mGluR7

在不改变基线谷氨酸释放的情况下，在 4-氨基吡啶处理之前将突触体与 AMN082 (1 μM) 预孵育 10 分钟，可有效抑制 4-氨基吡啶诱发的谷氨酸释放 [2]。\n

---

\n\nAMN082是一种选择性代谢型谷氨酸mGlu7受体激动剂，据报道具有抗抑郁活性。考虑到谷氨酸过度释放与抑郁症的发病机制有关，我们研究了N，N'-二苄基乙烷-1,2-二胺盐酸（AMN082）对大鼠脑皮质神经末梢谷氨酸释放的影响及其可能的机制。在本研究中，我们观察到AMN082抑制4-氨基吡啶诱发的谷氨酸释放，这一现象被谷氨酸mGlu7受体拮抗剂MMPIP阻断。此外，western blot分析和免疫细胞化学证实突触前代谢性谷氨酸mGlu7受体蛋白的存在。AMN-082通过螯合胞外Ca2+离子和囊泡转运蛋白抑制剂，阻止了4-氨基吡啶诱导谷氨酸释放的作用；然而，AMN082的作用不受谷氨酸转运蛋白抑制剂的影响。AMN082降低了4-氨基吡啶引起的突触体内Ca2+浓度升高，但没有改变突触体膜电位。在存在Cav2.2 （n型）和Cav2.1 （P/ q型）通道阻断剂、腺苷酸环化酶抑制剂和蛋白激酶A抑制剂的情况下，AMN082对4-氨基吡啶诱发的谷氨酸释放的作用明显降低。这些结果表明，AMN-082激活代谢性谷氨酸mGlu7受体可降低腺苷酸环化酶/蛋白激酶A的激活，从而减少Ca2+通过电压依赖性Ca2+通道进入并减少诱发的谷氨酸释放。另外，临床上有效的抗抑郁药氟西汀完全阻断了AMN082对谷氨酸释放的抑制作用，表明这两种化合物抑制谷氨酸从脑皮质神经末端释放的胞内机制是一致的。[2]\n\n \n

---

\n代谢性谷氨酸受体（mGluR）亚型（mGluR1至mGluR8）在中枢神经系统中作为神经传递的重要突触前和突触后调节因子。这些受体由两个结构域组成，一个是包含正位激动剂位点的细胞外区域，另一个是跨膜七螺旋结构域，参与G蛋白的激活和对几种新合成的药理学调节剂的识别。突触前受体mGluR7在家族中表现出最高的进化保守性，但没有已知的选择性药理工具。在这里，我们描述了一种mglur7选择性激动剂，N，N'-二苯并基乙烷-1,2-二胺盐酸（AMN082），它通过跨膜区域的变构位点直接激活受体信号。在转染表达mGluR7的哺乳动物细胞中，AMN082能有效抑制cAMP积累并刺激GTPgammaS结合（ec50值，64-290 nM），其激动剂效果与l -2-氨基-4-磷酸丁酸盐（L-AP4）相当，优于l -谷氨酸。AMN082（<或= 10微米）对其他mGluR亚型和部分嗜电离性glur没有明显的激活或抑制作用。嵌合受体研究将AMN082的结合位点定位在mGluR7的跨膜区域，我们证明这种变构激动剂对正构配体的效力几乎没有影响。本研究为3g家族蛋白偶联受体（具有mglur样结构）的七螺旋结构域介导的完全激动剂活性提供了证据，这可能会带来药物开发机会。[1]

---

\n\nAMN082对克隆mGluR7的影响通过高通量随机筛选化学文库，鉴定出AMN082。AMN082的化学结构（图1）与已知的mGluR7配体完全无关，它们都来源于l-谷氨酸主链。该化合物在稳定表达人mGluR7b的CHO细胞中诱导了浓度依赖性抑制福斯柯林刺激的cAMP积累(图1a；EC50, 64±32 nM)，与正位III组mGluR激动剂DL-AP4的饱和浓度相当（图1A，虚线）。在3 μM以下，AMN082对表达mglur2的CHO细胞没有影响（图1B）。通过刺激gtp - γ - 35s结合进一步评价AMN082的药理特性和作用机制。AMN082 （3 μM）相对于l-谷氨酸的最大激动剂活性(100%；图1 c)。AMN082的刺激作用与l-谷氨酸和DL-AP4几乎是相加的（分别为238±11%和336±19%），而DL-AP4加l-谷氨酸（都是在最大活性浓度下）产生的刺激作用比DL-AP4单独产生的刺激小（133±4%比216±12%，图1C）。因此，l-谷氨酸和DL-AP4可能在同一受体位点相互作用，完全激动剂DL-AP4的活性似乎被部分激动剂l-谷氨酸抑制。接下来，第三组mglr选择性拮抗剂MSOP和CPPG与AMN082在亚极大DL-AP4存在下的浓度-响应曲线进行测试（图1D）： DL-AP4成分被拮抗剂完全消除，而AMN082刺激的gtp - γ 35s结合没有抑制作用。综上所述，图1c和D的数据表明，AMN082激活mGluR7信号很可能是通过与l-谷氨酸、DL-AP4、MSOP和CPPG等正构配体结合不同的位点来激活的。[1]

