Apafant   中文名称: 阿帕泛

Platelet-activating factor (PAF; Ki = 9.9 nM)

通过分化疗法治疗肿瘤的药理学方法依赖于细胞分化剂的可用性，其抗肿瘤疗效通常首先在体外对恶性细胞进行检测。以小鼠红白血病细胞（MELC）为模型，我们发现WEB-2086/Apafant是一种三唑苯二氮卓类衍生的PAF拮抗剂，最初是作为抗炎药开发的，由于真正致力于分化，它诱导了MELC生长和血红蛋白积累的剂量依赖性抑制。用1 mM WEB-2086/Apafant处理5天的MELC显示≥85%的联苯胺阳性细胞，α和β珠蛋白基因表达增加，c-Myb下调。这种分化模式不涉及组蛋白H4乙酰化，并被佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯的作用所消除，这让人想起了六亚甲基双乙酰胺（HMBA）诱导的模式。除了MELC，人红白血病K562和HEL以及髓系HL60细胞也大量通过WEB-2086及其类似物WEB-2170进行成熟，但存在一些差异。这表明WEB-2086在结构上远离其他已知的诱导剂，可能是一类新型细胞分化剂的成员，在体外对广泛的转化细胞具有活性，并且由于其在体内的高耐受性，可用于抗癌治疗[2]。

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WEB-2086/Apafant可减少肺炎链球菌和NTHi与CSE处理的支气管上皮细胞的粘附[4]
在100 nM的浓度下，WEB-2086将肺炎链球菌与CSE处理的BEAS-2B细胞的粘附降至对照水平（P=0.0058）（图4A-C）。WEB-2086/Apafant在10μM浓度下，但在较低浓度下，NTHi参考菌株与CSE处理细胞的粘附也降低到对照水平（P<0.0001）（图4D）。浓度为1μM的WEB-2086将NTHi临床菌株与CSE处理的BEAS-2B细胞的粘附降低到对照水平（图4E）。WEB-2086在最高检测浓度下对上皮细胞无毒，即IC50>10μM。

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将WEB-2086/Apafant与PAFr的分子模型对接[4]
MODELLER和迭代线程组装优化产生的PAFr初始模型非常相似（295个Cα原子对上的均方根偏差为3Å），并预测同一组氨基酸将有助于配体结合位点。在MODELLER中，使用神经降压素受体1型（NTR1）和C-C趋化因子受体5（CCR5）作为模板结构，利用与每个模板的局部高序列/结构相似性区域，生成了PAFr的最终共识模型（图5A）。使用AutoDock-Vina软件包将天然PAF配体和WEB-2086/Apafant对接到模型上。在搜索整个分子表面时，PAF和WEB-2086始终停靠在PAFr模型预测的细胞外表面上的同一个深腔中（图5A）。该空腔比WEB-2086化合物大得多（图5B），对该口袋的精细对接搜索发现了许多潜在的对接姿势。

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在这项工作中，我们测试了PAFr拮抗剂抑制NTHi和肺炎链球菌与CSE预处理的气道上皮细胞结合的能力。WEB-2086/Apafant能有效显著降低两种呼吸道病原体与CSE暴露的支气管上皮细胞的粘附，并显示PAFr上调。有趣的是，在WEB-2086存在下观察到的细菌粘附与未通过CSE暴露诱导PAFr表达的培养上皮细胞观察到的对照水平相当。此外，发现细菌粘附水平与肺上皮细胞上PAFr表达水平成正比。就药物耐受性而言，PAF拮抗剂，包括WEB-2086，已被证明对动物和人类都是安全的，即使在几个月的高剂量下也是如此。同样，我们没有发现WEB-2086对BEAS-2B细胞有毒性。

这项研究存在许多局限性。我们使用了一种商业化的气道上皮细胞系，现在需要进一步研究使用原代人类细胞，特别是吸烟者的细胞对Apafant/WEB-2086的抗感染作用。其次，配体对接研究依赖于PAFr的计算机模型，该模型来源于相关GPCR的三级结构。需要X射线晶体学工作来确认特定的PAFr-WEB-2086相互作用。

