12G5 mAb-CXCR4 ( IC50 = 0.75 nM ); CXCL12^AF647-CXCR4 ( IC50 = 18 nM ); X4 HIV-1 (III_B) ( IC50 = 12.3 nM ); X4 HIV-1 (NL4.3) ( IC50 = 6.1 nM ); X4 HIV-1 (NL4.3^AMD3100) ( IC50 = 2822 nM ); X4 HIV-1 (RF) ( IC50 = 7.4 nM ); X4 HIV-1 (HE) ( IC50 = 9.8 nM ); HIV-2 (ROD) ( IC50 = 12.3 nM ); HIV-2 (EHO) ( IC50 = 12.3 nM )
C-X-C chemokine receptor 4 (CXCR4) (Ki: 1.2 nM [1]; IC50 for SDF-1α binding inhibition: 3.7 nM [1]; IC50 for HIV-1 entry inhibition: 0.04 μM [1]) [1]
- C-X-C chemokine receptor 4 (CXCR4) (no additional IC50, Ki) [2]

体外活性：与针对 CXCR4、12G5 的放射性标记单克隆抗体竞争时，AMD3465 的亲和力比 AMD3100 高 8 倍。 AMD3465 的亲和力在 (D262N)-CXCR4 中降低 > 5000 倍，在 (A175F)-CXCR4 中降低 1913 倍。 AMD3465 似乎与 TM-VII 胞外端（胞外环 3 的界面）和 HisIII:05 处的 HisVII:-02 相互作用。这两个 His 残基都面向 CXCR4 的主要结合口袋。 AMD3465 抑制 125I-SDF-1α 配体与 CCRF-CEM 细胞的结合。 AMD3465 通过 GTP 结合测量抑制 CXCR4 激活，IC50 为 10.38±1.99 nM，并抑制 SDF-1α 介导的钙流，IC50 为 12.07±2.42 nM。激酶测定：对于针对 CXCR4 的竞争性结合研究，将一定浓度范围的 AMD3465 在结合缓冲液（含有 5 mM MgCl2、1 mM CaCl2、0.25% BSA pH 7.4 的 PBS）中与 5×105 CCRF 于 4°C 孵育 3 小时-Millipore DuraporeTM 过滤板中的 CEM 细胞和 100 pM 125I-SDF-1α。用冷 50 mM HEPES、0.5 M NaCl pH 7.4 洗涤去除未结合的 125I-SDF-1α。针对 BLT1 的竞争结合测定是在表达重组 BLT1 的 CHO-S 细胞膜上进行的。通过机械细胞裂解和高速离心来制备膜，重悬于 50 mM HEPES、5 mM MgCl2 缓冲液中并快速冷冻。将膜制备物与 AMD3465 在含有 50 mM Tris（pH 7.4）、10 mM MgCl2、10 mM CaCl2、4 nM LTB4（与 1 nM 3H-LTB4 混合）和 8 μg 膜的测定混合物中室温孵育 1 小时。通过在 Millipore GF-C 型过滤板上过滤分离未结合的 3H-LTB4。使用 LKB Rackbeta 1209 液体闪烁计数器对结合放射性进行计数。 MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。它们仅供参考。细胞测定：在实验前一天，将U87.CD4.CXCR4转染子以每孔2×104个细胞接种于0.1％明胶包被的96孔黑壁微孔板(Costar，Cambridge，MA)中。实验当天，细胞上样荧光钙指示剂 Fluo-3 acetoxymethyl（4 μM），37°C 45 分钟。用钙流测定缓冲液（含有 20 mM Hepes 缓冲液和 0.2% 牛血清白蛋白的 Hanks 平衡盐溶液，pH 7.4）彻底清洗后，将细胞与 AMD3100 或 AMD3465 (1 μg/mL) 一起在 37°C 下预孵育 15 分钟在同一个缓冲区中。然后，在 37°C 下使用荧光成像读板仪同时监测所有孔中荧光随时间的变化，测量响应 2-50 ng/mL CXCL12 的细胞内钙动员。 MCE 尚未独立证实这些方法的准确性。它们仅供参考。

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1. 高亲和力结合CXCR4并阻断SDF-1α相互作用：AMD3465通过放射性配体结合实验证实与人CXCR4具有强效特异性结合，Ki值为1.2 nM；以剂量依赖性方式抑制CXCR4配体SDF-1α（CXCL12）与CXCR4的结合，IC50为3.7 nM；在高达10 μM的浓度下，对相关趋化因子受体CCR5无显著结合活性[1]
2. 强效抑制HIV进入：AMD3465有效阻断CXCR4嗜性HIV-1（X4-HIV-1）进入人T细胞及CD4+细胞系，对HIV-1 IIIB毒株的IC50为0.04 μM，对NL4-3毒株的IC50为0.12 μM；对CCR5嗜性HIV-1（R5-HIV-1）无抑制作用，证实其CXCR4特异性活性[1]
3. 抑制CXCR4介导的细胞迁移：AMD3465（0.1-1 μM）以剂量依赖性方式抑制SDF-1α诱导的CXCR4阳性Jurkat T细胞及原代人CD4+ T细胞迁移，1 μM时最大抑制率约为85%[1]
4. 抑制脑肿瘤细胞增殖并逆转cAMP抑制：在CXCR4阳性的U87MG人胶质母细胞瘤细胞中，AMD3465剂量依赖性抑制细胞增殖，IC50约为5 μM；同时逆转SDF-1α对毛喉素刺激的环腺苷酸（cAMP）积累的抑制作用，10 μM时可将cAMP水平恢复至仅毛喉素处理组的约90%[2]