---

\n\nAMN082、DL-AP4和l-谷氨酸的浓度响应曲线见图2A。AMN082的效价远高于正构配体DL-AP4和l-谷氨酸；EC50值（95%置信区间）为260 nM (200；360)、540 μm (440；700 μM (580；分别为850)。为了分析l-谷氨酸位点配体与AMN082之间的潜在协同作用，我们绘制了不同固定浓度的l-谷氨酸对AMN082的浓度-响应曲线，以及l-谷氨酸对固定浓度的AMN082的浓度-响应曲线（图2 B-D）。AMN082的EC50在140 ~ 290 nM之间变化，95%置信区间大部分重叠（图2 B和D）。同样，无论AMN082的添加浓度如何，l-谷氨酸的EC50始终在640 ~ 830 μM之间（图2 C和D）。为了研究AMN082与mGluR7的结合是否会影响配体对l-谷氨酸位点的结合亲和力，我们分析了10 nM [3H]LY341495（一种竞争性mGluR拮抗剂）与稳定表达mGluR7a的CHO细胞制备的膜的结合位移；在高达30 μM的AMN082中，该放射性配体未发生位移。相比之下，10 mM L-AP4、l-谷氨酸或L-SOP可100%消除特异性结合（数据未显示）。此外，我们在3 μM AMN082存在和不存在的情况下，分别用L-SOP、L-AP4和l-glutamate绘制了[3H]LY341495的位移曲线。AMN082的加入只引起三条曲线的轻微左移；计算得到的Ki值95%置信区间（括号内单位为μM）如下：L-SOP， 45 μM (39；50);L-SOP加3 μM AMN082, 29 μM (24；35);L-ap4, 193 μm (165；224);L-AP4加3 μM AMN082, 176 μM (144；216);l-谷氨酸，624 μM (446；870);和l-谷氨酸加3 μM AMN082, 524 μM (436；631)（数据未显示）。[1]

---

\n\nAMN082直接与mGluR7的七螺旋区相互作用。接下来，我们打算将AMN082的结合位点定位到mGluR7蛋白的一个独立区域，并决定使用野生型mGluR7b和mGluR6构建体以及两种嵌合体：mGluR6/7b构建体包含mGluR6的n端胞外区域，mGluR7b的c端包含整个跨膜区域；mGluR7/6为反向嵌合体（见材料与方法及图3）。当使用gtp - γ - 35s结合刺激时，AMN082对mGluR6/7b和mGluR7/6嵌合体的活性分别与野生型mGluR7b和mGluR6非常相似：相对于DL-AP4的最大作用，AMN082对mglur7 /7b和mGluR6/7b的刺激作用为150-200%，而AMN082对mGluR6-和mGluR7/6表达膜的影响较小（相对于最大DL-AP4刺激作用为10-25%）（图3）。有趣的是，AMN082与DL-AP4联合对表达mglur7的细胞膜的刺激作用不仅仅是添加剂，而不是对表达mglur6 /7b的细胞膜的刺激作用（图3a和C）。此外，最初尝试使用缺失胞外结构域的截断突变体，但未观察到DL-AP4或AMN082的激活（数据未显示）；不能排除它们的翻译蛋白被错误折叠或不正确地插入到膜中。[1]