总之，我们研究了WEB-2086/Apafant对两种主要呼吸道病原体NTHi和肺炎链球菌的抗粘附活性，这两种病原体在CSE引发的气道上皮上上调了PAFr的表达。我们证明了PAFr上调与细菌粘附之间的关联，在PAFr拮抗剂WEB-2086存在的情况下，细菌粘附降至对照水平。了解导致患有NTHi和肺炎球菌的COPD患者下呼吸道定植的事件，以及随后局部和全身炎症的增加，可能会转化为COPD的新管理策略。鉴于WEB-2086在人类受试者中的明显耐受性及其阻断肺炎链球菌和NTHi与呼吸上皮细胞粘附的能力，我们现在可以在COPD临床研究中对PAF拮抗剂进行探索性概念验证研究，以确定它们是否对日常症状和AE产生积极影响。我们还开始探索PAFr的三级结构，以设计对PAFr具有增强结合亲和力的WEB-2086的新化学衍生物。这开辟了一种新型非抗生素、抗感染药物用于COPD患者治疗干预的可能性，COPD患者容易频繁出现细菌性加重，而吸烟者更容易发生肺炎。

血小板活化因子（PAF）在过敏反应中起着重要作用。特别是，人们对PAF、嗜酸性粒细胞和过敏性疾病的慢性化有很多担忧。本研究的目的是阐明PAF在结膜嗜酸性粒细胞活化中的作用，并证实Apafant（一种强效PAF拮抗剂）滴眼液在慢性实验性过敏性结膜炎中的疗效。豚鼠积极免疫，反复滴注2.5%卵清蛋白诱发过敏性结膜炎。局部应用PAF溶液，通过测量泪液中的嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）活性来评估嗜酸性粒血球活化。在重复挑战性结膜炎中评估瘙痒发作和临床症状评分。从将PAF溶液滴注到处于慢性过敏性结膜炎状态的豚鼠眼睛中，观察到EPO活性显著增加，这种增加受到Apafant预处理的抑制。在重复挑战模型中，用Apafant滴眼液治疗的动物在第一次和第二次挑战中都表现出临床症状和瘙痒-抓挠反应的显著减轻。PAF具有诱导结膜组织嗜酸性粒细胞释放介质的活性，可能参与过敏性结膜炎的慢性期[1]。

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我们还发现，需要30 mg/kg WEB-2086/Apafant的最小剂量，这是最有效的市售PAF-R拮抗剂，才能提供与12.5 mg/kg酰基PAF相同的保护水平（表1，图2）。这些实验表明，低浓度的药理学活性较低的酰基PAF和文献（1，3，16）中描述的其他酰基PAF样脂质可能会抑制PAF-R信号传导。[3]

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在用酰基PAF或WEB-2086/Apafant[3]
预处理的瑞士白化小鼠中，PAF-R对烷基PAF诱导的致死性的再激活 鉴于我们观察到酰基PAF对PAF-R活化具有抑制作用，我们接下来通过评估不同时间点瑞士白化小鼠PAF-R的再激活来确定酰基PAF诱导的抑制作用的持续时间。简而言之，我们首先以12.5mg/kg的固定剂量给小鼠注射酰基PAF，这是根据我们之前的实验选择的（图2）。然后，我们在PAF-R初始抑制后3、5、7.5或10小时用致死剂量的烷基PAF（250µg/kg）对小鼠进行攻击。当用酰基PAF预处理时，3小时后用致死剂量的烷基PAF攻击后，所有小鼠均未死亡。然而，50%的小鼠在5或7.5小时后受到攻击时死亡，83%的小鼠在10小时后受到挑战时死亡（图3）。因此，当使用酰基PAF作为润湿剂时，PAF-R的完全润湿效果仅持续3小时。当WEB-2086/Apafant（30mg/kg）用作PAF-R润湿剂时，观察到了不同的情况。当用WEB-2086预处理并在5小时后用致死剂量的烷基PAF攻击时，没有一只小鼠死亡。WEB-2086预处理后10小时，只有17%的患者死亡。即使在WEB-2086预处理后30或45小时接受烷基PAF注射的组中，仍有33%的小鼠存活（图3）。

