任何一种抑制剂都完全抑制了黄曲霉毒素的产生（图4A，泳道2和3），而在这种浓度下，真菌的生长只受到轻微影响。相比之下，当这两种物质的浓度均为6 mg ml−1时，菌丝体重量显著降低，表明高浓度的这些物质也可以抑制真菌生长。添加这些物质不会改变培养基的pH值。TLC还表明，菌丝体中没有积累任何与黄曲霉毒素产生途径相关的中间体（图4A，泳道5和6）

在尖端培养中，这两种物质的黄曲霉毒素产量在0至1.0 mg ml−1的浓度范围内都有所下降（图4B）。环（l-Leu-l-Pro）和环（d-Leu-d-Pro）的50%抑制浓度几乎相同，分别为0.20和0.13 mg ml−1。相比之下，在这些浓度下，真菌的生长没有受到影响，这表明这些环二肽特异性地抑制了黄曲霉毒素的产生。然而，较高浓度（超过6 mg ml-1）的物质抑制了真菌的生长（图4B）。 抑制黄曲霉毒素相关基因的转录。[1]
通过RT-PCR分析了环（l-Leu-l-Pro）对转录的影响。A.寄生菌SYS-4通过尖端培养法在含有或不含有浓度为3.5 mg ml−1的环（l-Leu-l-Pro）的YES培养基中培养。在没有抑制剂的情况下检测到黄曲霉毒素相关基因aflR、hexB、dmtA和pks的表达（图5A）。然而，这些基因的表达在3.5 mg ml-1的浓度下被环（l-Leu-l-Pro）完全抑制，而真菌生长在该浓度下仅受到轻微影响。培养滤液的薄层色谱也证实，抑制剂在3.5 mg ml−1的浓度下完全抑制了黄曲霉毒素的产生（图5B）。cmd基因是一种组成型表达的钙调素基因，与黄曲霉毒素的产生无关，在环（l-Leu-l-Pro）存在的情况下，cmd基因的表达没有受到抑制（图5A）。

我们还研究了环（l-Leu-l-Pro）对酶活性的影响。在饲养实验中，当将杂色曲霉素添加到培养基中时，200μl培养基中产生了56.4±5.7μg的黄曲霉毒素。相比之下，添加2.0 mgcyclo(l-Leu-l-Pro)ml−1会导致黄曲霉毒素产量急剧下降，降至无抑制剂时的7.1%（培养基中黄曲霉毒素总量为4.0±6.4μg）。杂色曲霉素产生黄曲霉毒素的抑制可能是由于环（l-Leu-l-Pro）抑制了酶基因的表达。

内生链霉菌菌株是新型生物活性分子的潜在来源。在这项研究中，cyclo(l-Leu-l-Pro) or gancidin W（GW）是从椭圆海岸树树皮中获得的内生放线菌属链霉菌SUK10中分离出来的，并对其进行了体内抗伯氏疟原虫PZZ1/100的测试<使用雄性ICR品系小鼠的4天抑制试验方法，在6.25和3.125μg kg-1体重下，strong>cyclo（l-Leu-l-Pro）或gancidin W/GW在第四天的抑制率接近80%。分别以盐酸奎宁和生理盐水作为阳性和阴性对照，比较两种浓度的cyclo（l-Leu-l-Pro）或gancidin W/GW，用3.125μg kg-1体重治疗的小鼠中有50%在感染后存活了11个月以上，几乎达到了正常小鼠的寿命。用环（l-Leu-l-Pro）或gancidin W/GW处理的小鼠血液样本中选定酶和蛋白质的生化测试也在正常水平内；此外，内部重要器官未发现异常或损伤。这些发现表明，这种从链霉菌SUK10中分离出来的生物活性化合物具有非常低的毒性，是动物模型中潜在的抗疟疾药物的良好候选者。[2]