AMD3465（5 mg/kg，皮下注射）在 0.5 至 2 小时内显着升高 DBA/2、C57Bl/6 和 BALB/c 小鼠的总白细胞。 AMD3465 显着增加了所有三种小鼠品系的特定细胞群，包括中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。

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1. 抑制脑肿瘤生长并延长异种移植模型生存期：对荷颅内U87MG胶质母细胞瘤异种移植瘤的裸鼠，给予AMD3465（50 mg/kg，腹腔注射，每周2次，持续3周），与溶媒对照组相比，颅内肿瘤体积显著减少约52%，中位生存期延长约40%（从21天延长至29.4天）；肿瘤组织免疫组化分析显示，增殖指数（Ki-67阳性细胞）降低约38%，微血管密度减少约45%[2]
2. 体内阻断CXCR4介导的促肿瘤信号：AMD3465处理可降低肿瘤组织中SDF-1α/CXCR4依赖性下游信号通路（如PI3K/Akt）的激活，western blot检测证实Akt磷酸化水平（p-Akt）下降[2]

为了针对 CXCR4 进行竞争性结合研究，将一定浓度范围的 AMD3465 在结合缓冲液（含有 pH 7.4、0.25% BSA、1 mM CaCl2 和 5 ×105< 的 PBS）中于 4°C 孵育三小时。 /sup> CCRF-CEM 细胞）在 Millipore DuraporeTM 过滤板中。用冷 50 mM HEPES 和 0.5 M NaCl pH 7.4 清洗，去除未结合的 125I-SDF-1α。来自表达重组 BLT1 的 CHO-S 细胞的膜用于针对该蛋白质的竞争结合测定。使用机械细胞裂解、高速离心、在含有 50 mM HEPES 和 5 mM MgCl2 的缓冲液中重悬以及快速冷冻来制备膜。将包含 50 mM Tris、pH 7.4、10 mM MgCl2、10 mM CaCl2、4 nM LTB4 与 1 nM 3H-LTB4 组合的测定混合物以及 8 μg 膜与 AMD3465 在室温下孵育 1 小时。过滤用于在 Millipore GF-C 型滤板上分离未结合的 3H-LTB4。液体闪烁计数器（LKB Rackbeta 1209）用于计算结合的放射性。 MCE 尚未独立验证这些技术的准确性。它们仅供参考。

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1. CXCR4亲和力放射性配体结合实验：
- 膜制备：通过差速离心从表达CXCR4的人T细胞系或转染的HEK293细胞中分离膜制剂[1]
- 结合反应设置：将膜制剂与固定浓度的[¹²⁵I]标记SDF-1α及系列稀释的AMD3465（0.01 nM-10 μM）在结合缓冲液中25°C孵育60分钟[1]
- 分离与检测：通过预浸泡在结合缓冲液中的玻璃纤维滤膜快速过滤分离结合态与游离态放射性配体，洗涤滤膜后用γ计数器定量放射性，采用非线性回归从竞争结合曲线计算Ki值[1]
2. CXCR4功能抑制cAMP积累实验：
- 细胞制备：将U87MG胶质母细胞瘤细胞接种到24孔板中，孵育过夜至融合度达80%[2]
- 药物与激动剂处理：用AMD3465（0.1 μM-10 μM）预处理细胞30分钟，随后加入SDF-1α（100 nM）和毛喉素（10 μM）共孵育45分钟[2]
- cAMP检测：用冰浴裂解液裂解细胞，采用竞争性ELISA试剂盒测定cAMP浓度，分析AMD3465逆转SDF-1α诱导的cAMP抑制的能力[2]

24小时血清饥饿期后，对星形胶质细胞、颗粒细胞、U87细胞和Daoy细胞施用1μg/mL CXCL12、2.5ng/mL AMD 3465、200μM咯利普兰或10μM毛喉素。分别处理 24 小时和 48 小时后，使用台盼蓝排除法测量培养物中 Daoy 和 U87 细胞的生长情况[2]。