在DMSO中制备WEB-2086/Apafant和BN-52021的储备溶液（10 mM），用生理盐水稀释工作溶液（1 mM）并用于聚集研究。使用Zhou等人之前描述的方法从健康志愿者的血液中分离出富血小板血浆（PRP）。简而言之，将血液抽入柠檬酸盐管（1:9；柠檬酸盐血液），并在28°C下以45 g离心15分钟以获得PRP。通过在2200g下离心试管15分钟来沉淀剩余的细胞，并将获得的贫血小板血浆用于设置空白和稀释PRP。使用4×108个血小板/ml进行血小板聚集，最终体积为250μl，在37°C下以1200 rpm的速度搅拌6分钟。从10 mM储备（甲醇中）中提取的烷基PAF等分试样在氮气流下蒸发，并在含有0.1%HSA的PBS中复溶，得到1 mM工作溶液。使用该溶液，通过向PRP中加入烷基PAF（最终浓度为8µM）来引发聚集。使用相同的方案确定酰基PAF的聚集效应，但需要800µM的酰基PAF浓度来诱导与烷基PAF相似的效应。[3]

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为了确定PAF-R拮抗剂对酰基PAF或烷基PAF介导的血小板聚集的影响，PRP用WEB-2086/Apafant（10μM）或BN-52021（10μM）预处理5分钟，然后暴露于酰基PAF（800µM）或烷基PAP（8µM）。在所有聚集研究中，DMSO的最终浓度从未超过0.1%。通过用规定量的酰基PAF（5 nM至800μM）预处理或同时暴露血小板，然后用烷基PAF（8μM）刺激血小板，研究了酰基PAF对PAF-R的抑制作用。在一些聚集实验中，烷基PAF或酰基PAF首先在37°C下用不同浓度的rPAF AH（储备溶液：4µg/µl）简化30分钟，然后监测其诱导聚集的能力。在一些实验中，rPAF AH对酰基PAF或烷基PAF诱导的聚集的影响是通过同时用烷基PAF（8µM）或酰基PAF（800µM）和rPAF AH（50-200ng）处理PRP来确定的。所有检测均使用Chrono-log血小板聚集仪进行，数据使用AGROLINK软件记录[3]。

PAFr拮抗剂治疗[4]
在二甲亚砜（浓度≤1%）中制备1 mM Apafant/WEB-2086储备溶液，然后在培养基中稀释至终浓度为10μM、1μM、100 nM和10 nM。CSE处理后，将细胞暴露于PAFr拮抗剂1小时，然后用FITC标记的细菌攻击。

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免疫细胞化学[4]
暴露于FITC标记的细菌后，将细胞在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，并在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟，然后用冰冷的丙酮处理。用1%牛血清白蛋白、1%Triton-X-100的PBS溶液阻断/渗透细胞30分钟，并在4°C的黑暗中用1:100稀释的抗PAFr单克隆抗体在阻断缓冲液中孵育过夜。用PBS彻底冲洗后，加入AlexaFluor 594偶联的山羊抗小鼠二抗，在阻断缓冲溶液中稀释至1:500，然后在室温下孵育1小时。冲洗细胞，然后用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，在PBS中稀释1:5000，然后在室温下在黑暗中孵育15分钟。在用荧光安装介质安装载玻片之前，用PBS洗涤细胞三次。