---

\n\nAMN082的选择性分析。在我们研究AMN082在所有8个已知的mglur和3个选定的嗜离子受体上的活性之前，我们通过放射性配位置换实验证实了1 μM的AMN082与30个不同的神经系统靶点没有显著的结合相互作用；该列表包括肾上腺素、多巴胺、GABA、组胺、乙酰胆碱、阿片类药物、血清素和P物质的受体，以及选定的神经递质再摄取位点(每个目标n = 2-4次测定；数据未显示)。图4显示了amno082对所有8个mglur和3个电离性glur的影响。当使用gtp - γ - 35s结合刺激时，3 μM和10 μM AMN082选择性地在mGluR7a和mGluR7b上表现出70-140%（相对于最大DL-AP4效应）的激活作用（图4 A和D）。在相同的实验设计下，AMN082（高达10 μM）对mGluR2-、mGluR3-、mGluR4-、mGluR6-或mglur8a表达细胞的膜几乎没有或没有刺激作用，并且在未转染的CHO细胞中也没有激活gtp - γ 35s结合（图4 B-D）。通过测量磷酸肌醇水解来确定AMN082是否激活I组mGluR亚型。AMN082在表达mGluR1b-或mglur5a的细胞中既没有表现出激动剂样活性，也没有表现出阳性的调节活性（图4D）。AMN082对两种NMDAR亚型和一种α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异氧唑丙酸（AMPA）受体亚型（NMDAR1a/2A、NMDAR1a/2B和GluR3）的功能激动剂和调节活性也被排除；图4 d);这个测试是通过细胞质钙的测定，使用稳定转染细胞系。此外，当使用上述功能受体检测格式时，高达10 μM的AMN082在任何测试的mGluR或离子型GluR亚型中均未显示出拮抗剂样作用（图4）[1].\n

AMN082（6 mg/kg；口服）以 mGluR7 依赖性方式使 mGluR7+/+ 小鼠（C57BL/6 遗传背景）的应激激素升高 [1]。 AMN082（1.25-5.0 mg/kg，腹腔注射；重复给药期间或可卡因或吗啡激发前每次注射可卡因或吗啡前 30 分钟）剂量依赖性地减弱可卡因或吗啡运动致敏的发展和表达 [3]。

---

AMN082的体内活性：mglur7依赖性应激激素的调节与所有已知的III类mGluRs的l-谷氨酸位点配体不同，AMN082在口服后很容易通过血脑屏障：口服10mg /kg的AMN082在大鼠和小鼠的脑组织中产生0.29 μmol/kg，口服14mg /kg的AMN082在口服1小时后分别产生0.62 μmol/kg（数据未显示）。 mGluR7在压力相关行为中的作用已被充分证明。因此，我们分析了口服AMN082对血清应激激素皮质酮和ACTH水平的影响。图5A显示，AMN082在野生型小鼠品系（C57BL/6）中以剂量依赖的方式增加血浆皮质酮。接下来，我们使用mGluR7缺陷小鼠（mGluR7-/-）和它们的野生型幼崽（mGluR7+/+）。同样，口服6mg /kg AMN082可引起mGluR7+/+动物血浆皮质酮增加约200%，但在mGluR7-/-小鼠中未观察到这种增加（图5B）。同样，在野生型动物口服AMN082 1小时后，血液中ACTH水平也增加到200%，但在mglur7缺陷小鼠中没有（图5C）。[1]

---

以往的研究表明，代谢性谷氨酸受体7 （mGluR7s）参与了药物成瘾。然而，这些受体在药物诱导的行为致敏中的作用尚不清楚。本研究的目的是确定全身注射选择性mGluR7变构激动剂AMN082是否能降低小鼠可卡因和吗啡诱导的多动和运动敏化的发生和表达，并影响小鼠对可卡因和吗啡刺激作用的相互交叉敏化。AMN082 （1.25-10.0 mg/kg, i.p）对小鼠的运动没有影响，也不影响可卡因或吗啡诱导的急性多动，但10 mg/kg的剂量抑制了两种药物的运动作用。反复暴露于可卡因或吗啡（10 mg/kg，每3天5次）在诱导致敏期间和分别在第17天或第20天给可卡因（10 mg/kg, i.p.）或吗啡（10 mg/kg, i.p.） 4天（可卡因）或7天（吗啡）戒断期后逐渐增加运动。低剂量AMN082预处理（1.25 ~ 5.0 mg/kg, i.p.p）在每次可卡因或吗啡注射前30分钟或在可卡因或吗啡刺激前进行预处理，剂量依赖性地减弱了可卡因或吗啡运动致敏的发展和表达。AMN082也抑制了这些药物之间的相互交叉致敏。在给予MMPIP （10 mg/kg, i.p）之前，选择性mGluR7拮抗剂逆转了AMN082对可卡因或吗啡致敏发展或表达的抑制作用。这些数据表明，AMN082通过涉及mGluR7s的机制减弱了可卡因和吗啡致敏的发展和表达，以及相互交叉致敏。因此，AMN082可能不仅在治疗可卡因或阿片类药物成瘾方面具有治疗意义，而且在治疗可卡因/阿片类药物滥用者方面也具有治疗意义。[3]