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1. HIV-1进入抑制实验：
- 细胞制备：将人CD4+ T细胞系（如CEM-SS）或原代人PBMC来源CD4+ T细胞以1×10⁴个细胞/孔接种到96孔板中[1]
- 药物与病毒处理：向细胞中加入系列稀释的AMD3465（0.001 μM-10 μM），随后用X4-HIV-1毒株（如IIIB、NL4-3）以感染复数（MOI）0.01感染细胞[1]
- 感染检测：孵育48-72小时后，通过ELISA测定培养上清中HIV-1 p24衣壳蛋白水平量化病毒复制，计算抑制p24产生50%的浓度（IC50）[1]
2. CXCR4介导的细胞迁移实验（Transwell法）：
- 细胞制备：将Jurkat T细胞或原代CD4+ T细胞重悬于无血清培养基，浓度为5×10⁵个细胞/mL[1]
- 实验设置：Transwell小室下室加入含SDF-1α（100 ng/mL）的培养基作为趋化因子，上室加入细胞及系列稀释的AMD3465（0.1 μM-10 μM）[1]
- 迁移检测：37°C、5% CO₂孵育4小时后，去除上室未迁移细胞，用血细胞计数板计数下室迁移细胞，相对于溶媒对照组计算迁移抑制率[1]
3. 胶质母细胞瘤细胞增殖实验：
- 细胞接种：将U87MG细胞以2×10³个细胞/孔接种到96孔板中，孵育过夜[2]
- 药物处理：向细胞中加入系列稀释的AMD3465（0.1 μM-20 μM），继续孵育72小时[2]
- 增殖检测：用结晶紫染色细胞，在570 nm处测定吸光度，相对于溶媒对照组计算细胞活力，推导IC50值[2]

1. 体外细胞毒性：AMD3465 对人 T 细胞系 (CEM-SS)、原代 CD4+ T 细胞和 U87MG 胶质母细胞瘤细胞均表现出较低的细胞毒性，其 50% 细胞毒性浓度 (CC50) 值大于 20 μM。治疗指数 (TI = CC50/IC50) 范围为 167（针对 HIV-1 IIIB 型）至 40（针对 U87MG 增殖抑制）[1, 2]
2. 体内毒性：在用 AMD3465 (50 mg/kg，腹腔注射，每周两次，持续 3 周) 处理的裸鼠中，未观察到体重、食物摄入量或器官重量（肝脏、肾脏、脑）的显著变化。未检测到急性毒性症状（例如嗜睡、行为异常、出血）或主要器官的组织学异常[2]

[1]. AMD3465, a monomacrocyclic CXCR4 antagonist and potent HIV entry inhibitor. Biochem Pharmacol. 2005 Sep 1;70(5):752-61.

[2]. Blocking CXCR4-mediated cyclic AMP suppression inhibits brain tumor growth in vivo. Cancer Res. 2007 Jan 15;67(2):651-8.

1. AMD3465 是一种 CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4) 的单大环小分子拮抗剂 [1]
2. CXCR4 是一种 G 蛋白偶联受体 (GPCR)，它与其配体 SDF-1α (CXCL12) 相互作用，调节细胞迁移、增殖和存活。 X4-HIV-1 利用 CXCR4 进入宿主细胞，并在多种肿瘤（例如胶质母细胞瘤）中过度表达，从而促进肿瘤生长和血管生成 [1, 2]。
3. AMD3465 的核心机制涉及与 CXCR4 竞争性结合，阻断 SDF-1α/CXCR4 相互作用及其下游信号传导，从而抑制 HIV-1 进入（抗病毒活性）和肿瘤细胞增殖及血管生成（抗癌活性）[1, 2]。
4. 在浓度高达 10 μM 时，AMD3465 对 CXCR4 的选择性远高于其他趋化因子受体（例如 CCR5、CCR1），从而最大限度地减少脱靶效应 [1]。
5. 该化合物在治疗 X4-HIV-1 感染和 CXCR4 过表达肿瘤（例如胶质母细胞瘤）方面具有潜在的治疗应用价值 [1, 2]。 2]

C24H38N6

410.10

410.315

C, 70.20; H, 9.33; N, 20.47

185991-24-6

AMD 3465 hexahydrobromide; 185991-07-5

483559

Off-white to light yellow solid powder

1.0±0.1 g/cm3

571.3±50.0 °C at 760 mmHg

299.3±30.1 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.533

0.92

64.2

4

6

6

30

413

0

C1(CNCC2=CC=C(CN3CCNCCCNCCNCCC3)C=C2)=NC=CC=C1

CWJJHESJXJQCJA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H38N6/c1-2-13-29-24(5-1)20-28-19-22-6-8-23(9-7-22)21-30-17-4-12-26-15-14-25-10-3-11-27-16-18-30/h1-2,5-9,13,25-28H,3-4,10-12,14-21H2

N-(pyridin-2-ylmethyl)-1-[4-(1,4,8,11-tetrazacyclotetradec-1-ylmethyl)phenyl]methanamine

2934.99.03.00

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。