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GW/cyclo（l-Leu-l-Pro）或gancidin W在五种不同浓度的窄范围内进行抗疟疾筛查，以确定哪种剂量具有最佳的抗疟疾活性。寄生虫血症密度值直接反映了抑制百分比值，其中抑制百分比越高，治疗越有效。发现3.125μg kg−1 bw剂量的抑制率最大。3.125μg kg−1 bw组与其他四种浓度组之间的抑制率接近80%，存在显著差异（P<0.05，n=6）。6.25μg kg−1 bw剂量下的抑制率也高于65%，这被认为是体内抗疟疾活性的基准，这一值远优于其他三种剂量浓度（表3）。[2]

用3.125μg kg−1 bw剂量的<强>环（l-Leu-l-Pro）或gancidin W/GW治疗的小鼠的存活时间几乎是12.5μg kg-1 bw剂量小鼠的两倍，并且按比例高于6.25μg kg-1 bw的小鼠（图3）。如前所述，体内和体外分析都预测，在较高的寄生虫抑制率下，接受治疗的小鼠的存活时间会更长。以3.125μg kg−1 bw的剂量浓度用cyclo（l-Leu-l-Pro）或gancidin W/GW治疗，小鼠存活时间最长（235.53±2.20天），明显高于其他剂量浓度（P<0.05，n=6）。与此同时，令人惊讶的是，用该浓度的cyclo（l-Leu-l-Pro）或gancidin W/GW单独治疗的组中剩余的50%（n=3）存活至感染后291.13±0.5天。根据之前的文献，这段存活时间被认为几乎达到了正常雄性小鼠在大约12-18个月时的寿命。直到感染后411天，所有PC小鼠都存活了下来，这一观察结果与之前的体内抗疟疾研究结果一致，而NC小鼠在感染后存活了7-9天，这也记录在本研究中。[2]

RT-PCR。[1]
A.寄生菌SYS-4（=NRRL2999）在YES肉汤或补充了3.5 mg环（l-Leu-l-Pro）ml−1的YES肉汤中培养。菌丝体培养63小时后，使用FastPrep FP100A（Q-BIO基因；BIO 101）用TRI试剂破坏菌丝体。根据制造商的说明制备总RNA，然后用无RNase的DNase处理。使用所得总RNA和RT-PCR试剂盒进行逆转录（RT）-PCR。使用的引物是aflR-BamHI-F（CGCGGATCCATGTGTGACATATCTCCC）和aflR-HindIII-R（CCCCAAGCTTCATTCGATGCAGGTAATC）用于aflR（登录号AF441437），HexB-F1（CTGCGGGTGGAGCTGCA）和HexB-R1（CAAGCTCCAAGGGCGGGGGGGC）用于己酸合酶基因（登录号AF 391094），pKSL1-F1（CCAGACAGCCCTATCTAG）和pKSL1-R1（GGAGTCCAGGTGATTCAGC）用于聚酮合成酶基因pKSL1（登录号L42761）6），用于O-甲基转移酶I基因的MT-1wholeF1（ACAAATACCCCTGGCTCAGG）和MT-1wholesR1（ACCTGTTCCATAATCGTC），dmtA（登录号AB022906），以及用于钙调素基因的CMDF1（GGTGGGCCAGACACAC）和CMDR1（CCGATGGGGGGGTCATGACGTG）（登录号AY017584）。

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喂养实验。[1]
通过尖端培养法，在28°C下，在添加或不添加2 mgcyclo（l-Leu-l-Pro）ml−1的情况下，将寄生A.NIAH-26在添加了40μM杂色曲霉素的YES培养基中培养4天。如上所述，通过用氯仿提取培养基，然后进行HPLC分析来测量黄曲霉毒素的形成。

抑制性物质 (e.g. cyclo(l-Leu-l-Pro))的活性测试。[1]
（i） 目视琼脂平板试验。[1]
为了选择抑制黄曲霉毒素产生的细菌，对NA积累突变体NFRI-95进行了轻微修改，使用了目视琼脂平板试验（14）（图1A）。将真菌孢子接种在含有GY琼脂的平板中心的一条线上，然后将细菌液体培养物的等分试样接种在距离中心线1.5cm的线上。在28°C下孵育3至7天后，从平板下侧观察细菌对菌丝体中NA积累或真菌生长的影响。真菌菌丝体中红色素（NA）的减少表明细菌抑制了黄曲霉毒素的产生。