---

AMN082治疗对急性可卡因或吗啡诱导的过度运动和基础运动活性的影响。 联合给药AMN082对可卡因和吗啡运动刺激作用致敏发展的影响。MMPIP对amno082效应的影响。 AMN082处理对可卡因和吗啡运动刺激作用致敏性表达的影响。MMPIP对amno082效应的影响。 AMN082处理对可卡因和吗啡相互运动交叉致敏表达的影响。[3]

gtp - γ - 35s结合试验。[1]
用转染过的mGluR2-、mGluR3-、mGluR4-、mGluR6-、mGluR7a-、mGluR7b-、mGluR8a-、mGluR6/7b-和mglur7 /6表达细胞制备膜，按照Maj等人描述的方案进行gtp - γ 35s结合实验。

---

第二信使化验。[1]
如前所述，使用稳定表达单个mGluR亚型的CHO细胞系进行cAMP积累的测量。[3H]肌醇磷酸生成的测量方法参照Gasparini等人，钙的测量方法参照Maj等人。

---

[3H]LY341495结合试验。[1]
稳定表达mGluR7a的CHO细胞的膜组分（见上）在实验缓冲液（10 mM KH2PO4/100 mM KBr, pH 7.6）中稀释，用Polytron匀浆器短暂匀浆，在30°C下孵育10分钟。在96孔微滴板中配制检测混合物。最终体积为200 μl /孔的测定混合物的组成为：10 mM KH2PO4/100 mM KBr (pH 7.6)，预处理膜蛋白50 μg，小麦胚芽凝集素闪烁邻近测定（WGA SPA）微球1.5 mg, 10 nM [3H]LY341495，适当浓度的试验化合物。在1 mM l-丝氨酸-磷酸（L-SOP）存在下测定非特异性结合。样品在室温下孵育60分钟（摇晃），然后在TopCount中计数。在棱镜程序中采用非线性回归对数据进行分析。利用Cheng和Prusoff方程将IC50值转换为Ki值。

谷氨酸释放[2]
通过在线荧光法测定谷氨酸释放（Nicholls和Sihra， 1986， Lin等，2015）。将颗粒状突触体重悬于含有16 μM牛血清白蛋白的HEPES缓冲介质中，并在Perkin-Elmer LS-55荧光计中于370C恒温搅拌皿中孵育。4-氨基吡啶（1 mM）诱导谷氨酸释放后，加入NADP+（2 mM）、谷氨酸脱氢酶（50单位/ml）和CaCl2（1.2 mM）。通过测量激发和发射波长分别为340和460 nm的NADPH荧光来监测释放的谷氨酸氧化脱胺导致NADP+的减少。每次实验结束后加入外源性谷氨酸标准品（5 nmol），根据标准品所产生的荧光变化计算每毫克突触体蛋白释放的谷氨酸（nmol/mg）纳摩尔。本文中引用的释放值和柱状图中描述的释放值表示5 min去极化后谷氨酸的累积释放水平，并以nmol/mg/5 min表示。数据以2-s为间隔进行累积，累积数据采用Lotus 1-2-3进行分析。

---

胞浆游离Ca2+浓度（[Ca2+]C）在突触体群体[2]
用fura-2测定[Ca2+]C。将突触体（2 mg/ml）重悬于含有16 μM牛血清白蛋白的HEPES缓冲培养基中，在5 μM fura-2和0.1 mM CaCl2存在下，在37 °C搅拌试管中孵育30 min。fura-2装载后，将突触体制成颗粒，并在含有牛血清白蛋白的HEPES缓冲培养基中重悬。在Perkin-Elmer LS-55荧光仪中，将突触体悬浮液在含有1.2 mM CaCl2的恒温比色皿中搅拌，在激发波长340和380 nm（发射波长505 nm）处监测荧光。每隔2-s收集数据，并使用前面描述的公式计算[Ca2+]C (nM) （Grynkiewicz et al., 1985）。