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显微镜和图像分析[4]
使用奥林巴斯BX50荧光显微镜和CoolSnap Hq2 CCD相机分析显微照片。每个孔使用每个免疫荧光通道拍摄五张图像，在×400放大倍数下拍摄4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（真核细胞核；30ms暴露，405nm）、PAFr（PAFr表达；1~3秒暴露，594nm）和FITC（细菌；1~3秒暴露，488nm）信号的照片。NIH元件成像软件用于进行真核细胞和细菌细胞计数，而图像合并则使用Adobe Photoshop CS6软件完成。使用Image Pro Plus 7.0实现细胞追踪。

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BEAS-2B细胞活力测定[4]
细胞在无菌透明96孔平板中传代，PAFr拮抗剂稀释至细菌粘附试验中使用的浓度，并作为三份加入，孵育1小时。然后将Alamar Blue以10%（w/v）的终浓度添加到每个孔中，然后使用Spectromax分光光度计微孔板读数器在8小时内读取每小时的吸光度读数（585 nm），最后在24小时内读取。实验中使用了通过高压灭菌减少的100%（w/v）Alamar Blue阳性对照。细胞活力数据代表了三个生物重复，并根据制造商的指南表示为50%抑制（IC50）值。

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定量实时聚合酶链反应[4]
在用CSE（1%，4小时）刺激之前，将细胞接种到无菌透明平底24孔板中。使用Reliaprip™Mini-RNA细胞Miniprep系统制备RNA，用Nanodrop 1000定量总RNA。然后使用Promega互补DNA合成试剂盒收集互补DNA。使用Corbett Rotor Gene 6000系统通过定量聚合酶链式反应测定PAFr转录物的水平。如前所述进行热循环控制。25使用制造商提供的引物和推荐条件，将PAFr mRNA表达的相对变化归一化为三个参考基因（18S rRNA、β-actin和β2-微球蛋白）。数据来自两个独立的重复实验。

PAF滴眼液激活嗜酸性粒细胞[1]
将0.1%的PAF溶液局部滴入未接受过任何处理的豚鼠或已建立上述过敏性结膜炎模型的豚鼠的结膜囊内。滴入PAF 30分钟后，收集眼部冲洗液并测定冲洗液中的EPO活性。为了检验Apafant是否能阻断EPO释放到冲洗液中，在滴入PAF前15分钟和5分钟，分别双眼滴入Apafant眼用溶液（0.1%或1.0%）或赋形剂。

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Apafant/WEB-2086 对烷基-PAF 诱导的瑞士白化小鼠死亡的影响 [3]
将 Apafant/WEB-2086 配制成 DMSO 储备液（30 mg/ml），取等分试样用无菌 PBS 稀释至 0.5 ml。将瑞士白化小鼠分为五组，分别注射 WEB-2086（1、5、10、20 或 30 mg/kg），3 小时后注射致死剂量的烷基-PAF（250 μg/kg）。对照组小鼠仅注射 WEB-2086 配制过程中使用的溶剂。实验中 DMSO 的浓度均不超过 0.2%。

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用酰基-PAF或Apafant/WEB-2086预处理的瑞士白化小鼠中PAF-R的重新激活对烷基-PAF诱导致死的影响[3]
体重20-25克的瑞士白化小鼠被随机分为4组，每组6只。小鼠腹腔注射酰基-PAF（12.5 mg/kg），然后在首次注射酰基-PAF后3、5、7.5或10小时，以致死剂量的烷基-PAF（250 μg/kg）进行攻击。在平行实验中，7组小鼠在3、5、10、15、30和45小时等不同时间点注射Apafant/WEB-2086（30 mg/kg），随后注射致死剂量的烷基-PAF。对小鼠的存活情况进行了长达 6 天的监测。

65889 小鼠口服LD50 3克/千克 美国专利文件，专利号：4968794
65889 小鼠静脉注射LD50 400毫克/千克 美国专利文件，专利号：4968794

[1]. Apafant, a potent platelet-activating factor antagonist, blocks eosinophil activation and is effective in the chronic phase of experimental allergic conjunctivitis in guinea pigs. J Pharmacol Sci. 2004 Aug;95(4):435-42.

[2]. Specific PAF antagonist WEB-2086 induces terminal differentiation of murine and human leukemia cells. FASEB J. 2002 May;16(7):733-5.