（ii）微量滴定琼脂平板试验。[1]
基于视觉琼脂平板试验，我们设计了一个小规模的试验系统，其中使用96孔平底组织培养板作为培养容器（图1B和C）。将高压灭菌的GY琼脂（100μl）倒入每个孔中，然后固化。将每个纯化步骤的每个组分的等分试样（10至20μl）或含有抑制物质的甲醇溶液施加到琼脂培养基上，然后在没有盖子的情况下孵育30分钟以上，使溶液扩散到培养基中，甲醇蒸发。将A.parasiticus NFRI-95的孢子悬浮液（1μl）接种到培养基的中心。因为孢子的数量不影响结果，所以我们没有针对这种方法进行调整。在板的每个角落放置一小块粘土或Parafilm，在盖子和板之间形成一个薄间隙，并用手术胶带（21N，12号；12毫米乘9米）密封该间隙，使盖子不会打开。在28°C下孵育2或3天后，从平板下侧观察菌丝体的颜色。

（iii）Tip culture method [1]
使用移液管作为培养容器，将寄生曲霉SYS-4的孢子悬浮液（5μl）接种到250μl补充了不同浓度抑制物质的YES培养基中。在28°C下孵育4天后，通过离心分离菌丝体和培养基。为了检测黄曲霉毒素，将5μl培养基点样到薄层色谱（TLC）硅胶板（硅胶60）上，然后用含有氯仿、乙酸乙酯和90%甲酸（6:3:1，体积/体积/体积）的溶液展开。黄曲霉毒素在长波长紫外光（365 nm）下进行检测，并在紫外光（365纳米）下用Fluor-S MultiImager拍照。为了测量黄曲霉毒素的量，用氯仿提取培养滤液，并将所得氯仿提取物的等分试样注入岛津高效液相色谱（HPLC）装置（型号LC-10A），该装置配备有硅胶柱（0.46×15cm；Shim-pack CLC-SI）和荧光监测器（激发波长，365nm；发射波长，425nm；岛津型号RF-535），流速为1ml min-1，在室温下。溶剂体系由甲苯、乙酸乙酯、甲酸和甲醇（178:15:4:3，体积/体积/体积）组成。将黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的保留时间与标准代谢物样品（黄曲霉毒素B-黄曲霉毒素G混合物）的保留时间进行了比较。为了检测黄曲霉毒素的前体，用丙酮提取菌丝垫中的前体。提取物浓缩至干后，将碎片溶解在苯乙腈（98:2，体积比）中，然后通过TLC进行分析。