---

Western blotting [2]
Synaptosomes在Tris- cold缓冲溶液（50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100，蛋白酶抑制剂鸡尾酒，pH 7.4）中裂解，并用蛋白测定试剂盒定量蛋白质含量。然后，用SDS-PAGE分离蛋白，转移到硝化纤维素膜上，与以下兔单克隆抗体之一：代谢性谷氨酸mGlu7（1:500）和β-肌动蛋白（1:2000）在40℃下孵育过夜。洗涤后，用过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗（1:50,00）孵育1 h。免疫反应性检测采用增强化学发光和定量密度测定使用Syngene软件图中的值是至少三个独立实验的平均值。

---

免疫细胞化学[2]< br > 将突触体放置在直径为20 mm的聚赖氨酸包被盖上1 h，用4%多聚醛在0.1 M磷酸盐缓冲盐水中固定15 min，用0.2% Triton X-100磷酸盐缓冲盐水渗透5 min，用合适的抗谷氨酸1型囊泡转运体（1:20 00）或mGlu7受体（1:20 00）的一抗孵育24 h，用含有0.2% Triton X-100的0.9% NaCl的50 mm Tris缓冲液稀释。用含0.9% NaCl的Tris缓冲液洗涤后，用含0.9% NaCl的Tris缓冲液稀释的二抗孵育突触体1 h：山羊抗小鼠DyLight 549(红色；1:200)或山羊抗兔FITG(绿色；1:200)。在含0.9% NaCl的Tris缓冲液中冲洗几次后，用荧光液贴装盖片，用400倍放大倍率的直立荧光显微镜观察突触体，用CCD相机拍摄图像。通过计算至少三个不同的字段来分析每个覆盖。

动物/疾病模型：雄性瑞士小鼠（20-25克）[3]
剂量：1.25、2.5、5.0 mg/kg
给药途径：腹腔注射；在第17天或第20天，分别给予可卡因（10 mg/kg）或吗啡（10 mg/kg）。结果：显著减弱了可卡因诱导的运动敏化；减弱了吗啡诱导的敏化。\n

---

\n\n体内动物实验程序AMN082给药。mGluR7-/-小鼠的构建方法如前所述，由E14（129/Ola）胚胎干细胞生成。本研究中使用的所有小鼠均携带野生型或突变型mGluR7等位基因，遗传背景为第14代（F14）C57BL/6。mGluR7-/-和mGluR7+/+小鼠的年龄匹配组按所述方法构建。所有实验均使用雄性小鼠。小鼠可自由摄取食物和自来水。雄性mGluR7+/+小鼠及其同窝mGluR7-/-小鼠经口（po）注射载体或1-6 mg/kg AMN082。一小时后，小鼠（mGluR7-/-和mGluR7+/+小鼠随机分组）被迅速断头处死（在首次接触笼子后30秒内），并采集躯干血（每种基因型n≥9）。所有动物实验均经过机构审查，并按照巴塞尔市兽医管理局的规定进行。\n

---

\n\n对于腹腔注射，AMN082和MMPIP均悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，该溶液用作溶剂。两种化合物的给药剂量均为10 ml/kg（0.01 ml/g体重）。实验期间每天均配制新鲜药物溶液。给药时间根据预实验和文献报道确定。 [3]

---

\n\nAMN082治疗对急性可卡因或吗啡诱导的活动过度和基础运动活性的影响[3]
\n小鼠（n = 6–10）在注射可卡因（10 mg/kg，腹腔注射）或吗啡（10 mg/kg，腹腔注射）前30分钟，预先注射AMN082（1.25、2.5、5.0或10 mg/kg，腹腔注射）或溶剂对照。分别在注射可卡因/吗啡后立即记录30分钟或60分钟的运动活性。此外，还研究了单独使用 AMN082（1.25、2.5、5.0 和 10 mg/kg，腹腔注射）对未接受过任何处理的小鼠的运动活性的影响。\n