[3]. Modulation of inflammatory platelet-activating factor (PAF) receptor by the acyl analogue of PAF. J Lipid Res. 2018 Nov;59(11):2063-2074.

[4]. An antagonist of the platelet-activating factor receptor inhibits adherence of both nontypeable Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae to cultured human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis . 2016 Jul 25:11:1647-55.

动物模型的建立和应用对于阐明过敏性结膜炎的病理生理机制以及开发有效疗法至关重要。目前已有多种过敏性结膜炎动物模型被报道。本研究采用豚鼠过敏性结膜炎模型，该模型通过反复抗原激发诱发过敏性结膜炎，具有以下优势：首先，该动物模型能够很好地模拟过敏患者的临床症状，如眼痒、眼红和眼水肿；其次，嗜酸性粒细胞和肥大细胞在反复抗原激发引起的症状中发挥作用，并且在泪液中检测到了嗜酸性粒细胞颗粒蛋白（如EPO），表明该模型与过敏性结膜炎患者的病理生理机制具有良好的相关性。Yasuda等人此前已报道过豚鼠反复抗原激发过敏性结膜炎模型的优势。总之，我们已证实 PAF 具有诱导结膜组织中嗜酸性粒细胞释放介质的活性，并可能参与过敏性结膜炎的慢性化和急性发作。我们还证实，Apafant 眼用溶液可抑制嗜酸性粒细胞活化，并在实验性过敏性结膜炎的慢性期有效。这些结果支持局部活性 PAF 拮抗剂在治疗过敏性结膜炎（尤其是在慢性期）方面的潜在临床应用价值。[1]

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血小板活化因子 (PAF) 是一种强效炎症介质，通过单一的 PAF 受体 (PAF-R) 发挥作用。生物合成烷基-PAF 的细胞也会产生大量效力较低的 PAF 类似物酰基-PAF，后者与 PAF-R 竞争结合位点。这两种 PAF 均由血浆型 PAF 乙酰水解酶 (PAF-AH) 降解。我们研究了共生成的酰基-PAF是否通过作为牺牲底物增强炎症刺激或作为抑制剂减弱PAF-R信号传导来保护烷基-PAF免受系统性降解。在离体实验中，两种PAF单独存在时均具有促血栓形成作用，但酰基-PAF可降低烷基-PAF诱导的表达经典PAF-R的人血小板的刺激作用。在瑞士白化小鼠中，烷基-PAF会导致猝死，但同时给予酰基-PAF可抑制这种作用。当PAF-AH水平逐渐升高时，酰基-PAF对烷基-PAF诱导死亡的保护作用逐渐减弱。我们得出结论，虽然酰基-PAF单独存在时具有轻微的促炎作用，但在病理生理条件下，大量的酰基-PAF会抑制烷基-PAF的作用。这些研究为酰基-PAF作为一种炎症设定点调节剂发挥先前未被认识的作用提供了证据，该调节剂能够调控PAF-R信号传导和水解。[3]

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基于此，我们设计了本研究，旨在探讨丰富的PAF结构类似物酰基-PAF对PAF-R激活的影响。我们发现，在生理条件下，酰基-PAF本身对小鼠无毒性，除非以超生理剂量给药（数据未显示）。有趣的是，我们发现10-50 mg/kg剂量的酰基-PAF能够保护小鼠免受烷基-PAF诱导的死亡（图2）。随后，我们将酰基-PAF的抑制作用与强效合成PAF-R拮抗剂WEB-2086的抑制作用进行了比较（图3）。我们发现，酰基-PAF在12.5 mg/kg剂量下即可表现出抑制作用，而WEB-2086则需要至少30 mg/kg的剂量才能达到相同的效果。这表明，酰基-PAF比研究较为深入的拮抗剂WEB-2086更能有效地拮抗PAF-R诱导的致死性（表1，图2）。接下来，我们试图确定酰基-PAF的保护作用持续时间，结果发现，小鼠在预先给予酰基-PAF 5小时后，保护作用消失，表明烷基-PAF可重新激活PAF-R（图3）。因此，酰基-PAF对烷基-PAF诱导的致死性的保护作用是暂时的，并且与WEB-2086提供的保护作用截然不同（图3）。酰基-PAF保护作用持续时间短的一种可能解释是其易受内源性PAF-AH降解，导致PAF-R重新激活，从而使后续注射烷基-PAF时再次发挥作用。另一方面，WEB-2086不含酯键，不是PAF-AH的底物，可能遵循不同的P-糖蛋白依赖性、较慢的分解代谢途径。我们观察到，在我们的实验条件下，重复注射酰基-PAF并不能预防烷基-PAF诱导的动物死亡，这表明酰基-PAF的持续存在可能并非PAF-R的天然拮抗剂（数据未显示）。[3]