生物活性化合物的体内抗疟筛选[2]
\n所有动物实验均使用ICR品系雄性小鼠（n=120，25–30 g，6–8周龄），并随机分为20组（n=6）。所有组均饲养于不锈钢笼中，光照/黑暗周期为12:12，温度为28°C，每日自由采食。为诱导感染，将0.1 mL浓度为1.0×10⁶个伯氏疟原虫PZZ1/100的红细胞（RBC）寄生液腹腔注射至宿主小鼠体内。为了确定最佳浓度，将获得的cyclo(l-Leu-l-Pro)或gancidin W/GW组分溶解于1.0 mL二甲基亚砜(DMSO)中作为储备液，制备浓度分别为50、25、12.5、6.25和3.125 μg kg−1 bw的cyclo(l-Leu-l-Pro)或gancidin W/GW溶液。然后用无菌蒸馏水进行系列稀释，直至达到目标浓度。选择4天抑制试验进行抗疟筛选，其中治疗第0天为小鼠感染后2小时内立即给予0.1 mL所有浓度的cyclo(l-Leu-l-Pro)或gancidin W/GW溶液的当天。同时，分别使用0.1 mL浓度为10 mg kg−1 bw的去离子水稀释的盐酸奎宁(QH)溶液和0.9%生理盐水作为阳性对照(PC)和阴性对照(NC)溶液。
\n\n感染后20天，每日观察小鼠的存活时间（天）。抑制率>65%的治疗方案被认为具有抗疟活性，存活时间最长的小鼠组被认为接受了最佳治疗。\n\n化合物的体内毒性评估[2]
\n采用与抗疟筛选相同的小鼠（ICR品系，雄性，25–30 g，6–8周龄，n=36）进行体内毒性评估。所有毒性评估的动物实验均按照马来西亚国立大学动物伦理委员会(UKMAEC)批准的抗疟筛选方案进行。小鼠被分为12组（n=6），所有组均置于相同条件下饲养（室温28℃，不锈钢笼，12小时光照/12小时黑暗循环，每日自由采食）。在抗疟筛选中，采用最佳检测浓度，对经cyclo(l-Leu-l-Pro)或gancidin W/GW处理的小鼠进行毒性试验，试验方案分为两种：急性暴露（每日给药，持续7天）和亚急性暴露（每日给药，持续28天）。每种毒性方案又分为两组：未感染组和感染后2小时内立即给药组（第0天）。为便于标记，所有小鼠组分别标记为TA（未感染的急性暴露组）、TB（感染后2小时内立即给药组）、TC（未感染的亚急性暴露组）和TD（感染后2小时内立即给药组）。为了进行比较，我们还收集了两个对照组的数据，即未感染和未治疗的正常小鼠（CN）和单剂量感染小鼠（CI）。所有动物均在乙醚麻醉下处死，分别于暴露后第8天和第29天通过心脏穿刺采集每只小鼠0.8–1.0 mL血液，并检测血清总蛋白（STP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平。\n
\n\n从用于生化毒性试验的同一批乙醚麻醉小鼠中，分别采集肝脏、肾脏和脾脏三个重要器官，用于器官毒性和组织学研究。组织浸润过程由组织处理器自动完成。随后，使用包埋机将组织包埋于热石蜡中。最后，使用切片机将这些组织切成0.4–0.6 μm厚的薄片。组织学标本采用苏木精-伊红（H-E）染色法制备。将H-E染色切片置于计算机控制的光学显微镜下观察，放大倍数为100倍（在切片表面滴一滴油）或40倍（不滴油）。该方法对于清晰显示目标组织的内部结构至关重要，也有助于评估和识别组织中的异常、毒性和损伤。

[1]. Cyclo(L-leucyl-L-prolyl) produced by Achromobacter xylosoxidans inhibits aflatoxin production by Aspergillus parasiticus. Appl Environ Microbiol. 2004 Dec;70(12):7466-73.

[2]. Gancidin W, a potential low-toxicity antimalarial agent isolated from an endophytic Streptomyces SUK10. Drug Des Devel Ther. 2017 Feb 8;11:351-363

环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)是一种由亮氨酸和脯氨酸残基组成的同型环肽。它既是海洋代谢产物，也是细菌代谢产物。它是一种二肽、同型环肽和吡咯并吡嗪。ChEBI(3S,8aS)-3-异丁基六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮已在Epichloe typhina、Peroneutypa scoparia和其他有相关数据的生物体中被报道。