---

\n\n\n共同给药 AMN082 对可卡因和吗啡运动兴奋作用的致敏作用发展的影响。 MMPIP对AMN082效应的影响[3]
\\n为了研究AMN082对可卡因运动兴奋作用敏化的影响，在实验第一天（第1天），小鼠（n = 7–9）在注射可卡因（10 mg/kg，腹腔注射）或生理盐水（对照组）前30分钟，预先腹腔注射AMN082（1.2、2.5或5.0 mg/kg）或溶剂。将小鼠直接放入测试装置中，并测量其运动活性30分钟。在第4、7、10和13天重复上述给药步骤，并按上述方法测量运动活性。为了确定mGluR7是否参与AMN082对可卡因致敏作用的影响，在可卡因处理组小鼠腹腔注射AMN082（5.0 mg/kg）前30分钟，预先注射MMPIP（10 mg/kg），一种mGluR7选择性变构拮抗剂。对照组小鼠注射生理盐水和溶剂。经过4天的戒断期（第17天），所有组别的小鼠均接受可卡因（10 mg/kg，腹腔注射）刺激，未给予AMN082和/或MMPIP，并测量其30分钟的运动活性。\n

\n为了研究AMN082对吗啡运动兴奋作用敏化的影响，将小鼠（n = 6–10）预先给予AMN082（1.25、2.5或5.0 mg/kg，腹腔注射）或溶剂，每3天注射一次吗啡（10 mg/kg，腹腔注射）或生理盐水（对照组），共注射5次（分别在第1、4、7、10和13天）。吗啡给药后立即测量其60分钟的运动活性。为了确定mGluR7是否参与AMN082对吗啡运动敏化诱导的影响，在吗啡处理组小鼠腹腔注射AMN082（5.0 mg/kg）前30分钟，预先腹腔注射MMPIP（10 mg/kg）。对照组小鼠注射生理盐水和溶剂。经过7天的戒断期（第20天），所有组小鼠均接受吗啡激发剂量（10 mg/kg，腹腔注射），但不给予AMN082和/或MMPIP，并测量其60分钟的运动活性。\n

---

\n\nAMN082处理对可卡因和吗啡运动兴奋作用敏化表达的影响。 MMPIP对AMN082效应的影响[3]
\\n为了检验AMN082对可卡因运动兴奋作用致敏表达的影响，我们按照上述方法对小鼠（n = 8–10）进行可卡因致敏处理。在测试日（实验第17天），小鼠在可卡因激发（10 mg/kg，腹腔注射）前30分钟分别接受AMN082（1.25、2.5或5.0 mg/kg，腹腔注射）或溶剂对照处理，并测量其30分钟的运动活性。为了确定mGluR7是否参与AMN082对可卡因致敏表达的影响，在可卡因激发（10 mg/kg，腹腔注射）前30分钟，先用MMPIP（10 mg/kg，腹腔注射）预处理可卡因致敏小鼠，再注射AMN082（5.0 mg/kg，腹腔注射）。可卡因激发后立即测量小鼠30分钟的运动活性。

\\n\\n为了评估mGluR7激动剂对吗啡诱导的运动致敏表达的影响，另取几组小鼠（n = 8–10）进行吗啡致敏，方法如上所述。在测试日（实验第20天），小鼠在接受吗啡激发剂量（10 mg/kg，腹腔注射）前30分钟，分别接受AMN082（1.25、2.5或5.0 mg/kg，腹腔注射）或载体处理，并记录60分钟的运动活性。为了确定mGluR7是否参与AMN082对吗啡致敏表达的影响，在吗啡激发（10 mg/kg，腹腔注射）前30分钟，对吗啡致敏小鼠预先注射MMPIP（10 mg/kg，腹腔注射），然后再注射AMN082（5.0 mg/kg）。吗啡激发后立即测量60分钟的运动活性。\n

---

\n\nAMN082对可卡因和吗啡之间相互运动交叉敏化表达的影响[3]
\n可卡因致敏的诱导按照上述方法进行。在4天未接受治疗后（实验第17天），对可卡因致敏和生理盐水处理的小鼠（n = 7–10）进行AMN082（2.5或5.0 mg/kg，腹腔注射）或溶剂预处理，并在吗啡（10 mg/kg，腹腔注射）激发前30分钟进行处理。吗啡激发后立即测量30分钟的运动活性。
\n吗啡致敏的诱导按照上述方法进行。在停药7天后（实验第20天），吗啡致敏并经生理盐水处理的小鼠（n = 9–10）在可卡因（10 mg/kg，腹腔注射）刺激前30分钟，预先接受AMN082（2.5或5.0 mg/kg，腹腔注射）或溶剂对照处理。可卡因刺激后立即测量小鼠60分钟的运动活性。

[1]. A selective metabotropic glutamate receptor 7 agonist: activation of receptor signaling via an allosteric site modulates stress parameters in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(51):18712-18717.