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背景[4]
慢性阻塞性肺疾病（COPD）正逐渐成为继心脏病和中风之后全球第三大人类死亡原因。吸烟是COPD的主要危险因素，它会导致肺上皮细胞中血小板激活因子受体（PAFr）表达增加。非典型流感嗜血杆菌 (NTHi) 和肺炎链球菌可黏附于人呼吸道上皮细胞腔面的 PAFr。
目的 [4]
探讨 PAFr 作为预防 COPD 患者急性加重主要致病菌——NTHi 和肺炎链球菌感染的潜在药物靶点。
方法 [4]
将人支气管上皮细胞 BEAS-2B 暴露于香烟烟雾提取物 (CSE) 中。采用免疫细胞化学和定量聚合酶链式反应 (qPCR) 检测 PAFr 的表达水平。用异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的 NTHi 或肺炎链球菌感染上皮细胞，并采用免疫荧光法检测细菌黏附情况。随后评估了PAFr拮抗剂Apafant/WEB-2086对细菌病原体与BEAS-2B细胞结合的影响。对PAFr的三级结构以及PAF及其拮抗剂WEB-2086的结合口袋进行了计算机模拟研究。
结果[4]
CSE上调了支气管上皮细胞中PAFr的表达，并与细菌黏附的增加显著相关。Apafant/WEB-2086将NTHi和肺炎链球菌的上皮黏附降低至未暴露于CSE的细胞水平。此外，它对支气管上皮细胞无毒性。计算机模拟分析在预测的 PAFr 结构中发现了 PAF/WEB-2086 的结合口袋。
结论 [4]
WEB-2086Apafant/ 代表了一类创新的候选药物，用于抑制由吸烟相关 COPD 的主要细菌驱动因素引起的 PAFr 依赖性肺部感染。

C22H22CLN5O2S

455.961

455.118

C, 57.95; H, 4.86; Cl, 7.77; N, 15.36; O, 7.02; S, 7.03

105219-56-5

65889

White to yellow solid powder

1.5±0.1 g/cm3

720.2±70.0 °C at 760 mmHg

186-188ºC

389.4±35.7 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.734

1.32

100.85

0

6

4

31

691

0

CC1=NN=C2N1C3=C(C=C(S3)CCC(=O)N4CCOCC4)C(=NC2)C5=CC=CC=C5Cl

JGPJQFOROWSRRS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H22ClN5O2S/c1-14-25-26-19-13-24-21(16-4-2-3-5-18(16)23)17-12-15(31-22(17)28(14)19)6-7-20(29)27-8-10-30-11-9-27/h2-5,12H,6-11,13H2,1H3

3-[7-(2-chlorophenyl)-13-methyl-3-thia-1,8,11,12-tetrazatricyclo[8.3.0.02,6]trideca-2(6),4,7,10,12-pentaen-4-yl]-1-morpholin-4-ylpropan-1-one

DE-081; WEB2086; Apafant; 105219-56-5; triazolodiazepine; Apafanto; Apafantum; WEB2086; WEB-2086

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~40 mg/mL (~87.73 mM)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。