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黄曲霉毒素是强致癌和有毒物质，主要由黄曲霉和寄生曲霉产生。我们发现一种细菌显著抑制了寄生曲霉产生黄曲霉毒素前体——诺索洛林酸。根据其16S核糖体DNA序列，该细菌被鉴定为木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans），并命名为A. xylosoxidans NFRI-A1。木糖氧化无色杆菌菌株通常表现出类似的抑制作用。抑制物质分泌到培养基中，且在加热、酸或碱处理后保持稳定。尽管该细菌似乎产生多种抑制物质，但我们最终利用Diaion HP20柱层析、薄层层析和高效液相色谱法成功地从培养基中纯化出一种主要的抑制物质。根据理化方法，纯化的抑制物质被鉴定为环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)。采用尖端培养法测定，寄生无色杆菌SYS-4（= NRRL2999）产生黄曲霉毒素的50%抑制浓度为0.20 mg/ml。高浓度（超过 6.0 mg ml⁻¹）的环(L-亮氨酰-L-脯氨酰)进一步抑制真菌生长。环(D-亮氨酰-D-脯氨酰)和环(L-缬氨酰-L-脯氨酰)也观察到类似的抑制活性，而环(D-脯氨酰-L-亮氨酰)和环(L-脯氨酰-D-亮氨酰)的活性较弱。逆转录-PCR分析表明，环(L-亮氨酰-L-脯氨酰)抑制了黄曲霉毒素相关基因 aflR、hexB、pksL1 和 dmtA 的转录。这是首次报道影响黄曲霉毒素产生的环二肽。[1] 在纯化该抑制剂的过程中，我们发现 A1 菌株的培养基中除了环(L-亮氨酰-L-脯氨酰)之外，还含有至少三种抑制性物质。这些物质的含量不足以进行进一步的表征。尽管这些未知物质与环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)的组合可能产生协同抑制活性，但这些物质之间的详细关系仍有待研究。
木糖氧化假单胞菌NFRI-A1环二肽的生物合成机制和分泌机制仍不清楚。据报道，环二肽可能是蛋白质自发环化后的降解产物。然而，研究发现许多环二肽具有多种生物学功能。这些物质现在被认为是重要的代谢产物，而非蛋白质的产物。
为了从细菌培养物中纯化抑制剂，建立一种简单、灵敏且小规模的检测系统至关重要。虽然琼脂平板目测法能够提供灵敏且清晰的结果，但即使使用小尺寸平板（直径6厘米），实验规模似乎也过大。因此，我们设计了一种使用微孔板的小规模检测系统。微孔板非常实用。 Magnusson等人独立报道了使用类似的微孔板检测方法监测棒状乳杆菌亚种（Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis）代谢产物的抗真菌活性。我们已利用微孔琼脂平板检测法从土壤细菌中分离出其他抑制性物质。我们希望我们的一些研究成果能尽快用于预防黄曲霉毒素污染。[1]

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抗疟药物的给药完全取决于药物组合、感染阶段、感染宿主的副作用以及疟原虫的种类。奎宁已被证实可以杀死所有疟原虫细胞，无论其种类如何。然而，它仅在疟疾感染的早期阶段有效，而在此阶段，宿主通常不会出现症状。本研究中所有未经治疗的对照小鼠均在感染后7至9天内死亡，这与之前的体内抗疟研究结果一致，且与所用动物模型类型无关。尽管此前已有报道称其他链霉菌属物种中存在环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)或甘西丁W/GW，但其抗疟特性尚未被揭示。事实上，我们的结果表明，环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)或甘西丁W/GW是SUK10乙酸乙酯粗提物体内抗疟活性的代谢产物之一。本研究结果表明，内生于卵叶链霉菌(S. ovalis)树中的链霉菌SUK10是一种潜在的低毒性抗疟药物的良好来源。除了对疟原虫感染宿主的红细胞周期进程仍知之甚少之外，还有一种趋势是，在疟原虫生命周期的特定周期或阶段，某些抗疟参数的值会更高，而本研究并未考虑这些。[2]

C11H18N2O2

210.272822856903

210.136

C, 62.83; H, 8.63; N, 13.32; O, 15.22

2873-36-1

Cyclo(Pro-Leu);5654-86-4; 2873-36-1; 32510-93-3

7074739

White to off-white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

427.6±34.0 °C at 760 mmHg

163-165ºC

212.4±25.7 °C

0.0±1.0 mmHg at 25°C

1.530

1.1

49.41

1

2

2

15

288

2

O=C1[C@H](CC(C)C)NC([C@@H]2CCCN21)=O

SZJNCZMRZAUNQT-IUCAKERBSA-N

InChI=1S/C11H18N2O2/c1-7(2)6-8-11(15)13-5-3-4-9(13)10(14)12-8/h7-9H,3-6H2,1-2H3,(H,12,14)/t8-,9-/m0/s1

(3S,8aS)-3-(2-methylpropyl)-2,3,6,7,8,8a-hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione

2873-36-1; Gancidin W; Maculosin 6; Cyclo(-Leu-Pro); cyclo(L-leu-L-pro); (3S,8aS)-3-Isobutylhexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione; Gancidin W; cyclo(Leu-Pro); Cyclo(L-prolyl-L-leucyl); Cyclo-L-leu-L-pro;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 250 mg/mL (1188.95 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。