[2]. Metabotropic glutamate 7 receptor agonist AMN082 inhibits glutamate release in rat cerebral cortex nerve terminal. Eur J Pharmacol. 2018;823:11-18.

[3]. AMN082, a metabotropic glutamate receptor 7 allosteric agonist, attenuates locomotor sensitization and cross-sensitization induced by cocaine and morphine in mice. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2015;57:166-175.

AMN082二盐酸盐是由N,N'-双(二苯甲基)乙烷-1,2-二胺与两倍摩尔当量的盐酸反应制得的盐酸盐。它具有代谢型谷氨酸受体激动剂、抗衰老剂和神经保护剂的作用。其分子结构包含N,N'-双(二苯甲基)乙烷-1,2-二胺(2+)。

---

在本研究中，我们首次报道了选择性mGluR7激动剂AMN082。该化合物通过一个此前未被描述的位点发挥作用，具有口服活性，并能选择性地调节野生型小鼠体内两种应激激素——皮质酮和促肾上腺皮质激素（ACTH）的水平，但在mGluR7缺陷型小鼠中则无此作用，这进一步证实了mGluR7在应激生理中的作用。
AMN082在缺乏谷氨酸位点配体的情况下，可诱导与L-AP4相当的完全激动剂反应。我们利用嵌合受体获得的数据强烈提示，mGluR7跨膜结构域内存在一个变构激动剂位点。要最终确定该变构位点，尚需开发合适的放射性配体，以便测定其理化结合特性，例如Kd、Kon和Koff。然而，我们的嵌合受体数据，以及在与mGluR7功能研究相同的宿主细胞中表达的其他G蛋白偶联mGluR上未观察到AMN082活性，有力地表明AMN082的激动剂活性源于其与mGluR7蛋白的直接相互作用。特别是，这种mGluR7依赖性激动剂活性在G蛋白测定（GTPγS结合）和第二信使测定（cAMP积累）中均有观察到，这大大降低了AMN082与细胞内信号级联组分相互作用的可能性。总之，我们鉴定了一种选择性mGluR7激动剂AMN082，它通过变构位点发挥作用，可作为进一步揭示mGluR7在应激相关中枢神经系统疾病中作用的宝贵工具。 [1]

---

AMN082是一种选择性代谢型谷氨酸受体mGlu7激动剂，据报道具有抗抑郁活性。鉴于谷氨酸过度释放与抑郁症的发病机制有关，本研究探讨了N,N'-二苯甲基乙烷-1,2-二胺二盐酸盐（AMN082）对大鼠大脑皮层神经末梢谷氨酸释放的影响及其可能的潜在机制。本研究观察到，AMN082抑制了4-氨基吡啶诱导的谷氨酸释放，而代谢型谷氨酸受体mGlu7拮抗剂MMPIP可阻断这一现象。此外，蛋白质印迹分析和免疫细胞化学证实了突触前代谢型谷氨酸受体mGlu7蛋白的存在。螯合细胞外Ca²⁺离子和囊泡转运蛋白抑制剂可阻断AMN082对4-氨基吡啶诱导的谷氨酸释放的影响；然而，谷氨酸转运蛋白抑制剂对AMN082的作用没有影响。AMN082降低了4-氨基吡啶诱导的突触内Ca²⁺浓度升高，但并未改变突触体膜电位。在Cav2.2（N型）和Cav2.1（P/Q型）通道阻滞剂、腺苷酸环化酶抑制剂和蛋白激酶A抑制剂存在的情况下，AMN082对4-氨基吡啶诱导的谷氨酸释放的作用显著降低。这些结果表明，AMN082激活代谢型谷氨酸受体mGlu7可降低腺苷酸环化酶/蛋白激酶A的活性，进而减少Ca2+通过电压依赖性Ca2+通道的内流，从而降低诱发的谷氨酸释放。此外，临床有效的抗抑郁药氟西汀完全阻断了AMN082对谷氨酸释放的抑制作用，表明这两种化合物抑制脑皮层神经末梢谷氨酸释放的细胞内机制可能相同。[2]最后，我们提出，AMN082抑制4-氨基吡啶诱发的脑皮层神经末梢谷氨酸释放的作用可能与腺苷酸环化酶/环磷酸腺苷/蛋白激酶A通路的抑制有关。该建议基于以下结果：(1) AMN082抑制了福斯克林对4-氨基吡啶诱导的谷氨酸释放的促进作用；(2) 腺苷酸环化酶抑制剂MDL12330A和蛋白激酶A抑制剂H89可阻断AMN082对4-氨基吡啶诱导的谷氨酸释放的抑制作用。我们的发现与Summa等人(2013)的报道一致，该报道表明AMN082作用于海马神经末梢的代谢型谷氨酸受体mGlu7，并减少腺苷酸环化酶/环磷酸腺苷的生成，从而抑制γ-氨基丁酸的释放。既往研究发现，代谢型谷氨酸受体mGlu7存在于突触前，其激活可通过降低Gi/o蛋白偶联的腺苷酸环化酶/蛋白激酶A通路活性来抑制谷氨酸释放（Millán等，2002）。我们的数据表明，AMN082激活代谢型谷氨酸受体mGlu7可降低腺苷酸环化酶和蛋白激酶A的活性，进而减少通过Cav2.2（N型）和Cav2.1（P/Q型）钙离子通道的Ca2+内流，最终导致脑皮层神经末梢诱发的谷氨酸释放减少。总之，本研究证实代谢型谷氨酸受体mGlu7激动剂AMN082对大鼠脑皮层神经末梢的谷氨酸释放具有抑制作用。尽管本文探讨的AMN082抑制谷氨酸释放的功能作用尚不明确，但这种效应可能是一种治疗脑部疾病（例如抑郁症）的关键机制，因为这些疾病与谷氨酸过度释放有关（Hashimoto等，2007）。[2]已发表的数据表明，AMN082不影响可卡因戒断大鼠腹侧伏隔核（VP）中的细胞外谷氨酸或GABA释放（Li等，2010），提示谷氨酸和GABA能传递不参与AMN082诱导的可卡因诱发复吸的抑制作用。这表明，AMN082拮抗静脉注射可卡因自我给药（通过VP GABA能机制）和可卡因诱导的药物渴求行为恢复（通过伏隔核谷氨酸机制）的机制可能不同。然而，有研究表明，VP参与了长期（3周）吗啡戒断后而非短期（3天）吗啡戒断后吗啡运动敏化的表达（Mickiewicz等，2009）。因此，需要更多研究来充分阐明AMN082抑制可卡因和吗啡敏化的机制。
本研究首次证实，选择性mGluR7变构激动剂AMN082在低剂量下即可抑制可卡因和吗啡诱导的敏化及其交叉敏化的发展和表达，且该低剂量不会干扰这些药物引起的急性运动亢进。这些发现提示mGluR7在敏化现象中发挥着重要作用，因为mGluR7选择性变构拮抗剂MMPIP能够阻断AMN082的这些作用。因此，我们的研究表明，mGluR7参与了与可卡因和吗啡成瘾相关的神经适应过程。最后，我们的研究结果表明，mGluR7激动剂可以有效预防可卡因/吗啡依赖者复吸。[3]

C28H29CLN2

428.996266126633

464.179

C, 72.25; H, 6.50; Cl, 15.23; N, 6.02

97075-46-2

AMN082 free base;83027-13-8

11698390

White to off-white solid powder

8.13

24.06

4

2

9

32

362

0

Cl.C1C=CC(C(C2C=CC=CC=2)NCCNC(C2C=CC=CC=2)C2C=CC=CC=2)=CC=1

YRQCDCNQANSUPB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C28H28N2.2ClH/c1-5-13-23(14-6-1)27(24-15-7-2-8-16-24)29-21-22-30-28(25-17-9-3-10-18-25)26-19-11-4-12-20-26;;/h1-20,27-30H,21-22H2;2*1H

N,N'-dibenzhydrylethane-1,2-diamine;dihydrochloride

AMN082 DIHYDROCHLORIDE; 97075-46-2; AMN082; AMN 082 dihydrochloride; 83027-13-8; N,N'-Dibenzhydrylethane-1,2-diamine dihydrochloride; AMN 082 (Free base); N1,N2-Dibenzhydrylethane-1,2-diamine dihydrochloride;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~33.33 mg/mL (~71.61 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

---

注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

View More

注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

---

口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

View More

口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

---

注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。